Иммуноцитохимическое определение важнейших факторов прогноза у больных раком молочной железы

Ежегодно в России регистрируются около 50 тыс. новых случаев рака молочной железы (РМЖ). Больные с таким заболеванием требуют комплексного или комбинированного лечения, неотъемлемой частью которого является антигормональная и химиотерапия [1]. Современные тенденции в лечении характеризуются стремлением к максимальному улучшению качества жизни больных за счет сокращения объема оперативного вмешательства и использования высокоэффективных химиопрепаратов. Установлено, что больным с гормонположительным статусом опухоли в 50—60% случаев успешно проводится антигормональная терапия [2, 3]. Лучшие результаты эндокринной терапии (главным образом тамоксифеном) РМЖ достигаются при РЭ (+) (рецепторы эстрогенов) и РП (+) (рецепторы прогестерона). Непосредственные положительные результаты лечения фиксируются у 77% больных, а 5-летняя безрецидивная выживаемость возрастает на 20—30%. Рецепторположительные опухоли молочной железы имеют более высокую дифференцировку и более благоприятное клиническое течение по сравнению с другими группами новообразований. Для установления положительного гормонального статуса опухоли достаточно иметь 5—10% четко окрашенных клеток [2—6].

Иммуногистохимический (ИГХ) метод, получивший наибольшее распространение в клинической практике, стал золотым стандартом в определении РЭ, РП и онкопротеина HER2/neu в клетках РМЖ. Метод позволяет определить число положительно реагирующих клеток, оценить степень интенсивности реакции и дать точную рецепторную характеристику опухоли. Однако наряду с достоинствами он имеет ряд недостатков: маскировка антигена и длительность времени при приготовлении препаратов, необходимость достаточного объема биологического материала, что в ряде случаев делает выполнение данного исследования на этапе предоперационного обследования затруднительным [7, 8]. Дооперационное ИГХ-исследование проводят на столбиках ткани, полученных при cor-биопсии. Многие специалисты сетуют на преобладание стромальных и на скудность клеточных элементов в препаратах. При этом следует отметить, что по сравнению с тонкоигольной аспирационной биопсией (ТАБ), указанная процедура является более травматичной [8].

В качестве альтернативы ИГХ-методу все большее практическое значение приобретает метод определения экспрессии молекулярных маркеров на клеточном уровне — иммуноцитохимический (ИЦХ). Материал для такого исследования может быть получен при ТАБ — простой, малотравматичной процедуре, позволяющей получить полноценный клеточный материал, а применение жидкостной технологии получения цитологических препаратов дает возможность готовить высококачественные монослойные мазки. Кроме того, ИЦХ не требует больших временны́х затрат и может быть выполнена в течение одного рабочего дня [7—9].

Сопоставление результатов экспрессии молекулярных маркеров при ИГХ- и ИЦХ-методах проводилось рядом исследователей: совпадение, по данным разных авторов, составило от 61 до 94% [10—16].

Целью настоящего исследования явилось определение возможности ИЦХ-метода в оценке маркеров гормонального и прогностического статуса при РМЖ и сравнение их с результатами ИГХ-исследования.

Выполнено 156 ИЦХ- и 176 ИГХ-исследований (132 ИГХ-исследований удаленной опухоли и 44 ИГХ cor-биопсии) от 39 больных РМЖ. До операции проведено полихимиотерапевтическое (ПХТ), лучевое (ЛТ) и антигормональное лечение 10 пациенткам. Возраст пациенток варьировал от 23 до 84 лет (медиана 53,7 года). Все ИЦХ-исследования проводились на материале, полученном путем соскоба с разреза опухоли, выполненного непосредственно после операции и помещенного в питательную среду накопления (V =800 мкл).

Клинические стадии заболевания распределились следующим образом: Tis — 1 больная, Т1 — 15, Т2 — 16, Т3 — 0, Т4 — 7 пациенток (табл. 1).

У 35 (90%) из 39 больных гистологически выявлен инфильтративный протоковый рак (ИПР), у 2 — инфильтративный дольковый (ИДР), в 1 случае — метапластический комбинированный вариант с элементами железистого и плоскоклеточного рака и в 1 — медуллярная карцинома (табл. 2).

В работе были использованы моноклональные кроличьи и мышиные антитела («Dako»): к рецепторам эстрогенов (клон 1D5, разведение 1:35), к рецепторам прогестерона (клон 636, разведение 1:50), к белку пролиферативной активности Ki-67 (клон MiB-1, разведение 1:50—1:75), онкопротеину с-erbB-2 (разведение 1:250—1:350). Для визуализации иммунной реакции использовали систему LSAB + Detection System («Dako») согласно инструкции, выявление пероксидазной активности проводили с помощью 3,3-диаминобензидина (DAB), цитопрепараты докрашивали гематоксилином Майера. Реакции проводились на цитоспиновых монослойных мазках. Подсчет иммунопозитивных клеток проводили в областях с максимальным проявлением диаминобензидина на 300—500 опухолевых клеток на микроскопе «Zeiss» (Германия).

Для оценки ИЦХ-результатов экспрессии РЭ и РП использовалась балльная шкала оценки «Dako» Cytomation, где учитывается не только число окрашенных клеток, но и степень выраженности экспрессии антигена.

Интенсивность окрашивания — баллы IS:

— отсутствие окрашивания — 0;

— окрашивание слабой интенсивности — 1;

— окрашивание умеренной интенсивности — 2;

— окрашивание сильной интенсивности — 3.

Количество окрашенных ядер опухолевых клеток — баллы PS:

— отсутствие окрашивания — 0;

— от 0 до 1% — 1;

— от 1 до 10% — 2;

— от 10 до 33% — 3;

— от 33 до 66% — 4;

— от 66 до 100% — 5.

Определение общего балла TS:

TS = IS + PS

Интерпретация результатов:

— 0—2 балла — негативный результат;

— 3 балла и более — позитивный результат.

Для оценки экспрессии HER2 используют следующие критерии (табл. 3).

При оценке экспрессии 4 маркеров (ЭР, ПР, Ki-67, с-erbB-2) ИЦХ-исследования совпали с ИГХ (независимо от материала исследования: на материале cor-биопсии или на фрагменте опухоли после операции) в 30 (77%) из 39 наблюдений (рис. 1, 2, 3, 4). Совпадение экспрессии по 3—4 маркерам наблюдали в 37 (95%) из 39 случаев.

В 11 наблюдениях ИГХ-исследование проводилось до начала лечения на «столбике» опухоли и при сопоставлении с ИЦХ результаты совпали только в 45,5% наблюдений (в 5 из 11). Аналогичный анализ ИЦХ и ИГХ после удаления опухоли выявил совпадение в 82% наблюдений (27 из 33) (табл. 4).

У 6 пациенток с РМЖ проведены три исследования:

— ИГХ cor-биопсии опухоли;

— ИГХ удаленной опухоли;

— ИЦХ соскоба с разреза опухоли во время операции.

В результате ИЦХ и ИГХ дооперационной cor-биопсии совпали в 1 (17%) из 6 наблюдений, ИЦХ и ИГХ удаленной опухоли — в 5 (83%) из 6 наблюдений, ИГХ cor-биопсии и ИГХ опухоли — только в 2 (33%) из 6 наблюдений. При этом необходимо отметить, что основной массе пациенток, которым проводилась cor-биопсия, между исследованием и хирургическим вмешательством проводилось неоадъювантное лечение, что, несомненно, могло повлиять на рецепторный статус новообразования.

При анализе ИЦХ- и ИГХ-методов (независимо от материала исследования) в оценке гормонального статуса при РМЖ положительная экспрессия РЭ при ИЦХ отмечалась в 69,2%, при ИГХ — в 74,3%, экспрессия РП при ИЦХ выявлена в 54%, при ИГХ — в 58,9%, выраженная положительная экспрессия онкопротеина (+3) с-erbB-2 на цитоспиновых цитологических препаратах наблюдалась в 13% исследований, на гистопрепаратах — в 8%. В 79% наблюдений отмечено совпадение ИЦХ и ИГХ в определении белка пролиферативной активности Ki-67 практически абсолютное, в 21% — показатели ИЦХ были ниже, чем ИГХ на 10—15% (табл. 5).

Сопоставление результатов ИЦХ- и ИГХ-исследований у 39 больных РМЖ показало их совпадение при определении рецепторов эстрогенов и прогестерона в 89,7 и 84,6% соответственно, пролиферативной активности (Ki-67) — в 79%, онкопротеина с-erbB-2 в 95% наблюдений.

Рядом исследователей отмечено, что мембранные и цитоплазматические маркеры чаще положительно окрашиваются при ИЦХ в цитологических препаратах, чем в гистологических при ИГХ. Возможно, это связано с более щадящей обработкой цитопрепаратов, отсутствием потери и маскировки антигенов при проводке и депарафинизации материала с использованием агрессивных химических реагентов, что негативно сказывается на мембранных и цитоплазматических рецепторах. Несовпадение экспрессии белка пролиферативной активности в 21% наблюдений при ИЦХ- и ИГХ-исследований объясняется асинхронностью митотической активности в опухолевых клетках и, как следствие, значительным разбросом в значениях индекса Ki-67 в пределах одной опухоли.

Необходимо отметить влияние проводимых до операции ПХТ и ЛТ на результаты ИЦХ- и ИГХ-исследований: из 10 пациенток, которым проводилось предоперационное лечение, у 5 наблюдали расхождения результатов ИЦХ и ИГХ по 1—2 маркерам. Если исключить из расчета сопоставления ИЦХ и ИГХ у таких больных, то совпадение двух методов (ИЦХ и ИГХ) повышается с 77 до 86%.

Пример 1. Пациентка К., 71 год, диагноз: РМЖ Т4N2M0. ИГХ cor-биопсии опухоли: ЭР — 0 баллов, ПР — 0 баллов, белок Ki-67 — 38%, онкопротеин с-erbB-2 — (+3).

Проведено 4 курса ПХТ: трастузумаб + лапатиниб. ИЦХ-исследование соскоба с опухоли: ЭР — 0 баллов, ПР — 0 баллов, белок Ki-67 — 5%, онкопротеин с-erbB-2 — (0). Произошла блокада антигенного белка с-erbB-2 иммуноглобулинами (трастузумаб) на поверхности клеточной мембраны, в результате чего онкопротеин HER2/neu не выявляется.

Пример 2. Пациентка А., 58 лет, диагноз: РМЖ Т2N0M0. ИГХ cor-биопсии опухоли: ЭР — 6 баллов, ПР — 3 балла, белок Ki-67 — 40%, онкопротеин с-erbB-2 — (0).

Проведено 6 курсов ПХТ: FAC + лучевая терапия. ИЦХ-исследование соскоба с опухоли: ЭР— 0 баллов, ПР — 0 баллов, белок Ki-67 — 5%, онкопротеин с-erbB-2  — (0). ИГХ-исследование удаленной опухоли: ЭР — 0 баллов, ПР — 0 баллов, белок Ki-67 — 10%, онкопротеин с-erbB-2 — (0).

В исследовании отчетливо демонстрируется воздействие и блокада антигенных белков при ПХТ и ЛТ.

Изучение корреляции экспрессии биологических маркеров при ИЦХ- и ИГХ-исследованиях проводилось рядом отечественных и зарубежных исследователей. Авторы считают, что цитологическое определение прогностических маркеров при РМЖ коррелирует с гистологическим и может иметь большой «вес» в выборе метода лечения, в том числе и у пациенток при диссеминированном раке и которым показана неоадъювантная терапия.

На основании вышеизложенного в качестве альтернативы ИГХ-методу может быть предложен метод определения экспрессии молекулярных маркеров на цитологических препаратах — иммуноцитохимический. Отсутствие маскировки и потери антигенов, экономия дорогих сывороток и сокращение времени проведения исследования делает ценность ИЦХ-метода неоспоримой. Особенно это важно для пациенток, которым первым этапом лечения показана не операция, а химиотерапия или лучевая терапия, при исходно диссеминированном раке или прогрессировании ранее пролеченной опухоли, а также в случаях, когда хирургическое вмешательство противопоказано в связи с сопутствующей патологией.