В настоящее время существуют различные системы оценки качества гамет и эмбрионов в условиях in vitro. При этом основная роль принадлежит морфологической оценке на эмбриологическом этапе программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО и ПЭ) [1].

Процессы раннего эмбрионального развития, по данным литературы, рассматриваются с позиции перехода от ооцита к эмбриону (oocyte-to-embryo transition), что обусловливает необходимость качественного отбора ооцитов на преконцепционном этапе с целью получения эмбрионов, имеющих высокий шанс к имплантации [2].

Цель настоящего обзора — продемонстрировать структурно-функциональные последовательно изменяющиеся морфологические особенности ооцитов, эмбрионов, полученных в результате оплодотворения, и обосновать необходимость проведения динамического наблюдения в программе ЭКО.

Важным аспектом программы ЭКО является получение зрелых ооцитов, находящихся на стадии мейоза II (МII), способных к оплодотворению in vitro [3, 4]. Существуют различные классификации, описывающие структурные особенности женских гамет. По данным отечественных источников [5], существует ограниченное количество работ, посвященных данной теме, при этом отсутствуют указания на взаимосвязь тех или иных критериев качества с основными показателями результативности ЭКО. Относительно недавно в клиническую практику стала внедряться система оценки ооцитов на стадии MII — MOMS (MII oocyte morphological score), которая продемонстрировала значимую взаимосвязь уровня баллов по шкале MOMS и наступления беременности [6].

Наиболее точную оценку ооцита возможно произвести после денудации ооцита из ооцит-кумулюсного комплекса в программе интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) [6—8].

В циклах стимуляции суперовуляции встречаются ооциты с различными повреждениями [9]. Аномалии ооцита можно условно разделить на экстрацитоплазматические и цитоплазматические. К экстрацитоплазматическим относятся нарушение формы и организации прозрачной оболочки ооцита, дебрис в перивителлиновом пространстве, аномалии первого полярного тельца (расположение, увеличение в размере, фрагментация, дегенерация), а также нарушение симметрии цитоплазматической мембраны ооцита. К цитоплазматическим аномалиям, определяемым на световом уровне, относят зернистость цитоплазмы, агрегаты гладкого эндоплазматического ретикулума, рефрактерные тела, вакуоли, нарушение вязкости цитоплазмы [6—9]. При помощи поляризационной микроскопии возможна визуализация веретена деления [10]. Для качественного ооцита веретено деления ооцита стадии МII не должно быть в позиции перед первым полярным тельцем, при этом изменение температуры в пределах 1 °C может значительно изменить структуру веретена деления. У некоторых ооцитов, имеющих первое полярное тельце, может не быть видимого в поляризационном микроскопе веретена деления. Поляризационная микроскопия дает возможность оценки веретена деления и позволяет прогнозировать течение процесса оплодотворения и последующего дробления развившегося в результате оплодотворения эмбриона [11, 12].

Качество ооцита является важным прогностическим фактором, так как ядерная и цитоплазматическая зрелость клетки напрямую связана с эффективностью цикла ИКСИ [8, 13]. Основными причинами выявляемых изменений являются анеуплоидии ооцитов и гипоксия. Предполагают, что интрафолликулярная гипоксия ведет к снижению рН в течение мейоза, что отражается на формировании веретена деления, приводит к повышению частоты анеуплоидий [14].

В ранних исследованиях плоидности зрелых ооцитов стадии МII показано, что частота анеуплоидий составляет более 50% [10]. Анеуплоидии в ооците происходят вследствие нерасхождения хромосом, задержки анафазы, преждевременного движения центриолей в течение преовуляторного мейоза [15]. Вследствие хромосомных дефектов происходят специфические нарушения на клеточном уровне в виде цитоплазматического дисморфизма, описанного для ооцитов [10]. Значительное кластирование органелл коррелирует с высокой степенью анеуплоидии, другие аномалии связаны с нарушением сегрегации эндоплазматического ретикулума и митохондрий [16—18].

В качестве основной причины самопроизвольного прерывания беременности ранних сроков отмечают нарушение морфологии ооцита [10, 19]. При повторных неудачах программ ЭКО и ПЭ явление клеточного дисморфизма — аномалий устройства цитоплазмы, может быть причиной идиопатического бесплодия, в основе которого лежит хроническая анеуплоидия [20]. Присутствие в ооците генетических дефектов на хромосомном и геномном уровне в некоторых случаях может не оказывать влияние на фенотип эмбриона, который по морфологическим характеристикам может не уступать остальным нормальным эмбрионам на 2—3-и сутки дробления [14]. Сочетание световой и поляризационной микроскопии позволяет оценивать специфические морфологические характеристики полученных ооцитов [5, 8].

По данным последнего систематического обзора L. Rienzi и соавт. [6], анализ 50 публикаций за последние 15 лет продемонстрировал необходимость пристального внимания эмбриолога к комплексу наиболее значимых критериев качества ооцита — оценка ооцит-кумулюсного комплекса, прозрачной оболочки, перивителлинового пространства, морфологии первого полярного тельца, формы ооцита, структуры цитоплазмы, веретена деления. Рассматриваемые по отдельности, эти параметры имеют низкую диагностическую эффективность.

В настоящее время в клинической практике проводится оценка качества эмбрионов по морфологическим характеристикам на основании системы динамического наблюдения (sequential embryo selection, SES) [22, 23, 26—28].

Представляет интерес морфологическая оценка качества эмбрионов на основании кумулятивного эмбрионального счета (cumulative embryo score, CES), разработанного C. Steer и соавт. в 1992 г. и модифицированного в 2007 г. группой ученых под руководством J. Holte путем добавления к CES интегративного морфологического описания дробящихся эмбрионов [23, 27]. Данная классификация оценивает совокупность скорости дробления эмбрионов, симметричности бластомеров, степени цитоплазматической фрагментации, мультинуклеарности бластомеров и присваивает эмбриону баллы по каждому критерию. По данным L. Rienzi и соавт. [29], система MOMS имеет преимущества перед CES по частоте наступления беременности и родов.

Для оценки эмбриона 1-х суток дробления используются методики определения структуры «halo», морфологии пронуклеусов, предшественников ядрышек (nucleolar precursor bodies, NPB) [30, 31].

Исследования внутрицитоплазматического движения показали появление полупрозрачной зоны у перикортикальной мембраны («halo» — сияние). Этот динамический процесс, описанный как волнообразная активность, или цитоплазматическое волнение, происходящее в течение перисингамической стадии, свидетельствует о полноценности эмбриона на стадии зиготы [24].

Мужской и женский пронуклеусы появляются по периферии ооцита и вращаются относительно центра 16—18 ч после оплодотворения. Пронуклеусы должны иметь одинаковый размер. При различии в размерах пронуклеусов высока вероятность анеуплоидии [31]. Для NPB предложена методика оценки следующих параметров: числа, позиции, расположения, размера. Равное расположение относительно оси перекрытия пронуклеусов, оптимальное число (5—7), размер NPB коррелируют с возможностью развития эмбриона до стадии бластоцисты [15, 30, 32].

В течение периода развития ооцита, со стадии примордиального до MII, нуклеоли активно синтезируют протеины и распределяют их по определенным зонам ядра до включения собственного генома эмбриона. Нуклеоли являются центрами продукции мРНК [4]. Ростовые факторы и регуляторные белки также продуцируются в нуклеолях. Эти участки ядра являются нуклеолярными организационными регионами (nucleolar organization regions, NOR) ядра. Гетерохроматин пяти хромосом 13, 14, 15, 21, 22 сцеплен с NOR. Именно с этими хромосомами связана наибольшая частота анеуплоидий, что подчеркивает важность строгой компартментализации ядра, определяющей качество ооцита и эмбриона [32, 33]. Нуклеоли состоят из трех функциональных компонент:

— плотного фибриллярного комплекса DFC (dense fibrillic complex), который важен для процесса транскрипции;

— фибриллярного комплекса FC (fibrillic component), который участвует в инактивации транскрипционных факторов;

— гранулярно-цитоплазматического комплекса GC (granular-cytoplasmatic component) [4].

Визуализация данных структур свидетельствует о функционировании NPB (так как они и являются собственно FC регионами) и указывает на присутствие гетерохроматина хромосом 13, 14, 15, 21, 22 в веретене деления. NPB появляются, когда хроматин конденсируется в митотическое веретено, что происходит к моменту пенетрации сперматозоида. Появление одного пронуклеуса может означать быструю или, наоборот, отложенную конденсацию хроматина в ядре, что связано с аномалиями развития, а именно анеуплоидиями [5, 10, 25, 29, 31, 34].

Работами многих авторов [29, 31] показано, что именно 1-е сутки дробления определяют качество эмбриона. Оптимальным является время вступления в первое митотическое деление через 23—24 ч после инсеминации ооцитов, однако оно может варьировать в сторону увеличения до 4 ч, что не является плохим прогностическим признаком [29]. После проникновения сперматозоида формируются пронуклеусы, оплодотворение завершается первым митотическим делением и формированием двухклеточного эмбриона.

Расположение веретена деления влияет на дальнейшее дробление. Если веретено поляризовано, то это может приводить к формированию эмбриона с неравными по размеру бластомерами. Аномальный цитокинез может приводить к патологической бластуляции, выражающейся в различиях размеров клеток во внутренней клеточной массе (inner cell mass, ICM) более чем на 30%, дефектам дальнейшего развития [10, 22, 35, 36]. На четырехклеточной стадии один из четырех бластомеров продолжает свое развитие в клетки, продуцирующие хорионический гонадотропин (ХГ), что является сигналом для эндометрия и подготовки к имплантации [10]. Достижение эмбрионом стадии четырех бластомеров происходит через короткую трехклеточную стадию. Длительная задержка на стадии трех, четырех бластомеров является неблагоприятным прогностическим признаком [23]. Важным для развития эмбриона является наличие ядра в каждом бластомере. Отсутствие ядра может свидетельствовать о том, что бластомер находится в переходной стадии. Через 42—44 ч после оплодотворения все бластомеры должны иметь ядра. Фрагментация ядер бластомеров коррелирует с низким качеством эмбриона и неблагоприятным исходом ЭКО и ПЭ [22, 30, 31]. Увеличение количества ядер происходит при аномальном кариокинезе или вследствие аномальной сегрегации хромосом, более 70% мультинуклеарных эмбрионов являются анеуплоидными [30].

По достижении четырехклеточной стадии бластомеры уменьшаются в 2 раза и до стадии восьми бластомеров не увеличиваются в размерах. Оценка эмбриона происходит на 3-и сутки дробления (64—66 ч после инсеминации ооцитов) в течение перехода от шести к восьми бластомерам, что может происходить очень быстро. На этой стадии исследуют число бластомеров (в норме 6—8), фрагментацию (в норме отсутствует или менее 10%), размер и соотношение бластомеров, количество ядер в бластомерах [29, 37].

Для 4-х суток дробления (66—112 ч после инсеминации ооцитов) характерной чертой эмбрионов является компактизация бластомеров и формирование морулы. Работами многих авторов показано, что ранняя компактизация и достижение стадии морулы в конце 3-х суток дробления, а также раннее начало процесса кавитации (формирования полостей между клетками морулы) являются благоприятными прогностическими признаками в отношении хорошего качества эмбриона [38].

На 5-е сутки дробления (113—116 ч после инсеминации ооцитов) происходит формирование бластоцисты. Работами многих авторов показана связь морфологии бластоцисты с исходом программ ВРТ [30, 32]. Эмбрион, развивающийся аномально в 1—3-и сутки дробления, может формировать нормальную по морфологии бластоцисту [39]. Признаками бластоцисты хорошего качества являются неповрежденные клетки, отсутствие гранулярных включений, хороший контакт между клетками, четкие контуры у 80% клеток, оптимальное соотношение бластоцели и клеточной массы. Наиболее используемой в настоящее время является классификация бластоцист по D. Gardner и W. Schoolcraft [40].

Морфологические критерии для ооцитов и эмбрионов постоянно дополняются и совершенствуются. Несмотря на это, по мнению J. Gerris и соавт. [10], эмбрионы с анеуплоидиями in vitro имеют характеристики, сходные с эуплоидными.

Наряду с морфологической оценкой в клиническую практику внедряются новые технологии, направленные на улучшение селекции эмбриона. Среди них можно выделить инвазивные и неинвазивные методы. К инвазивным относится преимплантационная генетическая диагностика, осуществляемая с использованием методов флюоресцентной гибридизации in situ (FISH), полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), анализа микроокружения, сравнительной геномной гибридизации. Объектами исследования при применении данных методов являются: полярное тельце ооцита, бластомер или клетки трофэктодермы эмбриона, ядро сперматозоида. Данные методы доказали свою эффективность и нашли применение в практике у пациенток старшего репродуктивного возраста при неоднократных неэффективных попытках ЭКО. Вместе с тем продолжают развиваться неинвазивные методы, позволяющие выбрать для переноса эмбрионы, имеющие высокий имплантационный потенциал. В настоящее время в работу многих центров репродуктивной медицины начинают внедряться системы непрерывного автоматического наблюдения за эмбрионами, которые, оценивая параметры цитокинеза, митоза, позволяют на основе многофакторного анализа выбрать наиболее перспективный эмбрион с точки зрения дальнейшего развития. Применяются технологии «-омик»: геномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика. По мнению E. Forman и соавт. [41], полный геномный скрининг при селективном переносе эмбриона улучшит результаты ВРТ и снизит частоту невынашивания беременности.

Таким образом, анализ данных литературы показал, что морфологическая оценка играет основную роль в определении качества ооцитов и эмбрионов в процессе динамического наблюдения in vitro. Несмотря на это, субъективная оценка должна дополняться данными, характеризующими гаметы и эмбрион с морфофункциональной позиции. Внедрение технологий непрерывного наблюдения за эмбрионами, в основе работы которых лежит система фиксации структурных изменений эмбрионов во времени, позволит автоматизировать процесс отбора эмбрионов и дополнит классическую морфологическую оценку. Применение современных методов позволяет комплексно подходить к выбору эмбриона с высоким потенциалом к имплантации в программе ЭКО и ПЭ, принимая во внимание исходный статус гамет и клинико-анамнестические данные супружеских пар с бесплодием.

Авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов.