Морфологические маркеры нитритного повреждения миокарда в эксперименте

Изучение последствий развития гемической (анемической) гипоксии не утрачивает своей актуальности, что обусловлено широким распространением азотсодержащих ксенобиотиков, обладающих выраженными гипоксическими свойствами [1]. При этом современными исследователями большое внимание уделяется прежде всего изучению механизмов токсического воздействия азотсодержащих веществ, в меньшей степени — исследованию компенсаторно-адаптационных реакций в ответ на поступление их в организм. Экзогенными источниками азотсодержащих ксенобиотиков служат удобрения, выбросы промышленных предприятий, тепловых электростанций, а также выхлопы городского транспорта [1]. Большое количество этих веществ является активным компонентом многих фармакологических препаратов, а также входит в состав средств бытовой химии. Важным источником поступления окислов азота в организм являются продукты питания [1, 2]. Кроме того, причиной повсеместного увеличения содержания нитратов в питьевой воде крупных городов и сельской местности служит вымывание азотных удобрений с полей в природные водоемы, а также попадание окислов азота в грунтовые воды с кислотными осадками [1, 3]. Таким образом, общая нагрузка содержащими азот веществами, поступающими в организм человека в составе пищи, воды и вдыхаемого воздуха, может значительно превышать физиологические пределы. Считается, что основное патогенетическое действие этих веществ связано с превращением части гемоглобина в метгемоглобин и образованием NO-комплексов с гемовыми структурами крови (гемоглобином) и тканей (миоглобином), дыхательными ферментами и ферментами антиоксидантной системы, а также регуляторными белками, активизирующими синтез вторичных клеточных мессенджеров, и т. д. [4]. В результате взаимодействия активных форм азота с указанными биологическими молекулами и молекулярными комплексами запускается цепная реакция биохимических преобразований, продукты которых (пероксинитрит, пероксинитритная кислота, перекисные соединения гемоглобина, активные формы кислорода и т. д.) обладают еще большей токсичностью и наряду с нитритным анионом активизируют процессы перекисного окисления липидов клеточных мембран, а также разрушение других клеточных структур [5—8]. Известно, что гипоксия плода приводит к нарушению вегетативной регуляции коронарных сосудов, ухудшению энергетического обмена в митохондриях кардиомиоцитов (КМЦ) и клетках синусного узла, что позволяет прогнозировать более тяжелое течение и высокую смертность при сердечно-сосудистых заболеваниях, которая является одной из наиболее высоких в мире [8—11]. При этом влияние экзогенных нитритов на миокард в настоящее время мало изучено.

Поскольку влияние пролонгированной антенатальной гемической гипоксии на формирование внутренних органов и систем плода, и в частности, на сердце, изучено недостаточно, целью данного исследования явилось изучение морфологических особенностей поражения миокарда у новорожденных крыс в условиях индуцированной нитритной гипоксии.

Экспериментальная часть выполнена на 12 самках 3-месячных белых крыс линии Wistar, массой 180—200 г, и их потомстве — 16 крысятах, массой 9—13 г. В качестве контроля использовали 8 крысят, полученных от 5 интактных самок. Для индукции беременности к каждой самке подсаживали половозрелых беспородных крыс-самцов из расчета 2 самца на 4 самки. Все манипуляции на животных проведены в строгом соответствии с «Правилами проведения качественных клинических испытаний в РФ» (утверждены МЗ РФ и введены в действие с 1 января 1999 г.), приложением 3 к приказу МЗ СССР № 755 от 10.08.77, положениями Хельсинкской декларации (2000 г.) и рекомендациями, содержащимися в директивах Европейского сообщества (№ 86/609ЕС).

На протяжении всей беременности в течение 21 дня самкам ежедневно внутрибрюшинно вводили нитрит натрия (NaNO₂), в дозе 5 мг/100 г массы тела (доза, вызывающая гипоксию средней тяжести) [12]. В течение первых суток жизни у крысят, рожденных указанными самками, после проведения торако- и перикардиотомии под эфирным наркозом сердце извлекали и помещали в кардиоплегический раствор (0,9% КСl при температуре 0 ⁰С), чем достигалась остановка сердца в диастолу.

Разрез сердца для забора материала из левого желудочка проводили с учетом расположения магистральных путей проводящей системы. Осуществляли обзорное окрашивание срезов миокарда гематоксилином и эозином, а также ГОФП-методом (гематоксилин, основной фуксин, пикриновая кислота) с целью выявления очагов острого ишемического и метаболического повреждения [2].

Для гистологических исследований образцы тканей левого желудочка сердца фиксировали в 10% нейтральном формалине и после соответствующей проводки заливали в парафин. Гистологические срезы изготавливали толщиной 10—15 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали с помощью микроскопа Olympus CX-31 (Япония). Подготовку материала для ультрамикроскопического исследования проводили по стандартной методике [9]. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме УМТП-7 (Украина), окрашивали толуидиновым синим, контрастировали цитратом свинца и уранилацетатом. Ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе Selmi (Украина) при ускоряющем напряжении 125 кВ.

Иммуногистохимическую реакцию проводили с помощью антител к гладкомышечному α-актину (α-SMA) и десмину (Desmin) и системы визуализации En vision («Dako»).

Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 6.0. Вычисляли критерий t Стьюдента с определением вероятности различия p по таблице Фишера—Стьюдента.

Масса тела новорожденных крысят, рожденных от самок, беременность которых протекала в условиях моделированной нитритной гипоксии, была статистически значимо более низкой, чем масса при рождении животных контрольной группы (9,6±0,4 и 13,8±0,7 г соответственно; р≤0,05). У новорожденных крысят, перенесших гемическую гипоксию, по сравнению с животными группы контроля была статистически значимо снижена масса сердца c 83,5±0,4 до 51,1±0,6 мг (р≤0,001); снижение показателя составило 29,7%, что подтверждает предположение о замедлении роста тканей сердца под влиянием антенатальной гипоксии.

При световом микроскопическом исследовании в КМЦ отмечались очаги неравномерной окраски, что, по-видимому, обусловлено наличием субсегментарных контрактур КМЦ, представляющих собой чередование мелких участков пересокращения и перерастяжения. Интерстициальная ткань миокарда имела признаки отека, наиболее выраженного вокруг артериол среднего калибра, в прилежащих к ним КМЦ, отмечались очаги гомогенизации цитоплазмы (рис. 1).

При световой микроскопии в миокарде новорожденных крысят независимо от диаметра кровеносных сосудов повсеместно наблюдались явления нарушения гемодинамики: периваскулярный отек, венозное полнокровие, которое чередовалось с запустеванием и спазмом артериол и мелких артерий. Ядра эндотелиоцитов в спазмированных артериолах были визуально смещены ближе к просвету сосудов. Нередко отмечались явления стаза эритроцитов в капиллярах и прекапиллярах, что, очевидно, снижало их пропускную способность и ухудшало трофику миокарда.

Саркоплазма КМЦ содержала фуксинофильный субстрат — индикатор ишемического повреждения, который накапливался вблизи ядер, а также в интерстициальной ткани в виде неравномерных тонких прослоек (рис. 1, б). В целом КМЦ новорожденных выглядели либо неравномерно гипертрофироваными, либо дистрофичными. Вблизи некоторых ядер или внутри них встречались оксифильные включения, похожие на апоптотические тельца.

По данным электронной микроскопии, в большинстве КМЦ новорожденных крысят наблюдались мелкоочаговый и диффузный лизис миофибриллярных пучков, «таяние» миофибрилл. В большей степени были лизированы I-полосы, в которых, как известно, располагаются тонкие (актиновые) филаменты. Миофибриллы выглядели менее плотными, во многих саркомерах выявлялись пустоты, в некоторых КМЦ отмечен тотальный лизис миофиламентов в пределах саркомера. Значительной деструкции подверглись саркомеры в области вставочных дисков и в околоядерной зоне.

Гетерогенные разобщенные митохондрии имели лизированные кристы, но чаще всего эти органеллы были разрушены полностью. В части митохондрий выявлено полное разрушение крист, а их остатки выглядели как крупные вакуоли. Часто выявлялись вакуоли с крошковидным содержимым и несколькими мелкими митохондриями внутри, что свидетельствует о вакуолярном типе дистрофии. Расширение цистерн саркоплазматической сети, литические повреждения митохондрий явились следствием необратимых нарушений проницаемости сарколеммы (рис. 2)

Известно, что во время развития скелетных мышц первой мышечной изоформой является гладкомышечный α-актин. Затем его экспрессия подавляется, и повышается экспрессия кардиального α-актина [13]. При иммуногистохимическом исследовании миокарда встречались КМЦ, в которых в одних случаях отмечалось усиление реакции α-SMA, а в других — ее ослабление (рис. 3),

По данным иммуногистохимического исследования, в норме десмин выявляется в КМЦ в виде поперечно-полосатой исчерченности и является компонентом вставочных дисков [14]. Десмин сохраняет клеточную целостность и обеспечивает устойчивость клетки к механическому стрессу в процессе сокращения-растяжения. Он вовлечен в процесс стабилизации и поддержания целостности миофибрилл, а также поддержания их поперечного прилегания. В образцах миокарда новорожденных крысят выявлены обширные участки отсутствия реакции КМЦ на десмин, так называемые, desmin-free-зоны. Встречались КМЦ, в которых в одних случаях отмечалось усиление реакции, а в других ее ослабление (рис. 4).

Таким образом, полученные морфологические данные с учетом имеющихся в литературе сведений, свидетельствующих о снижении синтеза АТФ клетками и активацией процессов перекисного окисления липидов в условиях гипоксии, указывают, что под влиянием нитритов, и прежде всего, самого нитритного аниона и его метаболитов, происходит изменение свойств клеточных мембран, обусловленное нарушением липидного состава мембран [10, 15]. Разрушение липидного бислоя как клеточных, так и внутриклеточных мембран приводит к патологическому увеличению их проницаемости, и как следствие повышенной деструкции митохондриальных мембран в условиях дефицита кислорода.

Антенатальная гемическая гипоксия, вызванная применением нитрита натрия, оказывает выраженное патологическое воздействие на миокард новорожденных крыс. Основные морфологические признаки этого процесса приводят к гипоксическому и ишемическому повреждению миокарда новорожденных крыс, что подтверждается явлениями смешанной дистрофии, отека и деструкции сократительных КМЦ, лизиса миофибрилл, контрактурных изменений, периваскулярного отека, а также гемодинамических нарушений, проявлявшихся в виде капиллярного полнокровия, запустевания и спазма артериол.

Характерной морфологической особенностью необратимых гипоксических изменений, индуцированных нитритом натрия, является наличие ультраструктурных повреждений митохондрий сократительных КМЦ по литическому и вакуолярному типам, проявляющихся в виде нарушения целостности их мембран, разрушения митохондриальных крист, разобщенности межмитохондриальных контактов. Это сопровождалось снижением экспрессии десмина и неравномерной экспрессией α-SMA — предшественника саркомерного актина как в самих КМЦ, так и в интерстициальной ткани. Данные явления отражают нарушения формирования цитоскелета миокарда и сократительного аппарата КМЦ новорожденных при наличии признаков ремоделирования миокарда, что негативно влияет на пространственные взаимосвязи сократительного аппарата КМЦ и может ухудшать их сократительную функцию [16]. Кроме того, использование иммуногистохимической методики, позволяющей определять распределение десмина в КМЦ, дает возможность выявлять очаги острых ишемических и гипоксических повреждений миокарда.

Авторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.

Сведения об авторах

Сатаева Т.П. — к.м.н., доц. каф. биологии

Третьякова О.С. — д.м.н., проф., зав. каф. общественного здоровья и здравоохранения

Контактная информация:

Заднипряный Игорь Владимирович — д.м.н., проф., зав. каф. топографической анатомии человека; e-mail: zadnipryany@gmail.com