Известно, что оксид азота (NO), присутствующий во многих тканях, важный между- и внутриклеточный посредник, задействованный в регуляции многочисленных физиологических процессов. NО продуцируется с L-аpгинина при участии фермента цитозоля NO-синтазы (NOS). Существуют два класса NO-синтаз: cNOS конститутивные (eNOS, nNOS), которые экспрессируются постоянно, и/или требуется кальций/кальмодулин как кофактор; индуцибельная (іNOS), которая продуцирует NО в случае необходимости и не зависит от кальция. NOS конкурируют с аргиназами за L-аргинин (как общий субстрат), кроме того, гидрокси-L-аргинин (NOHA) как промежуточное звено в продукции NO из L-аргинина — мощный ингибитор аргиназы [23]. Аргиназа существует в двух изоформах: аргиназа І как печеночный тип, локализованная в цитозоле клетки, и аргиназа ІІ, локализованная в митохондриальной матрице. Аргиназа метаболизирует L-аргинин в мочевину и L-орнитин [43]. Сниженная продукция NOHA связана с ослабленной экспрессией NO, что может привести к порочному кругу для NO-генерирующего пути, поэтому продуцирование NO преимущественно зависит от L-аргинина, доступного для NOS. Тогда как аргиназный путь — это эндогенная отрицательно управляющая система для регуляции общего производства NO.

Цель работы — поиск и систематизация данных литературы о роли NO в обеспечении овуляции (в созревании ооцитов и в апоптозе фолликулярного эпителия яичника) и имплантации (в сокращении яйцеводов и миометрия матки, а также в развитии эмбрионов).

Овуляции способствует накопление фолликулярной жидкости и истончение ткани яичника, располагающейся над выступающим полюсом фолликула. Созревший фолликул разрывается, и яйцеклетка вместе с фолликулярной жидкостью попадает в брюшную полость, а затем в маточную (фаллопиеву) трубу.

Во время фолликулярного цикла концентрация нитрата в плазме крови достигает пикового уровня при наступлении овуляции [22, 26] и уменьшается сразу после овуляции [39]. По утверждению авторов [19], именно NO запускает увеличение притока крови в яичник, что важно для осуществления овуляции.

В ряде исследований изучали роль eNOS-зависимого NО в овуляции в экспериментах на самках диких беспородных мышей и мышей с поврежденным геном eNOS. Установлено, что «выбивание» гена eNOS у животных обусловливает меньшую массу яичников и меньшее количество овариальных ооцитов в сравнении с мышами дикого типа [32, 33, 46].

Полагают, что повышение активности NOS в гипоталамусе на протяжении периода полового развития крыс связано с увеличением именно количества эстрадиола, а не чувствительности к нему NOS [48]. Возможно и то, что функция эстрадиола заключается в контроле тока крови во время изменений, которые происходят в самом яичнике в преовуляторный период [20]. Непосредственно с увеличением концентрации эстрадиола связывают особенности овуляторной производительности у мышей с поврежденным геном eNOS [33].

Блокаторы NOS снижают овуляторную производительность у мышей [32, 33, 61]. Ингибирование іNOS приводит к редукции овуляции на 50%, такой эффект отменяется введением донора NO [39]. Нами показано, что введение блокаторов NOS, стимулированных гонадотропинами, мышам вызывало уменьшение количества яйцеклеток, которые выделялись у одной мыши с яйцеводов. После введения блокаторов L-NAME и L-NMMA как до, так и после введения человеческого хорионического гонадотропина (чХГ) происходило уменьшение количества ооцитов в метафазе ІІ и ухудшение их качества в сравнении с контрольными клетками [6, 7].

Располагаются яичники по бокам от матки и в норме «контактируют» фибрами маточной трубы. В яичниках находятся фолликулы (округлой формы образования), заполненные жидкостью. Именно в фолликуле созревает яйцеклетка — женская половая клетка, которая после оплодотворения сперматозоидом дает начало новому организму. Кроме того, яичники вырабатывают женские половые гормоны, которые регулируют деятельность не только репродуктивной системы, но и всего организма женщины.

Известно, что NO увеличивает уровень циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) в клетках-мишенях [40]. Считают, что именно цГМФ с помощью активации ооцитарной цАМФ-фосфодиэстеразы уменьшает уровень цАМФ и запускает созревание ооцитов [31]. Есть данные о том, что сосредоточение цГМФ в кумулюсно-ооцитарных клеточных комплексах не является ответственным за влияние NO на мейотическое созревание ооцитов [17], а временное уменьшение внутриооцитарного уровня NO может вызвать возобновление мейотического созревания ооцитов млекопитающих [47].

Нами было изучено влияние нитропрусида натрия (донор NO) и блокатора NOS (N-монометил-L-аргинина) на мейотическое созревание ооцитов мышей іn vіtro. Активность ооцитарных NOS и наличие NO являются необходимым условием для осуществления мейотического созревания ооцитов, но излишек NO может быть фактором угнетения мейоза уже на стадии его возобновления [12]. Данные о влиянии блокаторов NOS на процесс мейотического созревания ооцитов в составе кумулюсно-ооцитарных клеточных комплексов показывают, что меньшее количество ооцитов достигает метафазы ІІ, больше ооцитов задерживается в метафазе І в условиях угнетения активности NOS. Роль іNOS возрастает с развитием фолликула и ооцита [11].

Мы изучали влияние блокаторов NOS и доноров NO на количество овариальных ооцитов мышей на разных стадиях эстрального цикла и на способность таких ооцитов осуществлять мейотическое созревание іn vіtro. Доноры NO увеличивают количество овариальных ооцитов и их способность к возобновлению мейоза у самок мышей на стадии проэструса, стимулируют способность ооцитов к завершению мейотического созревания у мышей на стадии как диэструса, так и проэструса. Под влиянием доноров NO увеличивается количество ооцитов с атипической морфологией. Блокаторы NOS уменьшают количество овариальных ооцитов, влияют на количество ооцитов с атипической морфологией и угнетают мейотическое созревание ооцитов на всех стадиях эстрального цикла у мышей. Максимальное уменьшение количества овариальных ооцитов происходило у самок мышей на стадии эструса, а максимальное угнетение способности к завершению мейотического созревания овариальными ооцитами — на стадии проэструса [3].

Экзогенное введение простагландина (ПГ) Е₂ и F_2α угнетает мейотическое созревание ооцитов, овариальные NOS задействованы в обеспечении процесса мейотического созревания ооцитов; ПГ F_2α усиливает угнетающее влияние блокатора NOS, а нитропрусид натрия (донор NO) отменяет влияние ПГ F_2α на мейотическое созревание ооцитов из малых фолликулов. NO/NOS система яичника принимает участие как в эффекте действия ПГ на мейотическое созревание ооцитов мышей, так и в механизме действия самих ПГ [1, 10].

Доноры NO влияют на процесс мейотического созревания ооцитов мышей (происходит увеличение: количества ооцитов, которые выделяются с одного яичника, количества овариальных ооцитов с атипической морфологией, количества ооцитов, которые возобновляют первое деление мейоза и формируют полярное тельце іn vіtro); контрацептивная доза эстрадиола дипропионата уменьшает количество овариальных ооцитов и угнетает их способность к мейотическому созреванию; доноры NO вызывают уменьшение влияния эстрадиола дипропионата. NO принимает участие в эффекте действия эстрадиола дипропионата на ооциты как из малых, так и из больших фолликулов мышей [8, 9].

Как блокатор NOS (L-NAME), так и донор NO (SNAP, n-acetyl-penіcіllamіne) значительно угнетали переход ооцитов с метафазы І в метафазу ІІ, а также приостанавливали возобновление мейотического созревания [27, 53].

Экспериментальные данные с использованием донора и блокатора NOS показывают, что NO, продуцированный кумулюсными клетками, оказывает регуляторное влияние на уровень митохондриальной полярности в субплазмолеммальной цитоплазме соответствующего ооцита. Культивирование изолированных и окруженных клетками кумулюса ооцитов в условиях низкой и высокой концентрации кислорода предполагает, что конкурирование между кислородом и NO на уровне митохондрий может регулировать уровень митохондриальной полярности и поддерживать митохондриальный гомеостаз в преовуляторном ооците, а также сдвигать его в сторону более высоких значений (полярности), которые регистрируются после овуляции [58].

Считают, что NO в фолликулярной жидкости продуцируется еNOS гранулярных клеток, поскольку среди изолированных человеческих фолликулярных клеток по крайней мере 90% — это клетки гранулезы [16]. Незначительная разница в уровне NO в больших и малых фолликулах предполагает различия в ответах на NO в разных типах фолликулов [55].

Установлена корреляция между содержанием нитратов в фолликулярной жидкости, количеством ооцитов, возобновляющих мейотическое созревание, и концентрацией сывороточного эстрадиола на день введения чХГ у женщин, которые подвергались процедуре in vitro оплодотворения (ІVF) [38, 56].

Сообщают об отсутствии корреляции между фолликулярным уровнем NO и зрелостью или качеством фолликула [37]. Средняя концентрация NO (как нитрит/нитрат) в фолликулярной жидкости у пациенток программы ІVF выше в группе с существенной фрагментацией ооцитов в сравнении с ооцитами в группе с незначительной фрагментацией цитоплазмы. Установлена обратная корреляция между фолликулярным уровнем NO и концентрацией эстрадиола в сыворотке крови [60].

Показана взаимозависимость в концентрации NO, фолликулярного роста и апоптоза клеток фолликулярного эпителия [51]. Есть данные о том, что низкие концентрации NO предотвращают апоптоз, тогда как высокие концентрации NO, как и усиленная генерация пероксинитрита из-за недостатка аргинина, увеличивают апоптоз эпителиальных клеток фолликула [51]. В малых фолликулах пациенток программы ІVF процент апоптотических фолликулярных клеток с ядерной фрагментацией выше в сравнении с таковым в больших фолликулах [55].

Мы изучали влияние молсидомина (донора NO) на гибель фолликулярных клеток у мышей. Молсидомин увеличивал выживание фолликулярных клеток, снижая в обеих сериях количество апоптотических клеток, а также уменьшал количество некротических клеток [2, 13].

Данные литературы и результаты наших исследований позволяют утверждать, что NO вовлечен в фолликулогенез и апоптическую гибель фолликулярных клеток, принимает участие в регуляции мейотического созревания ооцитов. Таким образом, NO — важный регуляторный агент в обеспечении нормальной овуляции, особенно в период роста и созревания главного фолликула, содержащего внутри себя ооцит.

Оптимальные условия для имплантации яйцеклетки имеют место в середине лютеиновой фазы овариального цикла, когда под влиянием прогестерона желтого тела полностью сформировался функциональный слой эндометрия. Процесс имплантации происходит после контакта бластоцисты со стенкой матки, как правило, в ее верхней задней области. На протяжении 1 ч после начала имплантации в матке происходят изменения в стромальной ткани, называемые децидуализацией, течение которой зависит от эстрадиола и прогестерона. Имплантация яйцеклетки в эндометрий матки регулируется хорионическим гонадотропином, который продуцируется в трофобластных клетках бластоцисты после начала ее внедрения в слизистую оболочку матки. С другой стороны, имплантация зародыша вызывает усиление афферентных импульсов от рецепторов слизистой оболочки матки в гипоталамус.

В клетках маточных (фаллопиевых) труб человека показано присутствие конститутивных и индуцибeльных изоформ NOS [25, 50]. Считают, что дефицит NO может привести к трубной дисфункции, которая заключается в задержке продвижения яйцеклетки, отсрочке транспорта спермы, что может приводить к бесплодию трубного происхождения. В то же время повышенный уровень NO в фаллопиевых трубах может быть токсичным для сперматозоидов [24, 49].

Количественным RT-PCR (полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой) анализом установлено, что NOS изоформы регулируются гормонами и дифференцированно экспрессированы в яйцеводах на протяжении эстрального цикла. Показано, что эстрадиол специфически регулирует выраженность іNOS в яйцеклетке на протяжении преовуляторного периода, отвечая окну овуляции, транспорту ооцита и оплодотворению. Считают, что nNOS, іNOS и eNOS принимают участие в регуляции сокращения яйцевода [35].

Считают, что в шейке матки в отличие от миометрия продукция NО низкая во время беременности и возрастает с приближением беременности к сроку родов. Известно, что доноры NО являются эффективными и безопасными агентами, которые способствуют цервикальному созреванию. Такие выводы сделаны в экспериментах на животных и подтверждены клиническими испытаниями [39].

NO проникает в толщу гладкомышечных клеток, где активация гуанилилциклазы является преобладающим механизмом формирования цГМФ с гуанозинтрифосфата. цГМФ приводит к расслаблению гладких мышц с дальнейшей вазодилатацией [29, 41, 42, 45, 59].

Показана экспрессия двух изоформ (еNOS и іNOS) в матке мышей на протяжении эстрального цикла и во время ранних сроков беременности, а также возможное участие овариальных гормонов в ее регуляции. Есть данные, что экспрессия NOS на протяжении преимплантационного периода приводит к увеличению продукции NO, которая в свою очередь способствует имплантации эмбрионов [62].

Известно, что во время гестации продукция NO в миометрии возрастает, таким способом достигается относительная неподвижность матки. К сроку родов продукция NO уменьшается, вероятно это влияет на эффективность сокращений миометрия, которые и приводят к изгнанию плода. Из клинических исследований известно, что доноры NО являются эффективными токолитиками [39]. В эстрогенрегулированной генной экспрессии eNOS в миометрии человека задействованы рецепторы эстрадиола альфа и бета [34].

Установлено, что экспрессия белка аргиназы ІІ значительно снижена во время беременности и после родов (с наиболее низкой величиной на 14-й день беременности) и постепенно увеличивается к концу срока беременности и после родов [30].

Нами исследованы темпоральные особенности величин амплитуды сокращений миометрия мыши в условиях действия ингибитора митохондриальных переносчиков, активатора митохондриальной поры, ингибитора кальциевого унипортера. Полученные данные позволяют утверждать, что функциональное состояние миометрия зависит от функционирования аспартатного митохондриального переносчика; сам митохондриальный переносчик зависит от входа кальция через кальциевый унипортер и от NO (по аргиназному пути его образования); переносчик функционирует в зависимости от митохондриального мембранного потенциала и неспецифической проводимости митохондрий (поры); эстрадиол осуществляет влияние на функционирование аспартатного переносчика; его эффект не опосредуется митохондриальным NO (по аргиназному пути его образования) [14].

Известно, что относительно высокие концентрации NO являются необходимыми для обеспечения коммуникаций между эпителиальными клетками матки и бластоцистой в местах имплантации [54], а взаимодействие NO с прогестероном важно для имплантационного процесса [15]. Показано, что излишек NO индуцирует апоптоз в эмбрионах мышей [21]. Установлена прямая корреляция между уровнем NO в фолликулярной жидкости и качеством эмбриона [60].

Показана экспрессия eNOS и іNOS в цитоплазме эмбрионов во время преимплантационного развития и eNOS в ядрах эмбрионов [44]. Исследовано изменение активности NOS и вклад изоформ eNOS и іNOS в преимплантационный период развития эмбрионов. Установлено уменьшение активности NOS у эмбрионов в период их развития с 4- до 8-клеточной стадии и рост активности NOS у эмбрионов на стадии морулы [44, 52].

Все три изоформы NOS присутствуют в эмбрионах: 2-, 4-клеточных, на стадии морулы и бластоцисты [57], а также известно, что бластоцисты мышей и постимплантационных клеток трофобластов содержат eNOS и іNOS и продуцируют высокие уровни NO [28].

Доноры NO [36, 54] и ингибиторы NOS угнетают развитие эмбрионов [18, 44, 53]. NO дефицит по NOS3 затрагивает репродуктивные особенности, связанные с развитием эмбрионов [46].

Нами показано, что NO принимает участие в пре- и постимплантационном развитии эмбрионов у мышей. Введение ингибиторов NOS самкам до спаривания приводило к увеличению показателей эмбриональной гибели у мышей [5, 6]. Изучение морфологических особенностей эмбрионов показало, что происходит замедление эмбрионального развития на стадии дробления и в ходе гаструляции. Это может быть результатом нарушений в процессе мейоза при созревании ооцитов, что ведет к гибели зигот.

NO влияет на нормальное преимплантационное развитие эмбрионов. Представляется очевидным, что физиологические количества NO, которые секретируются самими эмбрионами, являются необходимыми для нормального их развития. Преимплантационные эмбрионы чувствительны к изменениям уровня NO, а индуцированное изменение уровня NO может значительно влиять на имплантацию и дальнейшее (постимплантационное) эмбриональное развитие [4].

Представленные данные подтверждают важность NO в сокращении маточных труб и самой матки, в механизмах, на сегодня малоизученных, которые регулируют митотическое деление пре- и постимплантационных эмбрионов.

NO — важный регуляторный агент в обеспечении овуляции и имплантации. Сегодня продолжают активно изучать роль NO в осуществлении репродуктивной функции у женщин.