Профилактика и коррекция антрациклиновой ангиопатии в эксперименте

Несмотря на значительные достижения в области молекулярной онкологии, биохимии и патофизиологии опухолевых клеток и исследований механизмов взаимодействия опухоли с окружающими тканями, наблюдаемые в последнее десятилетие, существенного прорыва в создании высокоселективных, таргетных молекул, способных полностью вытеснить из обращения системные цитостатические лекарственные препараты, не произошло. Удельный вес таргетных препаратов в структуре противоопухолевой терапии остается невысоким, что объясняется не только их высокой стоимостью, но и слабой корреляцией между впечатляющими результатами, достигнутыми на экспериментальном этапе изучения, и наблюдениями в клинической практике [1—3]. Таким образом, использование в лечении новообразований классических системных противоопухолевых средств и проблема их углубленного клинического изучения остаются актуальными в настоящее время.

Основными направлениями развития химиотерапии являются увеличение избирательности ее действия на злокачественные клетки и ассоциированные с ними элементы стромы опухоли и минимизация системного воздействия используемых препаратов на различные органы и ткани, напрямую не вовлеченные в патологический процесс. При этом различные осложнения лекарственной терапии опухолей остаются весьма распространенным явлением в клинической практике, накладывают серьезные ограничения на тактику лечения пациентов и ухудшают прогноз заболевания.

Наиболее остро эти вопросы стоят в отношении применения доксорубицина — представителя группы антрациклиновых антибиотиков, высокая эффективность которого в отношении широкого спектра опухолей подтверждена в ходе многочисленных экспериментальных и клинических исследований [4, 5]. Критическим моментом для назначения доксорубицина является его выраженная токсичность в отношении сердечно-сосудистой системы. Доксорубицининдуцированная кардиотоксичность является одной из наиболее частых причин отмены препарата, увеличения длительности интервала времени до его последующего введения или снижения эффективной дозы. Это приводит к изменению схемы терапии и ухудшению прогноза лечения. В качестве средств фармакологической кардиопротекции широко используют арсенал антигипертензивных и кардиотонических препаратов (ингибиторы АПФ, бета-блокаторы), заимствованных из кардиологической практики [6, 7]. Однако их лекарственное взаимодействие с цитостатическими препаратами изучено слабо и эффективность применения недостаточна. При этом практически незамеченной остается проблема ангиопротекции и, в частности, медикаментозной коррекции эндотелиальной дисфункции, являющейся триггером поражения системы кровообращения антрациклиновыми антибиотиками [8—10].

Вышеизложенное делает актуальной проблему поиска и апробации новых фармакологических средств, обеспечивающих не только защиту миокарда при проведении химиотерапии с использованием доксорубицина, но и общее ангиопротективное действие.

Целью настоящего исследования являлось изучение применения нового комбинированного инфузионного раствора натрия-L-аргинина сукцината (торговое название — «Унифузол», ООО «НТФФ «ПОЛИСАН», Россия) для профилактики и лечения ангиотоксического действия доксорубицина в остром эксперименте in vivo.

Эксперимент выполнен на 102 самцах-альбиносах серых крыс массой тела на момент включения в исследование 200—220 г., разведения ФГУП ПЛЖ «Рапполово» (Ленинградская область). Содержание, питание и контроль состояния животных, все виды манипуляций и эвтаназию проводили в соответствии с нормами биоэтики и законодательства Российской Федерации, регламентирующими работы с использованием лабораторных животных.

Методом случайных чисел животные были разделены на группы:

— контроль (n=12) — интактные животные без признаков инфекционной и/или соматической патологии для анализа нормальных показателей;

— доксорубицин (n=45) — животные, которым вводили однократно внутрибрюшинно препарат Доксорубицин Эбеве («EBEWE Pharma Ges. mbH Nfg. KG», Австрия) в дозе 12,6 мг/кг (LD₅₀ для крыс по данным фирмы-производителя);

— унифузол (n=45) — животные, которым вводили однократно внутрибрюшинно доксорубицин и затем в течение 10 сут проводили лечение препаратом унифузол в объеме 2,5 мл внутривенно один раз в сутки.

Взятие крови для анализа проводили на 3-и, 10-е и 28-е сутки после введения доксорубицина путем транскутанной пункции сердца животного в условиях общего обезболивания (инъекционный золетиловый наркоз, 0,7 мл/кг массы тела, внутрибрюшинно) с помощью вакуумной системы Monovette («SARSTEDT», Германия) с антикоагулянтом (К3-ЭДТА) в объеме 6 мл. Обработку материала осуществляли сразу после взятия. Для отделения от плазмы крови эритроцитов и лейкоцитов проводили ее центрифугирование с ускорением 240 g в течение 7 мин и последующим перенесением плазмы в другую пластиковую пробирку. Повторным центрифугированием с ускорением 1200 g в течение 15 мин получали плазму крови полностью свободную от форменных элементов. Полученный материал исследовали либо немедленно, либо замораживали при –20 °С для последующего иммуноферментного анализа на срок, не превышающий 6 мес.

Выраженность ангиотоксического действия доксорубицина и эффективность проводимого лечения оценивали по динамике маркеров эндотелиальной дисфункции и балансу про- и антивоспалительных цитокинов. Анализ сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), тканевого активатора плазминогена (tPA), ингибитора активатора плазминогена 1-го типа (PAI-1), оксида азота II (NO), эндотелина-1 (ЭТ-1), концентрацию интерлейкинов 1β и 10 (IL-1β и IL-10) и фактора некроза опухолей-альфа (TNF-α) определяли методом иммуноферментного анализа при помощи наборов реактивов компаний «Cusabio» (Китай) и «Technoclone» (Австрия) в соответствии с инструкцией фирм-производителей. Кроме того, методом световой микроскопии определяли содержание в крови десквамированных эндотелиоцитов по методике Н. Sinzinger [11].

Статистическую обработку проводили при помощи программы SPSS. Данные приведены в виде M±SE (средняя арифметическая ± ошибка средней арифметической). Проверка характера распределения данных проводилась путем расчета критерия Колмогорова—Смирнова. Сравнение средних данных независимых выборок осуществляли при помощи t-критерия Стьюдента (при нормальном характере распределения вариант в выборочной совокупности) и U-критерия Манна—Уитни (при распределении вариант в выборочной совокупности, отличном от нормального). Установление корреляций между показателями различных групп проводили по критерию Спирмена. Достоверным уровнем различий принимали вероятность не менее 95% (р<0,05), что является стандартом в медико-биологических исследованиях.

Введение подопытным животным доксорубицина приводило к значительным нарушениям сердечно-сосудистой, гепатобилиарной, дыхательной и мочевыделительной систем, наиболее выраженным в остром периоде — первые 72 ч от момента введения препарата. Полиорганная дисфункция, развившаяся вследствие введения доксорубицина, привела к гибели более 50% животных, не получивших лечение (табл. 1). Применение унифузола оказало выраженный терапевтический эффект, что выражалось в статистически значимом снижении показателя общей летальности крыс в 2,2 раза (p<0,05) по сравнению с группой животных, не получивших фармакологической поддержки (27 и 58% соответственно). При этом достоверное снижение показателя летальности в группе унифузол по сравнению с группой доксорубицин отмечалось прежде всего в отсроченном периоде эксперимента (с 11-х по 28-е сутки), когда гибель животных была обусловлена прежде всего антрациклиновой кардиомиопатией, а не острой интоксикацией (см. рисунок).

Интоксикация доксорубицином сопровождалась лабораторными признаками воспаления в организме подопытных животных: начиная с 3-х суток и на протяжении всего периода эксперимента регистрировалось достоверное повышение уровней провоспалительных цитокинов (TNF-α и IL-1β) в крови животных обеих экспериментальных групп, наиболее выраженное в группе, не получившей фармакологической поддержки унифузолом (табл. 2). При этом в группе доксорубицин повышение концентрации в крови провоспалительных белков сопровождалось снижением противовоспалительного цитокина IL-10 на 3-и и 10-е сутки, в то время как в группе унифузол уровень IL-10 сохранялся на уровне контрольных значений (3-и сутки), а в последующем увеличивался (10-е сутки). К 28-му дню наблюдений IL-10 в обеих экспериментальных группах не имел достоверных различий с показателями интактных крыс.

Патогенез доксорубицининдуцированной ангиотоксичности включал в себя структурно-функциональные нарушения эндотелия (табл. 3), приводящие к развитию синдрома «эндотелиальной дисфункции» — изменению баланса между его вазоконстрикторным и вазодилатирующим, про- и антигемостатическим потенциалами. Это проявлялось в угнетении продукции VEGF — естественного митогена и стимулятора метаболизма эндотелиоцитов и tPA — важнейшего компонента эндоваскулярного пристеночного фибринолиза и маркера нормальной активности эндотелиоцитов. Одновременно отмечалось уменьшение продукции монооксида азота (NO) с одновременным увеличением синтеза и секреции вазоконстрикторных соединений (эндотелин-1) и провоспалительных цитокинов (IL-1β, TNF-α) (см. табл. 2, 3).

Отрицательная динамика сывороточных маркеров эндотелиальной дисфункции подтверждалась данными морфологического анализа, указывающими на активацию клеточной гибели эндотелиоцитов [(лавинообразное увеличение количества десквамированных клеток (ЦЭЦ)] в крови — свидетельство прямого токсического воздействия доксорубицина на эндотелий сосудов (см. табл. 3).

Проводимая 10-дневная терапия унифузолом приводила к выраженной, статистически достоверной нормализации практически всех изучаемых в рамках данного исследования показателей структурно-функционального состояния эндотелиоцитов подопытных животных (см. табл. 3).

Прежде всего наблюдалось выраженное увеличение продукции NO в крови животных с антрациклиновой ангиопатией, получавших унифузол, на уровне тенденции уже на 3-и сутки исследования (в 2,1 раза по сравнению с группой нелеченных животных, p>0,05) и достоверно на 10-е сутки — время окончания терапии (в 4,5 раза по сравнению с группой нелеченных животных, p<0,01), обратно коррелирующее с продукцией вазоконстрикторного соединения — эндотелина-1 (r=0,67, p<0,05; см. табл. 3). Уровень эндотелина-1 у животных с доксорубицининдуцированной ангиопатией на фоне лечения унифузолом снизился на 20% (3-и сутки эксперимента) и на 40% (10-е сутки эксперимента, p<0,05), что свидетельствует о значительном эндотелиопротективном эффекте исследуемого препарата.

Применение унифузола также способствовало увеличению продукции VEGF, tPA и IL-10 с одновременным ингибированием синтеза и провоспалительных цитокинов, что свидетельствует о нормализации функциональной активности эндотелиоцитов и нарастании их репаративного потенциала (см. табл. 2, 3).

Унифузол эффективно предотвращал доксорубицининдуцированную клеточную гибель эндотелиоцитов (уменьшение уровня ЦЭЦ в крови крыс, достоверно отличающееся от показателей животных группы доксорубицин с 10-го дня эксперимента в 2,7 раза, p<0,001) (см. табл. 3).

1. Применение раствора натрия-L-аргинина сукцината (унифузол) уменьшает токсическое действие доксорубицина на эндотелий сосудов, уменьшая продукцию вазоконстрикторных соединений и увеличивая синтез регионарных вазодилататоров и фибринолитиков.

2. Выраженное эндотелиопротективное действие исследуемого препарата является патогенетическим обоснованием для дальнейшего изучения унифузола в качестве комплексного средства для кардио- и ангиопротекции при патологии сердечно-сосудистой системы различной этиологии.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: В.В.В., А.П.Т., А.Л.К., А.Ю.П., А.Г.В.

Сбор и обработка материала: В.В.В., А.П.Т., А.Г.В.

Статистическая обработка: А.П.Т.

Написание текста: В.В.В., А.П.Т.

Редактирование: А.Л.К.

Конфликт интересов отсутствует.