В последние годы жировая ткань широко используется как источник мезенхимальных стволовых клеток (МСК), применяемых в регенеративной медицине для терапии таких патологических состояний, как дефекты суставной костной ткани, ожоги, артрозы, аутоиммунные заболевания, инфаркт миокарда и т. п. [1]. Множество исследований подтверждают терапевтический эффект МСК в лечении нейродегенеративных, аутоиммунных и воспалительных заболеваний.

Технология получения МСК из жировой ткани включает выделение стромально-васкулярной фракции (Stromal vascular fraction — SVF, СВФ) — смешанной клеточной популяции, состоящей из стромальных/стволовых клеток, эндотелиальных, гладкомышечных клеток, фибробластов, иммунных клеток и др., отделенных от адипоцитов и стромы различными методами. При этом, несмотря на то что большинство исследований посвящено действию МСК, которые представляют собой не более 20% клеточной популяции СВФ [24], терапевтический потенциал последней во многом остается малоисследованным.

Цель настоящей работы — освещение результатов исследований, опубликованных в современной литературе и посвященных механизмам действия СВФ, а также потенциалу ее использования при местном применении.

Клеточный компонент СВФ гетерогенен и меняется в зависимости от места липосакции, пола и возраста донора, а также наличия хронических заболеваний (ожирения) [41, 42]. Основной клеточной фракцией, обладающей терапевтическим эффектом, являются МСК, помимо которых СВФ содержит предшественники эндотелиальных клеток, перициты, моноциты/макрофаги, регуляторные Т-лимфоциты, предшественники гемопоэтических клеток. При этом данные литературы о поверхностных маркерах довольно противоречивы. Большое количество исследований посвящено их описанию [5]. В целом считается, что для негемопоэтической (CD45–) популяции клеток СВФ характерна экспрессия маркеров МСК [4]. Однако существуют сложности в идентификации субпопуляций СВФ [5]. Также интересно, что культивирование способно влиять на процентное соотношение клеток СВФ с тенденцией к снижению содержания стромальных и прогениторных клеток (Ramakrishnan, Boyd, 2018).

Основной механизм действия основан на сложной связи разнородной клеточной популяции СВФ с клетками реципиента, приводящей к стимуляции дифференцировки клеток, ангиогенезу, иммуномодулирующему, антиапоптотическому эффектам и соответственно восстановлению поврежденных клеток и тканей [6].

Иммуномодулирующее действие СВФ определяется присутствием МСК и популяции иммунных клеток. Механизм их действия в данном случае может быть основан как на хоуминге и дифференцировке в сайт-специфичные дифференцированные клетки, стимулировании тканевых стволовых клеток (СК) реципиента, так и на паракринном эффекте. Причем паракринный эффект МСК может обеспечиваться как прямым взаимодействием с СК реципиента и клетками иммунной системы (контакт клетка—клетка), так и за счет растворимых факторов [14]. МСК продуцируют огромное количество факторов роста и цитокинов, обладающих иммуносупрессивным, антиапоптотическим, антифибротическим и ангиогенным действиями. Они способны ингибировать активацию звездчатых клеток печени (основного источника внеклеточного матрикса) и вызывать их Fas/FasL-опосредованный апоптоз [22]. Однако в то же время данные литературы, посвященной спектру выделяемых цитокинов, неоднозначны. Так, G. Kilroy и соавт. [18] в своей работе показали, что различные экзогенные факторы влияют на секрецию цитокинов, в том числе и провоспалительных (хотя большинство литературных источников указывают на синтез противовоспалительных цитокинов). В частности, МСК, подвергаясь воздействию липополисахаридов, продуцируют гемопоэтические (IL-7, M-CSF, G-CSF, GM-CSF) и провоспалительные цитокины (IL-6, IL-8, IL-11, TNF-α) [22]. Имеются сведения о том, что МСК способны ингибировать В-лимфоциты и снижать продукцию иммуноглобулинов [15]. В зависимости от условий культивирования МСК экспрессируют IDO, COX-2, HGF, IL-10, HLA-G и способны индуцировать регуляторные Т-лимфоциты (Tрег) [16, 17], снижая таким образом иммунный ответ. С другой стороны, данные исследований СК свидетельствуют о том, что искусственная среда, создаваемая при культивировании, не может полноценно имитировать естественную нишу. Результатом действия среды могут быть изменение экспрессии генов и соответственно различия в секретируемых веществах.

Регенеративное действие СВФ, реализуемое мультипотентными стволовыми и прогениторными клетками, в целом сходными с МСК костного мозга по морфологии и иммунофенотипу (но с некоторыми различиями в экспрессии у МСК: CD49d+, CD34+, CD106–), связано с их способностью мигрировать в зоны повреждения [36]. Наличие их дифференцировки в местах повреждения является весьма спорным вопросом, так как результаты многих исследований показывают минимальное число МСК в тканях после трансплантации. Так, в экспериментальном лечении инфаркта миокарда лишь около 1% от изначального числа введенных клеток определялось в сердечной мышце [37]. Другие исследования [38] также показывают эффективную миграцию МСК в таргетные ткани с дальнейшим быстрым снижением их количества в течение 1—2 нед. Соответственно паракринный механизм действия в тканях реципиента может быть более вероятным.

Способность СВФ стимулировать ангиогенез доказана во многих работах, что имеет особое значение в лечении состояний, сопровождающихся ишемией и снижением васкуляризации. Механизм реваскуляризации под действием СВФ весьма интересен.

С одной стороны, интрадермальное введение СВФ при лечении ожогов у крыс линии Вистар вызывало достоверное увеличение экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (Vascular endothelial growth factor — VEGF) на 3-и и 10-е сутки по сравнению с контролем [2]. Помимо VEGF, такие факторы ангиогенеза, продуцируемые клетками СВФ, как βFGF, HGF, PDGFB, TGF-β, также участвуют в данном процессе и наряду с возможным влиянием контактов клетка—клетка (МСК-клетки реципиента) стимулируют формирование CD31+ сосудистоподобных структур и их стабилизацию [9].

С другой стороны, результаты исследования Y. Koh и соавт. [8] показали, что формирование сосудистой сети под действием СВФ может не только быть следствием прямого стимулирующего действия на уже имеющиеся клетки и соответственно ангиогенеза, но и развиваться за счет так называемой разборки-сборки сосудистой сети. Известно, что жировая ткань содержит огромное количество кровеносных сосудов, разрушение которых происходит при приготовлении СВФ (разборка сосудистой сети). Затем, при введении СВФ в поврежденную область, разъединенные клетки сосудистой стенки способны совместно с уже имеющимися кровеносными сосудами создавать гибридную сосудистую сеть (сборка). Причем доказано, что взаимоотношения клеток в СВФ обеспечивают соответствующий терапевтический потенциал. Так, процесс разборки-сборки сосудистой сети требовал обязательного присутствия матрикса, эндогенных или экзогенных факторов ангиогенеза и макрофагов [8].

Эффекты СВФ также определяются выживаемостью клеток после трансплантации в условиях ишемии (особенно актуально при проведении процедур липофилинга в сочетании с аутотрансплантацией клеток СВФ). Так, Z. Dong и соавт. [7] выявили, что ASCs, полученные из СВФ, способны выживать в условиях гипоксии и мигрировать в периферические зоны неваскуляризованного жирового трансплантата на 14-е сутки после пересадки, в то время как структуры, отличные от CD34+, отсутствовали уже на 4-е сутки. При этом МСК оказывали иммуномодулирующее действие за счет увеличения числа М2-макрофагов и стимулировали ангиогенез в зоне графта.

Макрофаги, получаемые при выделении СВФ из жировой ткани, обладают противовоспалительным фенотипом (М2) и также могут играть роль в снижении воспаления [3]. M. Zeyda и соавт. [20] определили, что макрофаги, выделенные из SVF жировой ткани, экспрессируют маркеры MR, CD163, интегрин αvβ5, CD209, CD200, CD1β и CD1c и являются М2-подобными макрофагами с высоким уровнем секреции IL-10 и антагониста рецептора IL-1. Однако результаты этого исследования показали даже более высокую базальную и индуцированную секрецию провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6, IL-1, MCP-1 и MIP-1α), чем у М1-макрофагов [20]. Тем не менее известно, что при развитии ожирения фенотип макрофагов переключается с «альтернативно активированных» М2-макрофагов на «классически активированные» М1-макрофаги, продуцирующие провоспалительные цитокины [30], что также может влиять на спектр секретируемых цитокинов.

Наличие фракции Tрег в жировой ткани подтверждается выявлением клеток Foxp3+CD4+ в выделенной СВФ [29]. Tрег-клетки обладают иммуносупрессивным и толерогенным действием и в большом количестве синтезируют IL-10 [31]. Однако эта субпопуляция присутствует в большом количестве у животных (и у человека) с нормальной массой тела, тогда как ожирение вызывает прогрессивное снижение их числа, возможно, за счет ингибирования пролиферации Tрег лептином и TNF-α [31, 32].

Большинство исследований посвящено местному применению СВФ. Однако спектр использования СВФ широк: имеются данные как об изолированном применении СВФ, так и о ее сочетанном применении, например с обогащенной тромбоцитами плазмой или совместно с жировыми графтами. Так, у пациентов со шрамами и дефектом мягких тканей лица был показан достоверно лучший результат комбинированного применения СВФ и жирового графта по сравнению с классическим липофилингом дефектов [10]. При инъекционном введении СВФ в подкожную область пальцев пациентов с системной склеродермией наблюдалось снижение боли, отека, ограничения функциональности и симптомов синдрома Рейно без значимых побочных эффектов [11]. Помимо этого, определялась высокая эффективность внутрисуставного введения аутологичной СВФ у пациентов с остеоартритом [12, 13]. Эндобронхиальное введение активированных МСК СВФ выявило, что у 86% пациентов не было значимых побочных эффектов, таких как аллергические реакции, нарушения функции почек и печени, сердца, сатурации кислорода. У 2 пациентов после первой процедуры наблюдались усиление кашля, жжение в области сердца и снижение сатурации до 94—92%, усиление ЧСС. Однако нежелательные явления были устранены простой подачей кислорода без дополнительного лечения, что, по мнению авторов, могло быть следствием процедуры бронхоскопии, а не клеточной терапии [24].

На практике описанные выше клинические эффекты могут быть реализованы путем инъекционной аутотрансплантации различных продуктов на основе липоаспирата: милли-, микро-, нанографта и СВФ. Результаты наших клинических исследований [43—46] показывают, что применение более трудоемкого и дорогостоящего ферментативного метода выделения клеток СВФ обосновано в тех ситуациях, при которых применение других продуктов на основе аутологичной жировой ткани было нецелесообразным: в 37 случаях — лечение поздних лучевых повреждений прямой кишки, в 21 случае — лечение пациентов с гонартрозом (интраартикулярные инъекции), в 5 случаях — лечение хронических ран нижних конечностей. Важными отличиями СВФ, полученной ферментативным способом, от других продуктов на основе липоаспирата являются отсутствие в продукте фрагментов жировой ткани и тканевого детрита, а также возможность контролировать концентрацию клеточной взвеси. В связи с этим применение СВФ оправдано при внутрисуставном, подслизистом введении, а также при наличии выраженных изменений реципиентной зоны, не позволяющих применять липографтинг.

Выделение СВФ производилось по общепринятой методике [47] путем инкубации в коллагеназе 2-го типа в течение 30 мин при температуре 37 °C. В дальнейшем осуществлялись фильтрация, инактивация коллагеназы и центрифугирование с целью получения клеточного осадка, который ресуспендировался в 1 мл физиологического раствора. Для подсчета количества клеток и их жизнеспособности забиралась аликвота объемом 0,2 мл, а оставшаяся часть разбавлялась в необходимом для инъекций объеме физиологического раствора. Инъекции СВФ проводили с помощью иглы диаметром 27—31G с общим количеством введенных клеток от 15 до 25 млн на 1 пациента.

В группе пациентов с поздними лучевыми повреждениями прямой кишки инъекции СВФ производились в подслизистый слой диффузно папульно. В верхних отделах прямой кишки введение осуществлялось эндоскопически. При наличии поверхностных эрозий (у 5 пациентов) СВФ применялась как монотерапия, а в случае язв или ректовагинальных свищей (у 32) — в сочетании с введением липографта в глубокие слои ректовагинальной перегородки. У всех 37 пациентов произошло заживление дефектов в срок от 3 до 12 мес.

В группе пациентов с гонартрозами СВФ вводилась интраартикулярно в объеме 5 мл. Однократная инъекция приводила к стойкому снижению степени артроза, что сопровождалось уменьшением болевого синдрома, увеличением объема движений в пораженном суставе и, как следствие, нагрузки на конечность.

В 4 случаях пациентам с хроническими ранами нижних конечностей инъекции СВФ назначались при выраженном дефиците мягких тканей в области дефекта с обнажением сухожилий и/или суставной капсулы, в 1 случае — пациентке с хронической раной левой голени при гранулематозе с полиангиитом. У всех больных были отмечены положительная динамика, формирование грануляционной ткани. У 3 из 5 пациентов было достигнуто полное заживление ран.

Таким образом, на основании имеющихся данных литературы и собственного опыта можно заключить, что, несмотря на различие сведений о процентном соотношении клеточных компонентов СВФ и неизученность в полном объеме механизма действия и миграции клеток, СВФ является перспективным методом лечения локальных повреждений мягких тканей, в том числе лучевых поражений. Местное применение СВФ не вызывает существенных побочных эффектов (а имеющиеся связаны, как правило, с процедурой инъекции), относительно безопасно для пациента и может применяться в терапии многих заболеваний, сопровождающихся воспалением и фиброзом, а также дефектами ткани, в том числе глубокими.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Автор, ответственный за переписку: Васильев В.С. —
e-mail: b_b_c_@mail.ru