Аномальный липопротеин-Х при сахарном диабете 2-го ти

Сахарный диабет 2-го типа (СД2) является наиболее распространенной формой диабета и характеризуется нарушением углеводного, белкового и липидного обмена, включая дислипидемию и увеличение уровней липопротеинов низкой плотности (ЛПНП ) [1, 2].

Липопротеин-Х (ЛП-Х) представляет собой аномальный подкласс ЛПНП, характеризующийся высоким содержанием фосфолипидов и неэтерифицированного холестерина и низким содержанием эфиров холестерина, триглицеридов и белка [3, 4]. Среди белков, входящих в состав ЛП-Х, преобладают альбумин и аполипопротеин-С. ЛП-Х был впервые обнаружен в крови больных механической желтухой [3]. Высокие уровни ЛП-Х в крови отмечены также при семейном дефиците фермента лецитинхолестеринацилтрансферазы (ЛХАТ) [3]. Дальнейшие исследования показали наличие ЛП-Х в крови при широком ряде заболеваний печени и желчных протоков, ассоциирующих с холестазом [5]. Кроме того, наши исследования ЛП-Х в крови больных семейной средиземноморской лихорадкой (ССЛ) и ишемическим инсультом, отягощенным СД2 [6].

Цель настоящей работы — анализ крови больных СД2 на наличие ЛП-Х во фракции ЛПНП.

Исследованы образцы сывороток 40 больных СД2 (21 женщина, 19 мужчин), находящихся на лечении в Республиканском медицинском центре «Армения» МЗ РА. Диагноз установлен в соответствии с Международной классификацией болезней (10-e издание). Средний возраст больных СД2 составлял 55±10 лет (М±σ), cредняя давность заболевания — 11±7 лет (М±σ). У 96% больных СД2 наблюдалось тяжелое течение заболевания, сопровождающееся характерными для его поздних этапов осложнениями — диабетической макроангиопатией сосудов нижних конечностей, нефропатией, ретинопатей, нейропатией. Часть пациентов (30%) получали комбинированную антилипидемическую терапию, включая ее медикаментозную (статины) и немедикаментозную (гиполипидемическая диета, регулярные физические упражнения) составляющие. Контрольная группа включала 40 здоровых лиц (20 женщин и 20 мужчин) без наследственной отягощенности по инсультам, инфаркту миокарда, ССЛ, дефициту ЛХАТ или СД. Здоровые лица (ЗЛ) не принимали каких-либо лекарственных препаратов как минимум за 12 мес до начала исследования. Никто из включенных в исследование лиц не страдал заболеваниями печени и желчных протоков, ассоциирующихся с холестазом, ССЛ, семейным дефицитом ЛХАТ, онкологическими или аутоиммунными заболеваниями, не переносил инсульт или инфаркт миокарда, острых инфекционных заболеваний, не подвергался хирургическим операциям и не принимал препараты противовоспалительного или иммуномодуляторного действия как минимум за 12 мес до начала исследования. Пробы крови брали с согласия пациентов и разрешения Комитета по этике Института молекулярной биологии НАН РА.

Обобщенная характеристика вовлеченных в настоящее исследование больных и здоровых лиц приведена в табл. 1.

Забор крови проводили в 9:00 ч натощак пункцией локтевой вены, пробы сразу помещали на лед. В части пробы (цельная кровь) сразу же определяли содержание HbA1c. Другую часть пробы после свертывания крови центрифугировали при 3000g в течение 10 мин и отбирали сыворотку, которую использовали для определения HbA1c, холестерина, триглицеридов, ЛПНП. Образцы сыворотки хранили при –30 °C.

Определение процентного содержания (%) HbA1c в образцах цельной крови проводили колориметрическим методом, используя коммерческий набор реагентов («Biosystems», Коста Брава, Испания), согласно инструкции производителя.

Содержание общего холестерина и триглицеридов в сыворотке определяли колориметрическим методом на автоматическом биохимическом анализаторе Hycel Lisa («Chema Dignostica», Италия) с использованием коммерческих наборов реагентов («Human», Германия), согласно инструкциям производителя и выражали в ммоль/л.

Качественный и количественный анализ ЛПНП, включая ЛП-Х и бета-липопротеин (бета-ЛП), в сыворотке проводили электрофорезом (ЭФ) в бактоагаре («Difco», США), с последующей полианионной преципитацией in situ [7]. ЭФ проводили на стеклянных пластинах (7,7×2,6 см) в 1% бактоагаровом геле толщиной 1,5 мм, содержащем 0,1% гепарин при комнатной температуре. В каждую лунку наносили по 40 мкл сыворотки. Использовали аппаратуру Wide Mini-Sub Cell GT («Bio-Rad Laboratories, Inc.», США) в течение 1,5 ч при напряжении на электродах 120 V в 50 мМ барбиталовом буфере, рН 8,6. По окончании электрофореза гели инкубировали 30 мин при комнатной температуре в 0,1 М растворе MgCl₂, содержащем 0,25% гепарин и 0,9% NaCl. ЛПНП взаимодействуют с гепарином (так называемая полианионная преципитация) и выявляются в виде белых полос на геле. Комплексы ЛПНП с гепарином фиксировали инкубацией в течение 15 мин в 2% водном растворе формальдегида.

Все реактивы, кроме отмеченных, произведены «Sigma-Aldrich Co.» (США).

Относительное содержание ЛП-Х и бета-ЛП определяли полуколичественным методом — измерением интегральных интенсивностей окрашенных полос на геле и выражали в условных единицах (УЕ) интегральной интенсивности (ЕИН). Для этого гели сканировали, а их изображения обрабатывали на компьютере. Соотношениe ЛП-Х/бета-ЛП оценивали сравнением интегральных интенсивностей соответствующих полос в геле и выражали в процентах (%), принимая за 100% сумму интегральных интенсивностей обеих полос (ЛП-Х + бета-ЛП).

Обработку полученных данных проводили с помощью программного пакета GraphPadPrizm 3.03 («GraphPad Softwaer Inc.», США).

У всех 40 больных СД2 в сыворотке обнаруживался аномальный ЛП-Х, чего не наблюдалось у ЗЛ. Отсутствие ЛП-Х в норме было ранее показано как нами, так и другими авторами [5, 6]. Следует отметить, что в сыворотке как больных СД2, так и ЗЛ присутствовали также бета-ЛП. При этом их содержание у больных значительно превышало таковое у ЗЛ, что характерно для СД2 [1, 2]. В процентном соотношении у больных СД2 преобладали бета-ЛП (ЛП-Х/бета-ЛП=25,3%±1,9%/74,7±5,7%). Полученные данные показаны на рисунке

Таким образом, результаты настоящего исследования впервые демонстрируют присутствие ЛП-Х в крови больных СД2.

Как отмечено выше, ЛП-Х обнаруживается в крови при заболеваниях печени и желчных протоков, ассоциирующихся с холестазом, ССЛ, семейном дефиците ЛХАТ и инсультах [5, 6]. Патогенетическая роль и механизмы генерации ЛП-Х при отмеченных заболеваниях до настоящего времени не установлены.

Ряд экспериментальных и клинических данных [8—10] свидетельствуeт о том, что воспалительные процессы играют важную патогенетическую роль как в возникновении диабета, так и в развитии его поздних осложнений. Интересно, что, как показывают результаты исследований invitro, ЛП-Х стимулирует экспрессию моноцитарного хемотаксического белка-1 (MCP-1) [11], а наши имеющиеся данные свидетельствуют о повышенной экспрессии этого провоспалительного хемокина у больных СД2 [12] и его высоких уровнях в крови при данном заболевании [13, 14]. MCP-1 относится к хемокинам — подклассу цитокинов, одна из функций которых состоит в хемотаксисе и активации различных популяций лейкоцитов [15]. MCP-1 продуцируется многими типами клеток, включая мононуклеарные клетки, тучные клетки, Т-клетки, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки костного мозга, эпителиальные клетки и астроциты. Он выступает в роли мощного аттрактанта для моноцитов/макрофагов и активированных Т-лимфоцитов [15]. Так, индуцируемая MCP-1 миграция моноцитов в очаг инсульта, где они трансформируются в макрофаги и далее фагоцитируют поврежденные клетки, вносит существенный вклад в развитие постишемического воспалительного ответа [16]. Таким образом, можно предположить, что ЛП-Х стимулирует развитие воспалительных реакций при СД2, индуцируя экспрессию MCP-1.

С другой стороны, недавно показано, что наличие ЛП-Х в общей популяции ЛПНП препятствует окислению ЛПНП [17]; тем самым ЛП-Х проявляет антиатерогенный эффект [18]. Следовательно, наличие ЛП-Х в популяции ЛПНП при СД2 может быть также обусловлено компенсаторными реакциями организма в ответ на характерное для этой патологии высокое содержание атерогенных ЛПНП [19].

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.С. Бояджян, М.Р. Овсепян

Сбор и обработка материала — М.Г. Оганесян, А.Б. Габриелян, А.А. Геворкян, А.А. Мамиконян

Статистическая обработка данных — М.Г. Эбрагимзаде, А.Б. Габриелян

Написание текста — М.Р. Овсепян

Редактирование — А.С. Бояджян