DDAH1: молекулярная структура, локализация на хромосоме, особенности экспрессии и физико-химические свойства

В 1987 г. T. Ogawa с группой исследователей [1] выделили из почки крысы и впоследствии очистили фермент, диметиларгинин диметиламиногидролазу (DDAH), который специфически гидролизует асимметрично метилированные остатки аргинина до цитруллина. Исследователи провели подробное описание свойств фермента, который состоял из одного полипептида. Его молекулярная масса составляла около 33 000 аминокислотных остатков. Изоэлектрическая точка фермента находилась при pH 5,2. Фермент проявлял максимальную активность при pH 6,5 и не требовал кофактора. Активность сильно ингибировалась SH-блокирующими реагентами (например, п-хлормеркурибензоатом и HgCl₂) и ионами двухвалентных металлов (например, Cd^2+, Cu²⁺ и Zn²⁺) [1].

DDAH — это семейство ферментов цистеин-гидролаз, которые экспрессируются во всех клетках млекопитающих в одной из изоформ [2]. У млекопитающих существуют две изоформы DDAH — DDAH1 или DDAH2, экспрессирующиеся в большинстве тканей плода человека и мыши [3, 4]. Эндогенно образующиеся асимметрично метилированные остатки аргинина являются конкурентными ингибиторами всех трех изоформ синтазы оксида азота (NOS). DDAH специфически гидролизует эти асимметрично метилированные остатки аргинина до цитруллина и метиламинов. Изоформы DDAH высококонсервативны на аминокислотном уровне, особенно в отношении остатков, важных для связывания и гидролиза субстрата (Cys, Asp и His), а также высококонсервативны между видами, с высокой гомологией между последовательностями генов человека, мыши, крысы и быка [5]. Исследователи согласны с тем, что DDAH1 является ключевым ферментом, ответственным за метаболизм ADMA и NMMA [6], однако существуют противоречивые данные относительно метаболической активности DDAH2.

Первоначально сообщалось, что очищенный рекомбинантный DDAH2 метаболизирует NMMA, но последующие исследования не смогли воспроизвести метаболическую активность DDAH2 in vitro [7]. Колебания концентрации ADMA наблюдаются при избыточной экспрессии или нокауте гена DDAH2, однако остается неясным, влияет ли DDAH2 на концентрацию ADMA через прямой метаболизм или посредством косвенной регуляции его метаболизма. Трудности с воспроизведением активности DDAH2 in vitro могут указывать на необходимость дополнительных кофакторов или белок-белковых взаимодействий либо на отсутствующий этап в пути метаболизма ADMA, который не функционирует в клеточных лизатах, часто используемых для оценки функции рекомбинантного белка DDAH2. Тем не менее на основании текущих знаний фермент DDAH1 представляется ключевым для метаболизма ADMA/NMMA и, следовательно, более важным в контексте ингибирования васкулогенной мимикрии через путь ADMA/NO.

C. Tran и соавт. [4] при помощи флюоренсцентной гибридизации in situ продемонстрировали, что ген DDAH1 находится на хромосоме 1p22, тогда как DDAH2 отображается на области MHCIII хромосомы 6p21.3. Экспрессия DDAH2 в клетках иммунной системы в сочетании с его хромосомным расположением позволяет предположить, что DDAH2 может играть роль в модуляции защиты хозяина или иммунной толерантности совместно с iNOS.

Хромосомная локализация DDAH согласуется с дупликацией генов, а сравнение структур генов указывает на высокую степень консервативности организации интронов и экзонов. Исследователи также произвели филогенетический анализ последовательностей DDAH у разных видов животных, что позволило им предположить, что дупликация гена DDAH произошла до появления костных рыб около 400 млн лет назад. В целом полученные данные C. Tran и соавт. [4] позволяют предположить, что DDAH2 может быть более древним из двух генов.

Гомозиготная делеция гена DDAH1 приводит к внутриутробной летальности у мыши. Хотя точный механизм такой летальности в данной работе не описан, этот ген должен выполнять какие-то важные функции в ходе эмбриогенеза. У мышей DDAH1+/– снижена экспрессия белка DDAH1 в скелетных мышцах, легких, мозге и сердце, при этом экспрессия DDAH2 оставалась неизмененной. У таких мышей наблюдаются аномалии в легочном сосудистом русле, которые приводят к легочной гипертензии [8].

Экспрессия белка DDAH1 повышается под действием IL-1β, но снижается под действием окисленных липопротеинов низкой плотности или фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α) [9, 10]. Экспрессия белка DDAH2 повышается под действием транс-ретиноевой кислоты [11], пиоглитазона [12] и эстрадиола [13], а снижается под действием CF6 (Mitochondrial coupling factor 6) [14], липополисахаридов и высоких концентраций глюкозы, генерирующих активные формы кислорода [15].

J. Leiper и соавт. [2] сравнили аминокислотную последовательность человеческих DDAH1 и DDAH2 с последовательностью ферментов, вовлеченных в синтез или метаболизм аргинина, и не обнаружили гомологии с какими-либо ферментами млекопитающих. Однако исследователи выявили значительную гомологию между изоформами DDAH и аргининдеиминазами, семейством ферментов, которые до сих пор были описаны только в прокариотических организмах и примитивных эукариотических организмах Giardia intestinalis. Аргининдеиминаза является первым ферментом дигидролазного пути аргинина, важного источника энергии и азота для микробов. Аргининдеиминаза катализирует гидролиз аргинина до аммиака и цитруллина — реакция, которая очень похожа на гидролиз метиларгинина до метиламина и цитруллина, катализируемый DDAH. DDAH1 и DDAH2 оказались на 80% идентичны с бактериальными деиминазами и содержали два из трех доменов, высококонсервативных между всеми аргининдеиминазами [2, 16]. Было высказано предположение, что эти домены могут представлять собой субстратсвязывающий каталитический сайт в аргининдеиминазе и тот факт, что эта область высококонсервативна в DDAH, предполагает, что она может иметь отношение к связыванию субстрата или каталитической активности этих ферментов. Человеческий белок DDAH1 на 93% идентичен ферменту крысы и проявляет сходные свойства [2].

Говоря о структуре белка DDAH1, стоит отметить, что его вторичная структура имеет пропеллероподобную складку, характерную для суперсемейства L-аргинин/глицин амидинотрансфераз. Этот 5-цепочечный пропеллер содержит 5 повторов мотива ββαβ. Эти мотивы в DDAH образуют канал, заполненный молекулами воды. Lys174 и Glu77 образуют солевой мостик в канале, который составляет нижнюю часть активного сайта, заполненного молекулами воды. Одна сторона канала представляет собой заполненную водой пору, а другая — щель активного сайта [17].

Тканевая экспрессия белков семейства DDAH

DDAH1 и DDAH2 являются преимущественно цитоплазматическими ферментами, хотя некоторое количество DDAH1 обнаруживается в мембранной фракции лизатов эндотелиальных клеток [18]. Оба фермента широко экспрессируются в различных тканях и типах клеток с частично совпадающими паттернами экспрессии [19].

DDAH1 широко экспрессируется в печени и почках в местах экспрессии NOS [20, 21]. Почки и печень человека являются основными местами метаболизма ADMA, что позволяет предположить, что DDAH1 в печени и почках может быть регулятором циркулирующего ADMA, по данным R. Nijveldt и соавт. [20] и A. Tojo и соавт. [21]. Активация рецепторов ангиотензина 1-го типа в почках снижает экспрессию DDAH1, но повышает экспрессию DDAH2.

Высокая цитоплазматическая экспрессия DDAH1 также была обнаружена в поджелудочной железе, переднем мозге, аорте, перитонеальных нейтрофилах и макрофагах [4]. DDAH1 экспрессируется на эквивалентном уровне в тканях плода и взрослого человека [4].

DDAH2 экспрессируется на относительно высоком уровне во всех тканях плода, в то время как его концентрация снижается, а места экспрессии становятся более избирательными у взрослых [4]. DDAH2 преобладает в сосудистом эндотелии, который является местом экспрессии eNOS [6]. Он широко экспрессируется в сердце и плаценте и интенсивно, но избирательно — в почках. DDAH2 также экспрессируется в иммунных тканях, которые экспрессируют iNOS [4, 17]. К ним относятся селезенка, тимус, периферические лейкоциты, лимфатические узлы и костный мозг [2, 4]. Возможно, к этому относится сообщение о повышенном риске сердечно-сосудистых событий у пациентов с системной красной волчанкой, у которых повышен уровень ADMA в плазме крови [22].

A. Kozlova и соавт. [23] в своем исследовании представили подробную характеристику регионального и клеточного распределения белков DDAH1 и DDAH2 в мозге взрослого человека и мыши. Иммуногистохимический анализ показал широкое распределение DDAH1, связанное с множеством типов клеток, в то время как DDAH2 был обнаружен в ограниченном количестве областей мозга и исключительно в нейронах. Данные об экспрессии белка DDAH1 и матричной РНК в нормальных тканях человека представлены в Human Protein Atlas (https://www.proteinatlas.org/) и Genotype-Tissue Expression.

Сигнальный путь DDAH/ADMA/NO

Значение сигнального пути DDAH/ADMA/NO в ангиогенезе хорошо документировано. В эндотелиальных клетках путь DDAH/ADMA/NO играет регуляторную роль, необходимую для эффективного ангиогенеза, который включает активацию, пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. Дисрегуляция этого пути ассоциируется с нарушением ангиогенеза.

Оксид азота (NO) играет ключевую роль в различных физиологических и патологических процессах путем усиления выживания и пролиферации эндотелиальных клеток. В частности, NO стал молекулой, представляющей интерес для изучения канцерогенеза и опухолевой прогрессии благодаря своей решающей роли в инвазии клеток, метастазировании и ангиогенезе. NO является эндогенным легочным вазодилататором и ключевым регулятором легочного ангиогенеза [24, 25]. Существуют три вида синтаз окиси азота, с помощью которых вырабатывается NO, каждый из которых демонстрирует уникальный характер экспрессии и назван по месту первоначального выделения: эндотелиальная NOS (eNOS, или NOS3) — основной источник NO в легочном эндотелии, нейрональная NOS (nNOS, или NOS1) и индуцибельная NOS (iNOS, или NOS2). Эти изоформы являются потенциальными мишенями для терапии ангиогенеза.

nNOS преимущественно экспрессируется резидентными клетками центральной и периферической нервной системы, включая как нейронные, так и ненейронные клетки, iNOS экспрессируется в воспалительных клетках, а также может быть обнаружена во многих других типах клеток в ответ на иммунологические или воспалительные агенты, такие как цитокины и липополисахариды, а eNOS преимущественно экспрессируется в эндотелиальных клетках. Таким образом, существует регуляция синтеза NO на уровне транскрипции NOS, посттрансляционных модификаций и специфической клеточной экспрессии, а также метаболическая регуляция на уровне доступности субстрата NOS [26]. Активность всех трех изоформ NOS регулируется конкурентными ингибиторами — ADMA и L-NMMA, которые являются повсеместными эндогенными метаболитами деградации белка, конкурирующими с субстратом NOS L-аргинином за связывание с активным сайтом NOS.

Семейство белковых ферментов аргининметилтрансфераз катализирует присоединение метильных групп к остаткам аргинина в белках с образованием асимметричного N^G,N^G- диметил-L-аргинина (asymmetrical dimethylarginine — ADMA), N^G-монометил-L-аргинина (L-NMMA) и симметричного N^G,N^’G диметил-L-аргинина (symmetrical dimethylarginine — SDMA) [27]. Протеолиз белков, содержащих эти остатки, приводит к высвобождению свободного метиларгинина в цитоплазму. Из трех известных метиларгининов асимметричные (ADMA и L-NMMA) и несимметричный (SDMA) являются конкурентными ингибиторами NOS и могут изменять выработку NO как в нормальных физиологических условиях, так и в условиях патологии.

Асимметричный диметиларгинин (Asymmetric dimethylarginine — ADMA) — эндогенная метилированная аминокислота, которая ингибирует конститутивную эндотелиальную и нейрональную изоформы NOS [28]. Он является менее мощным ингибитором индуцибельной NOS [29]. Белки подвергаются метилированию остатков аргинина с помощью протеин-аргинин-метилтрансфераз (PRMTs). При гидролизе белков ADMA высвобождается, выводится из клетки и поглощается другими клетками через систему y+ переносчиков семейства катионных аминокислот (CAT) [30]. ADMA выводится путем как почечной экскреции, так и метаболической деградации. Его метаболизм облегчается диметиларгинин-диметиламиногидролазами (DDAHs), которые экспрессируются в виде изоформ 1-го и 2-го типов. Предполагается, что в совокупности более 70—80% ADMA метаболизируются этими ферментами [1, 19, 31]. Действительно, гетерозиготная делеция DDAH1 у мышей увеличивала концентрацию ADMA в плазме, мозге и легких на 20% [8]. В ряде исследований [32] были получены доказательства того, что нарушение активности DDAH является основной причиной, по которой метаболические нарушения (такие как гиперхолестеринемия или гипергликемия) повышают уровень ADMA. Повышение уровня ADMA в плазме ухудшает сосудистую функцию и увеличивает риск сердечно-сосудистых заболеваний и смерти. Таким образом, представляется вероятным, что DDAH, снижая уровень ADMA, может уменьшить прогрессирование сердечно-сосудистых заболеваний [33].

Несколько исследований свидетельствуют, что в нормальных условиях DDAH1 является изоформой, ответственной за метаболизм ADMA. Во-первых, ткани мышей с нокаутом DDAH1 не проявляют никакой активности DDAH. Во-вторых, нокаут DDAH1 в культивируемых эндотелиальных клетках сосудов приводит к накоплению ADMA и снижению продукции NO, в то время как нокдаун DDAH2 не оказывает никакого эффекта [34]. В соответствии с этим выводом сверхэкспрессия DDAH1 в культивируемых эндотелиальных сосудистых клетках снижает содержание ADMA, а сверхэкспрессия DDAH2 — нет.

Роль DDAH1 в патогенезе различных заболеваний

Поскольку NO играет важную роль в сигнальной и защитной деятельности, уровень его выработки должен строго регулироваться во избежание повреждения клеток. Эндогенный NO является продуктом двухступенчатой окислительно-восстановительной реакции, требующей участия молекулярного кислорода и ряда кофакторов, включая флавин моно- и динуклеотид, кальмодулин, никотинамидадениндинуклеотидфосфат и тетрагидробиоптерин [35]. NO является важной сигнальной и эффекторной молекулой в нейротрансмиссии, бактериальной защите и регуляции сосудистого тонуса [26]. NO высокотоксичен, свободно диффундирует через мембраны, а его радикальная форма достаточно реактивна, поэтому клетки должны поддерживать значительный контроль над его концентрацией путем регулирования активности NOS и активности таких ферментов, как DDAH, которые оказывают косвенное влияние на концентрацию NO. Дисбаланс NO способствует развитию ряда заболеваний. Фармакологическое ингибирование DDAH увеличивает концентрацию ADMA в эндотелиальных клетках и ингибирует NO-опосредованное эндотелийзависимое расслабление кровеносных сосудов [36]. Эти наблюдения позволяют предположить, что активность DDAH, обеспечивающая локальную концентрацию ADMA, обычно не повышается настолько, чтобы повлиять на выработку NO, а изменения активности DDAH могут изменять активность NOS.

NO участвует в регуляции проницаемости сосудов и ангиогенезе, опосредованном фактором роста эндотелия сосудов (VEGF). Учитывая важную и разнообразную роль NO, неудивительно, что изменение концентрации NO приводит к значительным патофизиологическим эффектам. К ним относятся многочисленные сердечно-сосудистые заболевания, а также нейродегенеративные расстройства, воспалительный артрит, септический шок, шизофрения и различные виды злокачественных новообразований, о чем говорилось ранее [37].

Ферменты DDAH являются важными регуляторами гомеостаза сердечно-сосудистой системы, особенно в модуляции ангиогенеза и неоваскуляризации. Нарушение пути DDAH/ADMA/NO и связанная с ним эндотелиальная дисфункция были тщательно изучены в контексте сердечно-сосудистых и почечных заболеваний. Исследование гетерозиготных нокаутных мышей по DDAH1, проведенное J. Leiper и соавт. [8], впервые продемонстрировало, что у мышей наблюдаются накопление ADMA и снижение концентрации NO, что приводит к дисфункции эндотелия, структурным изменениям в легочном сосудистом русле и снижению частоты сердечных сокращений и сердечного выброса.

Экспрессия и активность DDAH1 и DDAH2, по-видимому, критически важны для заживления ран и ангиогенеза. Сверхэкспрессия DDAH1 в эндотелиальных клетках приводила к усиленному образованию трубок при выращивании на матригеле и увеличению экспрессии мРНК VEGF; блокирование активности DDAH снижало эти эффекты [38]. У мышей с гиперэкспрессией DDAH1 наблюдались усиление неоваскуляризации после ишемии задних конечностей и улучшение регенерации эндотелиальных клеток с уменьшением образования неоинтимы после повреждения сосудов [39, 40].

Повышение уровня MMA и ADMA в плазме крови и моче было ассоциировано с заболеваниями, связанными с низким уровнем NO, такими как уремия, хроническая сердечная недостаточность, атеросклероз и гипергомоцистеинемия [41]. Напротив, при таких состояниях, как септический шок, мигрень, воспаление и нейродегенеративные заболевания, NOS избыточно производит NO [26]. В совокупности имеющиеся исследования демонстрируют важную роль пути DDAH/ADMA в регуляции неоваскуляризации, пролиферации, дифференцировки и подвижности эндотелиальных клеток in vivo и in vitro.

Значение ферментов DDAH в ангиогенезе онкологических заболеваний, неоваскуляризации и васкулогенной мимикрии стало выясняться лишь недавно.

Роль DDAH1 в процессах канцерогенеза

DDAH1 играет ключевую роль в росте опухолей и развитии опухолевого сосудистого русла, регулируя концентрацию NO и изменяя выработку фактора роста эндотелиальных клеток сосудов. В литературе было продемонстрировано увеличение экспрессии DDAH1 в опухолях различного происхождения, а также высказано предположение о потенциальной ADMA-независимой роли фермента DDAH1 в дополнение к их хорошо изученному ADMA-опосредованному механизму влияния на NO. Ингибирование экспрессии и/или активности DDAH1 в моделях клеточных культур и в исследованиях in vivo показало потенциальную терапевтическую пользу этого пути через ингибирование ангиогенеза и васкулогенной мимикрии. Стратегии манипулирования функцией DDAH1 при различных видах злокачественных опухолей в настоящее время активно разрабатываются несколькими исследовательскими группами.

S. Parveen и соавт. [42] исследовали регуляцию DDAH1 на модельных клеточных линиях рака простаты (PC3, LNCaP, and DU145) в условиях гипоксии. Результаты, полученные с помощью ChIP-метода (Chromatin immunoprecipitation) и репортерного анализа, подтвердили, что экспрессия DDAH1 положительно регулируется HIF-1α путем прямого связывания с элементами ответа на гипоксию (Hypoxia-Response Element — HRE), расположенными в промоторной области между -1242/-1238 п.н. от сайта начала транскрипции (Transcription start site — TSS). В условиях гипоксии HIF-1α транслоцируется в ядро и активирует экспрессию целевого гена в клетках PC3. Интересно, что в случае ингибирования HIF-1α или нокдауна, опосредованного siRNA, альтернативный транскрипционный фактор Nrf2 способствует экспрессии DDAH1 через элементы антиоксидантного ответа (Antioxidant response elements — AREs) на его промоторе. Результаты анализа ChIP показали, что Nrf2 связывается с AREs, расположенными между -1016/-1008 п.н. от TSS DDAH1. Кроме того, нокдаун терапевтической мишени HSP90, являющейся важным кофактором для HIF-1α и Nrf2, приводит к ослаблению сверхэкспрессии DDAH1 в клетках PCa, вызванной гипоксией. Эти результаты показывают, что вызванное гипоксией повышение экспрессии DDAH1 положительно регулируется HIF-1α и Nrf2 в ассоциации с HSP90 [42].

Ряд исследований [43, 44] показал, что сверхэкспрессия DDAH1 способствует ангиогенезу in vitro и усиливает рост глиомы in vivo за счет повышенной экспрессии NO и VEGF.

Было показано, что DDAH1 может ингибировать процесс почечного фиброза через Wnt/β-катениновый путь — важнейший сигнальный каскад, связанный с рядом заболеваний человека [45], включая злокачественные опухоли [46]. Сигнализация Wnt регулирует различные функции опухолевой клетки, такие как пролиферация, апоптоз, подвижность и инвазия, посредством активации β-катенина. Большое количество исследований свидетельствует, что канонический путь Wnt/β-катенин играет ключевую роль в индуцировании эпителиальных раковых клеток к эпителиально-мезенхимальному переходу, что облегчает миграцию через внеклеточный матрикс и отдаленное метастазирование [47].

Исследовательская группа Y. Wang и соавт. [48] разработала ингибитор DDAH1 — Cl-NIO, работу которого затем протестировали в клеточных линиях меланом кожи. Предварительный анализ экспрессии показал, что в 50 (78%) из 64 протестированных линий меланомы уровень DDAH1 был повышен по сравнению с нормальными контрольными линиями меланоцитов. Добавление Cl-NIO к клеточной линии меланомы A375 привело к снижению выработки оксида азота в клетках.

J. Ye и соавт. [49] оценили прогностическое значение DDAH1 у пациентов с раком желудка, а также его функции в прогрессировании злокачественных новообразований. Исследователи выяснили, что снижение уровня DDAH1 часто обнаруживается в тканях рака желудка и тесно коррелирует с более агрессивным фенотипом. Низкая экспрессия DDAH1 тесно связана с большим количеством метастазов в лимфатических узлах, низкой гистологической дифференцировкой и худшим клиническим исходом. В экспериментальных системах принудительная экспрессия DDAH1 в клетках рака желудка подавляла миграцию и инвазию клеток in vitro, а также метастатический потенциал in vivo. Сверхэкспрессия DDAH1 ингибировала эпителиально-мезенхимальный переход, увеличивая деградацию β-катенина через ослабление Wnt/GSK-3β-сигнализации. Нокдаун DDAH1 приводил к противоположным эффектам. Эти результаты ясно указывают на то, что DDAH1 функционирует как опухолевый супрессор при раке желудка и может быть использован в качестве прогностического биомаркера.

K. Reddy и соавт. [50] исследовали роль ингибитора DDAH1 — DD1E5 при раке простаты. Воздействие на опухолевые клетки ингибиторами DDAH1 привело к подавлению пролиферации клеток и последующему снижению выработки NO с накоплением ADMA. DD1E5 подавлял экспрессию VEGF, c-Myc, bFGF и IL-8, HIF-1α и iNOS, вызванную экзогенной сверхэкспрессией DDAH1 в клеточных культурах рака простаты. Кроме того, DD1E5 значительно повышал внутриклеточный уровень ADMA и снижал выработку NO, что указывает на его терапевтический потенциал для лечения опухолей, при которых DDAH1 повышен. DD1E5 ингибировал in vivo рост ксенотрансплантатов опухолей со сверхэкспрессией DDAH1 за счет снижения содержания опухолевого эндотелия, представленного низким уровнем экспрессии CD31. Экспрессия VEGF, HIF-1α и iNOS была снижена в опухолях, обработанных DD1E5, по сравнению с соответствующими контрольными опухолями.

N. Buijs и соавт. [51] исследовали экспрессию DDAH1 в образцах гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) и здоровой ткани печени 20 пациентов, подвергшихся ее резекции. Они также исследовали влияние гипоксии на DDAH1 и факторы, способствующие ангиогенезу на клетках HepG2 и первичных гепатоцитах человека. Экспрессия DDAH1 была значительно повышена в первичных опухолях ГЦК по сравнению со здоровой тканью печени. Это было связано с увеличением соотношения аргинина и ADMA, повышением образования NO и экспрессии VEGF в ГЦК человека по сравнению с неопухолевой тканью печени. Гипоксия индуцировала экспрессию DDAH1, iNOS и VEGF в клетках HepG2 в зависимости от времени. В совокупности результаты N. Buijs и соавт. [51] впервые выявили DDAH1 в качестве ключевого фактора в регуляции ангиогенеза в ГЦК человека, что можно использовать в усовершенствовании терапевтических стратегий, направленных на VEGF.

Чтобы выяснить, зависит ли DDAH1-опосредованный рост опухоли от ферментативной активности DDAH1, J. Boult и соавт. [52] создали клеточные линии глиомы C6, экспрессирующие мутантный активный сайт DDAH1, не способный метаболизировать ADMA. Ксенотрансплантаты из этих клеточных линий росли значительно быстрее, чем полученные из клеток контрольной группы (трансфецированных пустым вектором), но не так быстро, как экспрессирующие DDAH1 дикого типа. Экспрессия VEGF в опухолях, экспрессирующих мутантный DDAH1, не отличалась от таковой контрольных опухолей, но была значительно ниже, чем в опухолях, экспрессирующих DDAH1 дикого типа. Флюоресцентная микроскопия для определения CD31 и образования аддуктов с пимонидазолом показала, что в опухолях, экспрессирующих мутантный DDAH1, было меньшее содержание эндотелия, они демонстрировали меньшую гипоксию, чем опухоли дикого типа, экспрессирующие DDAH1 [52].

DDAH1 и васкулогенная мимикрия

Васкулогенная мимикрия (ВМ) опухолевых клеток, также называемая сосудистой мимикрией, описывает пластичность агрессивных раковых клеток, формирующих сосудистые сети de novo, и ассоциируется со злокачественным фенотипом и плохим клиническим исходом. ВМ описана во множестве опухолей, включая карциномы, саркомы, глиобластомы, астроцитомы и меланомы. Наличие ВМ ассоциируется с высоким классом опухоли, короткой выживаемостью, инвазией и метастазированием. В индукции и формировании ВМ участвует целый ряд молекулярных механизмов и сигнальных путей, в том числе ферментативная активность фермента DDAH1.

Повышенная экспрессия DDAH1 и последующее увеличение выработки NO связаны со злокачественными новообразованиями. В частности, DDAH1 участвует в создании опухолевыми клетками сосудистой сети — васкулогенной мимикрии. DDAH1 является потенциальной терапевтической мишенью для ингибирования ВМ.

ВМ встречается во многих типах опухолей, включая рак молочной железы, где ассоциируется с более злокачественным фенотипом, например с трижды негативными и HER2-позитивными опухолями. Последнее можно объяснить известными факторами, вызывающими ВМ, такими как гипоксия, TGF-B, TWIST1, EphA2, VEGF, матриксные металлопротеиназы и другие факторы опухолевого микроокружения, которые в совокупности вызывают трансформацию опухолевых клеток в мезенхимальный фенотип с высоким уровнем экспрессии маркеров стволовости.

Важность экспрессии микроРНК miR-193b при опухолях была подтверждена J. Hulin и соавт. [53]. Она была идентифицирована как опухолевый супрессор во многих видах опухолей и линиях опухолевых клеток. Используя алгоритмы биоинформатики, J.Hulin и соавт. определили сайт-мишень miR-193b в 3′UTR человеческого DDAH1. Цель данного исследования — количественное определение уровней экспрессии miR-193b и DDAH1 в клеточных линиях рака молочной железы, оценка miR-193b-опосредованной регуляции DDAH1 и определение роли miR-193b и соответственно DDAH1 в ВМ рака молочной железы. Исследователи выявили сверхэкспрессию DDAH1 в агрессивных клеточных линиях рака молочной железы MDA-MB-231, MDA-MB-453 и BT549 по сравнению с нормальными эпителиальными клетками молочной железы. Экспрессия DDAH1 обратно коррелировала с микроРНК miR-193b. В DDAH1+ клетках MDA-MB-231 эктопическая экспрессия miR-193b снижала экспрессию DDAH1 и превращение ADMA в цитруллин. В DDAH1– клетках MCF7 ингибирование miR-193b повышало экспрессию DDAH1. С помощью люцефиразных тестов было доказано, что DDAH1 является прямой мишенью miR-193b. Клетки MDA-MB-231 организовывались в трубчатые структуры ВМ in vitro, что значительно подавлялось нокдауном DDAH1 или экспрессией miR-193b. Исследователи обнаружили, что miR-193b регулирует клеточную пролиферацию и миграцию клеток MDA-MB-231, в то время как нокдаун DDAH1 ингибирует клеточную миграцию. Эти эксперименты представляют собой первое доказательство экспрессии, регуляции и функции DDAH1 в клетках рака молочной железы и подчеркивают, что таргетное воздействие на экспрессию и ферментативную активность DDAH1 может стать действенным методом лечения агрессивных форм рака молочной железы [53].

Использование ингибиторов DDAH1 в качестве потенциальных терапевтических агентов представляет собой возрастающую область интереса. Исследовательская группа A. Mangoni [54] синтезировала два малых молекулярных ингибитора DDAH1 — ZST316 и ZST152. При анализе ВМ in vitro оба ингибитора DDAH1 значительно ослабляли образование капилляроподобных трубчатых структур в дозозависимом режиме после инкубации с клетками рака молочной железы MDA-MB-231. Это не было связано с клеточной токсичностью или изменением клеточной пролиферации, но могло быть частично обусловлено ингибированием клеточной миграции. Исследователи продемонстрировали значительную модуляцию эндогенного пути DDAH/ADMA/NO после воздействия 100 мкМ ZST316 или ZST152: увеличение концентрации ADMA на 40% и снижение на 38% продукта l-цитруллина. Данное исследование [54] представляет собой первое доказательство терапевтического ингибирования DDAH1 малыми молекулами при раке молочной железы.

DDAH1, косвенно регулируя концентрацию NO в организме, играет ключевую роль в ангиогенных процессах, в том числе в развитии васкулогенной мимикрии. Исследование прогностической роли DDAH1 в патологических процессах в последние годы является предметом интереса исследователей, поскольку его функция в прогрессировании онкологических заболеваний остается неопределенной. Снижение уровня DDAH1 часто коррелирует с более агрессивным фенотипом и плохим прогнозом. Экспрессия DDAH1 в модельных системах in vitro подавляет миграцию и инвазию опухолевых клеток, а также их метастатический потенциал. Сверхэкспрессия DDAH1 ингибирует процесс эпителиально-мезенхимального перехода, в отличие от этого нокдаун DDAH1 приводит к противоположному эффекту.

Прогностическое значение DDAH1 и его функция в прогрессировании онкологических заболеваний остаются неопределенными. Исходя из данных множества исследований, можно сделать вывод, что DDAH1 функционирует скорее как опухолевый супрессор и может быть использован в качестве диагностического и прогностического биомаркеров.

Фармакологические стратегии, направленные на ингибирование функций DDAH1, демонстрируют перспективы в подавлении аномальной неоваскуляризации при злокачественных опухолях. На сегодняшний день селективные ингибиторы DDAH1 разрабатываются несколькими исследовательскими группами. Однако эти ингибиторы обладают неблагоприятной фармакокинетикой и пока что не были протестированы на людях. Разработка мощных, селективных и химически разнообразных ингибиторов DDAH1 потенциально может иметь большое значение.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.