Все большее распространение получает лечение бесплодия с использованием метода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО/ИКСИ). Однако не всегда попытки экстракорпорального оплодотворения являются успешными. Так, по результатам собственных исследований, формирование бесплодия трубного происхождения обусловлено множеством факторов ангиогенно-воспалительного стресса (АВС): инфекционными агентами, оперативными вмешательствами на органах малого таза, а также сопутствующей гинекологической патологией (наружный генитальный эндометриоз, миома матки). Факторы АВС оказывают непосредственное влияние на репродуктивную функцию, препятствуя наступлению беременности. В ходе выполнения исследования при проведении программы ЭКО эффективность программы составила 41%. Несмотря на выделение факторов, формирующих бесплодие трубного происхождения, и исключение их влияния, эффективность программы ЭКО не повысилась [16].

Наступление беременности при проведении ЭКО определяется как качеством полученных эмбрионов, так и функциональным состоянием эндометрия [14]. Высокотехнологичные исследования с использованием «омикс» («оmics»), включающие: геномикс (genomics), эпигеномикс (epigenomics), транскриптомикс (transcriptomics), протеомикс (proteomics) и метаболомикс (metabolomics), широко применяются при изучении ткани эндометрия человека. Наиболее активная работа наблюдается в области транскриптомикс в норме и при патологии, но в связи с улучшением технологий в области проте­омикс эти результаты становятся все более обнадеживающими. «Омикс» технологии, несомненно, продвинули наши знания при изучении состояния рецептивности эндометрия. Однако возникающие проблемы в связи с накоплением обширных данных и постоянное изменение «омикс» создают трудности в интерпретации таких знаний. Все это требует как постоянного контроля, так и проведения пилотных клинических исследований для проверки приемлемости полученных данных [18].

Среди многочисленных функций эндометрия человека выделяют: способность запускать процесс собственного отторжения при ненаступлении беременности, защита против внедрения патогенов и имплантация эмбриона. Маркерами эндометриальной функции и готовности эндометрия к имплантации являются адгезионные молекулы, роль которых в регуляции имплантации стала интенсивно изучаться в последние годы. К молекулам адгезии относятся четыре семейства белков: интегрины, селектины, кадгерины, муцины [17].

Селектины относятся к семейству гликопротеинов, которое включает: L-селектин, P-селектин и Е-селектин. Так, L-селектин экспрессируется лимфоцитами и участвует в процессах миграции, P-селектин - на активированных тромбоцитах, E-селектин экспрессируется на поверхности эндометрия при воспалении. L-селектины взаимодействуют с углеводородными лигандами в эндотелии, которые позволяют «катиться» лейкоцитам по воспаленному сосудистому эндотелию перед их последующей адгезией на стенке сосудов и миграцией через нее. Параллель может быть проведена между феноменом «скатывания» (rolling cell adhesion) лейкоцитов и нидацией эмбриона в эндометрий [17].

В 2009-2010 гг. В.А. Бурлевым и соавт. [5, 6] был опубликован анализ данных литературы о состоянии молекулярного эмбрионального окна и функциональной активности эндометрия в зависимости от результатов ЭКО и ПЭ. Систематизация научных данных позволила показать, что в системе адгезионных молекул именно L-селектин, локализованный на поверхности бластоцисты, и его олигосахаридный лиганд, тесно связанный с поверхностным эпителием эндометрия, являются одними из ведущих звеньев эмбрионально-эндометриального взаимодействия, обеспечивая удержание и нидацию эмбриона в эндометрий.

В 2013 г. нами представлены результаты о том, что процент имплантаций и наступления беременности в программах ЭКО/ИКСИ выше у пациенток с низким уровнем L-селектина в сыворотке крови (<1710 нг/мл) и в эндометрии (поверхностный эпителий, железы и строма) и высокой экспрессией MECA-79 в эндометрии (поверхностный эпителий и железы). При ненаступлении беременности в программах ЭКО/ИКСИ наблюдается высокий уровень L-селектина в сыворотке крови (>1710 нг/мл) и в эндометрии (поверхностный эпителий, железы и строма) и низкая экспрессия MECA-79 в поверхностном эпителии и в железах [4].

Все эти данные свидетельствуют о том, что уровень L-селектина в крови является важным прогностическим тестом оценки рецептивности эндометрия и требуются дополнительные клинические наблюдения.

Цель исследования - установить клиническое значение содержания L-селектина в крови при оценке эффективности программы ЭКО/ИКСИ у больных с трубным фактором бесплодия.

Под наблюдением находились 120 женщин репродуктивного возраста (от 20 до 37 лет) с бесплодием трубного происхождения в соответствии с МКБ-10. Из них методом подбора пар были выделены две группы, отличающиеся по уровню L-селектина в сыворотке крови (см. схему): у 14 был установлен низкий уровень (<1710 нг/мл) L-селектина (1-я группа) и у 14 высокий (>1710 нг/мл) уровень в сыворотке крови (2-я группа) (р<0,001).

Критериями включения пациенток в исследование являлись: первичное и вторичное бесплодие трубного происхождения, верифицированное лапароскопически и/или данными гистероскопии; регулярный менструальный цикл (28-32 дня); нормативное содержание ЛГ, ФСГ, пролактина, эстрадиола (Е2), прогестерона, тестостерона в сыворотке крови.

Критериями исключения из исследования являлось бесплодие другого происхождения.

Дизайн исследования: пилотное проспективное одномоментное исследование, рандомизированное стратифицированное, одобренное этическим комитетом ФГБУ «НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России (см. схему). Информированное согласие на участие в исследовании и использование крови было получено у всех пациенток. Клинико-лабораторное обследование пациенток проведено в соответствии с приказом МЗ РФ №67 от 26.02.03 «О применении ВРТ в терапии женского и мужского бесплодия». Оплодотворение ооцитов осуществлялось в стандартных условиях методами ЭКО/ИКСИ.

Прегравидарная подготовка эндометрия проводилась всем пациенткам перед программой ЭКО, которая включала воздействие лечебных физических факторов и циклическую гормональную подготовку в течение одного менструального цикла. Циклическая гормональная подготовка проводилась с использованием трансдермального эстрадиола с 5-го по 25-й день и микронизированного прогестерона с 16-го по 25-й день менструального цикла. Электроимпульсную терапию начинали на 5-7-й день менструального цикла ежедневно по 20 мин 1 раз в день по методике, разработанной в гинекологическом отделении восстановительного лечения ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Локализация воздействия: пластинчатый электрод в надлобковой области, излучатель внутриполостной в заднем своде влагалища. Курс составил 10 процедур.

Стимуляция овуляции. Всем женщинам проводили стимуляцию суперовуляции по короткому протоколу со 2-3-го дня следующего менструального цикла препаратом рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (рФСГ) (гонал-Ф, фирма «Merck Serono», Швейцария) в дозе 150-300 МЕ. Введение антагониста гонадотропин-рилизинг-гормона (ант-ГнРГ) (цетротид, фирма «Merck Serono», Швейцария) в дозе 0,25 мг осуществлялось при достижении лидирующим фолликулом диаметра 16 мм. Доза хорионического гонадотропина (ХГ) (прегнил, фирма «Organon», Нидерланды) подбиралась индивидуально, в зависимости от количества, размера фолликулов. Через 35-36 ч после инъекции ХГ проводили трансвагинальную пункцию яичников (ТВП) с целью аспирации преовуляторных ооцитов. Поддержка второй фазы осуществлялась вагинальным введением препаратов прогестерона (утрожестан, фирма «Laboratories Besins International», Франция) в дозе 600 мг со дня ТВП.

Спермограмма. Сперму оценивали в соответствии с нормами ВОЗ (2001): норма объема >2,0 мл, концентрация >20 млн в 1 мл, количество активно подвижных форм >25%, морфология >30% нормальных форм, количество лейкоцитов <1 млн в 1 мл.

Оплодотворение и культивирование эмбрионов. Полученные ооциты помещали в среду, содержащую HEPES-буфер, а затем отмывали в культуральной среде. Сразу после помещения ооцитов в среду для культивирования оценивали количество, качество и степень зрелости полученных комплексов ооцит-cumulus. Оплодотворение ооцитов осуществляли в стандартных условиях методами ЭКО либо ИКСИ. Оценку оплодотворения проводили по наличию мужского и женского пронуклеуса в ооците. Культивирование эмбрионов и оценка их качества, все манипуляции с половыми клетками и эмбрионами человека проводили на средах фирмы COOK (Австралия).

Перенос эмбрионов в полость матки. Перенос эмбрионов осуществляли на 3-и, 5-е сутки культивирования и в два этапа. Выбор дня переноса определялся общим состоянием пациентки (отсутствие синдрома гиперстимуляции яичников средней и тяжелой степени) и эмбриологическими характеристиками (количеством эмбрионов на 3-и сутки культивирования). Эмбрионы переносили в полость матки под контролем трансабдоминального ультразвука с помощью мягкого катетера Wallace.

Иммуноферментный анализ. Анализ содержания L-селектина (L-Sel, нг/мл) в сыворотке крови в период «окна имплантации» проводился с помощью иммуноферментного анализа и применением стандартных наборов («R&D systems», США).

Диагностика беременности. Биохимический тест на беременность (β-чХГ) проводили на 14-16-й день, а ультразвуковую диагностику беременности на 21-й день после переноса эмбрионов. Ультразвуковое определение сердцебиения плода осуществлялось при сроке беременности 4-5 нед.

Статистический анализ. Для анализа результатов использовали статистические компьютерные программы IBM SPSS Statistics 20. Результаты исследования представлены как средние±стандартное отклонение (М±SD). В зависимости от конкретных условий применялись: ANOVA, критерий Вилкоксона, U-критерий Манна-Уитни, критерий &khgr;². Различия между группами считались достоверными при p<0,05.

Общая характеристика пациенток. Все пациентки (n=24, см. схему) были разделены на две группы в зависимости от уровня L-селектина в сыворотке крови: 1-я группа - пациентки с низким (<1710 нг/мл) уровнем L-селектина (n=14); 2-я группа - пациентки с высоким (>1710 нг/мл) уровнем L-селектина (n=14). Группы были разделены на подгруппы: без лечения (n=7) и с лечением (n=7).

Средний возраст пациенток статистически значимо не различался и составил в 1-й и 2-й группах 30,7±2,9 и 31,6±3,1 года соответственно. Все женщины имели правильное телосложение, средние ростомассовые показатели в подгруппах были статистически однородны. Средняя продолжительность цикла в подгруппах составила 29,3±2,1 и 30,7±3,8 дня соответственно. Первичное и вторичное бесплодие в 1-й группе выявлено у 7 (50%) и 12 (46,1%) пациенток, во 2-й группе - у 8 (57,1%) и 11 (42,3%). Средняя длительность бесплодия в группах составила 7,2±3,5 и 6,7±0,6 года соответственно, количество с одной неудачной попыткой ЭКО - 64,3 и 54% соответственно.

Инфекционное обследование пациенток выявило высокую частоту инфицированности возбудителями, входящими в TORCH-комплекс. Наиболее распространена инфицированность цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекцией - у 8 (57,1%) и 17 (65,4%) пациенток соответственно. Вирус простого герпеса (ВПГ) обнаружен у 5 (35,7%) и 11 (42,3%) пациенток соответственно.

Содержание L-селектина до и после проведения прегравидарного воздействия на эндометрий. Пациенткам 1-й и 2-й групп была проведена прегравидарная подготовка эндометрия с помощью методики низкочастотной импульсной магнитотерапии и гормональной подготовки. Учитывая, что клиническая эффективность этой терапии уже доказана [15]. С учетом этого было проведено определение уровня L-селектина в крови до и после терапии. Исследования в биоптатах эндометрия после лечения не проводили по этическим соображениям.

Определение уровня L-селектина в крови до и после терапии в группах показало, что в 1-й группе статистически значимых изменений уровня L-селектина в крови не установлено. Измеренные значения были индивидуальны и вариабельны, но ниже 1710 нг/мл, как и до лечения. Во 2-й группе при уровне L-селектина более 1710 нг/мл у женщин с наступившей беременностью значения L-селектина статистически значимо снижались после лечения, у женщин с ненаступившей беременностью уровень L-селектина не изменился и был более 1710 нг/мл, как и до лечения.

Роль L-селектина в оценке клинической эффективности программы ЭКО/ИКСИ. Анализ эффективности программы ЭКО/ИКСИ у пациенток 1-й и 2-й групп показал, что частота клинического наступления беременности была статистически значимо выше (57,1%) у пациенток 1-й группы с низким уровнем L-селектина в крови и проведенным лечением по сравнению с больными 2-й группы без лечения (14,3%). Отсутствуют статистически значимые различия в наступлении беременности у больных 1-й группы с лечением (57,1%) и без лечения (42,9%). Обращает на себя внимание совпадение частоты наступления беременности в 1-й группе без лечения (42,9%) и во 2-й группе с лечением (42,9%). Имеются статистически значимые различия в частоте наступления беременности у больных 2-й группы с лечением (42,9%) и без лечения (14,3%). Следовательно, у больных 1-й группы лечение не влияет на результативность ЭКО, в то время как во 2-й группе лечение приводит к повышению эффективности ЭКО. Уровень L-селектина является своеобразным триггером, который в совокупности с другими факторами рецептивности эндометрия оказывает влияние на наступление беременности.

Оценка эффективности программы ЭКО проводилась с использованием показателя имплантации (отношение количества обнаруженных плодных яиц к количеству перенесенных эмбрионов). Расчет показателя имплантации показал отсутствие статистически значимых различий в группе с низким уровнем L-селектина в крови у пациенток с лечением и без лечения (40,0 и 33,3), но наличие статистически значимых различий по отношению ко 2-й группе без лечения (7,1). Показатель имплантации не имел статистически значимых различий у больных 1-й группы без лечения и больных 2-й группы с лечением. Эти данные полностью соответствуют результатам эффективности программы ЭКО.

Оценка показателей эмбриологического этапа показала, что среднее количество ооцитов MII, полученных в ходе трансвагинальной пункции, в подгруппах статистически значимо не различалось (6,7±2,5 и 6,4±2,6, 6,6±2,5 и 6,8±2,8 соответственно). Среднее количество эмбрионов 3-х и 5-х суток культивирования составило: в 1-й группе с лечением - 4,4±2,5 и 1,3±1,2 и без лечения - 4,6±2,1 и 1,6±1,4, во 2-й группе с лечением - 4,6±2,7 и 1,6±1,4, без лечения - 4,5±2,3 и 1,4±1,3 (p>0,05). Среднее количество перенесенных эмбрионов также статистически значимо не различалось между группами.

Взаимодействие трофобласта с эндометрием - первый и необходимый этап нидации и впоследствии - плацентации. На уровне материнско-эмбриональных взаимодействий показана активация систем селектинов и участие их в процессе адгезии, также как и захват лейкоцитов из кровотока.

L-селектин лиганд. Инициирующая роль L-селек­тина в адгезии эмбриона к эндометрию доказана. L-селектин экспрессируется трофобластом, а олигосахаридный лиганд в эндометрии [5, 6, 21]. Повышенная экспрессия селектин-лиганда в начале и середине секреторной фазы подтверждает его участие в имплантации [23].

Показано, что L-селектин не только имеет значение для нидации и плацентации, но и обладает функциональной активностью для кровеносных сосудов. Медиаторная функция L-селектина в сосудах является важным компонентом этого процесса для получения требуемой оптимальной адгезии [26]. Большинство идентифицированных маркеров имплантации регулируется путем прямого или опосредованного влияния эстрадиола и прогестерона [13, 24].

Селектин-адгезионная система устанавливает материнско-фетальное взаимодействие. Со стороны бластоцисты наблюдается сильная экспрессия L-селектина, а со стороны эндометрия - экспрессия олигосахаридных лигандов L-селектина, таких как MECA-79 и HECA-452, которые участвуют в регуляции «окна имплантации». Экспрессия лиганда селектина MECA-79, локализованного в поверхностном и железистом эндометриальном эпителии, в течение менструального цикла значительно повышена в середину секреторной фазы. Кроме того, его иммунореактивность проявляется наиболее сильно в поверхностном эпителии в сравнении с железистым эпителием [20].

Лиганд L-селектина способствует имплантации эмбриона в эндометрий, а его уровень значительно повышается у женщин с наступившей беременностью. Процент клинических беременностей и имплантаций значительно выше у пациенток с высоким уровнем лиганда L-селектина в эндометрии по сравнению с пациентками с низким уровнем [19].

Исследования показывают, что недостаток экспрессии лиганда L-селектина в эндометрии может понижать шанс успешной имплантации, хотя у некоторых женщин беременность наступает и при низком уровне экспрессии. Это объясняется тем, что экспрессия лиганда L-селектина может увеличиваться в присутствии эмбриона [22].

По нашим данным [4], частота имплантации и наступления беременности выше у пациенток с низким уровнем L-селектина в сыворотке крови и эндометрии по сравнению с пациентками с высоким уровнем L-селектина в крови и в эндометрии.

Коррекция трофической функции эндометрия. Васкуляризация эндометрия динамично изменяется в течение короткого времени - менструального цикла; при этом сосудистая сеть эндометрия подвержена структурным и функциональным изменениям. В первую фазу цикла происходит интенсивный рост сосудов эндометрия и подготовка к имплантации эмбриона. Если имплантация не происходит, сосудистая сеть эндометрия подвергается регрессу. Функциональный слой эндометрия и архитектура его кровоснабжения постоянно изменяются в ответ на воздействие половых стероидов в зависимости от фазы менструального цикла. Роль маточной гемодинамики и адекватная васкуляризация матки и эндометрия являются основными предпосылками для реализации нормальной функции эндометрия [12].

Одной из ведущих причин неудавшейся имплантации при проведении ЭКО/ИКСИ является истончение эндометрия. В последние годы в зарубежных источниках введено понятие «тонкий» эндометрий. Оно подразумевает истончение эндометрия менее 8 мм в период предполагаемого «окна имплантации» [25].

Использование лечебных физических факторов для подготовки пациенток к ЭКО целесообразно у пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и указанием на наличие перенесенных воспалительных заболеваний эндометрия в сочетании с нарушениями маточной гемодинамики [15].

Результаты собственных исследований, проведенные в 2010 г., показывают, что сложная гемоциркуляторная перестройка сосудистого русла в ответ на действие физического фактора, по данным реографии и допплерометрии сосудов матки с цветным допплеровским картированием, характеризовалась улучшением транскапиллярного тканевого обмена в результате положительного вазотропного эффекта на уровне мелких сосудов матки. Это нашло отражение в сложных разнонаправленных изменениях концентраций ангиогенных факторов в крови на системном уровне. Оптимизация параметров гемодинамики на фоне терапии за счет устранения повреждений сосудистых терминалей и ишемии ткани приводила к уменьшению тканевой гипоксии. Под действием антигипоксического эффекта импульсной электротерапии изменялись исходно нарушенные соотношения про- и антиангиогенных факторов в сторону их нормализации в ткани эндометрия и в сыворотке крови. Все это влияло на стабилизацию сосудистой сети эндометрия, его циклической трансформации в течение менструального цикла и приводило к позитивным клиническим и эхографическим изменениям [9].

Приводит к нарушению «лиганд-рецепторных» взаимодействий между эндометрием и эмбрионом избыточное накопление L-селектина на 3-й день культивирования или недостаточное на 5-й день культивирования в культуральной среде, при сниженной экспрессии MECA-79 в поверхностном эпителии и железах эндометрия и повышении экспрессии L-селектина в поверхностном эпителии, железах, строме и в сыворотке крови [2, 3]. Следствием этих несоответствий является ненаступление беременности.

Несомненной причиной установленных нарушений является ангиогенно-воспалительный стресс, приводящий к разрушению устойчивых «лиганд-рецепторных» взаимодействий и изменению «сигнальных путей» в клетках. Основополагающие признаки этого состояния нами были опубликованы в научной литературе (см. таблицу).

Таким образом, проведенное первое пилотное исследование позволило показать, что содержание L-селектина в крови играет важную роль в процессе имплантации и наступления беременности, может служить дополнительным признаком функциональной активности эндометрия в программе ЭКО. Повышение эффективности наступления беременности отмечено при уровне L-селектина меньше 1710 нг/мл у больных с лечением - до 57,1% (без лечения - 42,9%). Наименьшая эффективность отмечена у больных при уровне L-селектина больше 1710 нг/мл; без лечения - 14,3%, с лечением - 42,3%. Последующее использование полученных результатов исследований позволит повысить эффективность лечения при проведении вспомогательных репродуктивных технологий у больных с бесплодием трубного происхождения.

Выражаем благодарность профессору Matts Olovsson и профессору Anneli Stavreus-Evers, сотрудникам Department of Women's and Children's Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden за многолетнее сотрудничество (с 1993 г.), участие, обсуждение и поддержку. Финансовая, научная, правовая и политическая помощь осуществлялась Шведской Королевской академией наук, Шведским медицинским Исследовательским Советом (проект №8683), Университетом Уппсалы, Швеция, Российской академией медицинских наук, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Мин­здрава России.