Введение

Модели кожной инфекции мышей и крыс являются мощным инструментом для изучения механизмов иммунной защиты, определения мишеней для терапии кожных инфекций [1], а также степени патогенности штаммов микроорганизмов и эффективности терапии при разработке новых препаратов [2, 3]. Модели раневой инфекции на мышах воспроизводят многочисленные особенности инфицированных человеческих ран, такие как гнойные выделения, некротические остатки и замедленное заживление ран. Модель мышиной раневой инфекции реализуется путем инокуляции бактерий в глубокую операционную или эксцизионную рану [4].

Инфекции кожи у пациентов часто возникают в ранах после хирургического вмешательства, при ожогах, в различного рода язвах (в т.ч. диабетических), у пациентов со сниженным иммунитетом: принимающих иммуносупрессивную терапию, пациентов с хроническими заболеваниями, при длительной терапии антибиотиками, обширными ожогами. Тяжелые инвазивные инфекции мягких тканей могут вызывать некротизирующий фасциит и синдром токсического шока [5, 6]. Были описаны случаи развития аномалий мозга, связанные с кожной инфекцией, вызванной стрептококками группы А (GAS) за счет прямого проникновения патогенов в мозг или мозговые оболочки (абсцесс мозга, менингит), выработки аутоантител (детские нейропсихические расстройства), сепсиса без проникновения патогенов в мозг (сепсис-ассоциированная энцефалопатия) [7].

Такие инфекции являются причиной значительной смертности и заболеваемости среди людей и часто приводят к длительному пребыванию в больнице, проникая во внутренние органы, и даже в ткани центральной нервной системы и приводят к увеличению расходов на лечение.

Условно патогенные микроорганизмы опасны при снижении защитного потенциала организма, которое как раз наблюдается в послеоперационном периоде, обширных ожогах, заболеваниях эндокринной системы, и прочих иммунодефицитных состояниях [7].

Инфекции кожного покрова бывают вызваны как грамотрицательными, так и грамположительными микроорганизмами, среди которых одну из ведущих позиций занимает Staphylococcus aureus [8]. Причем S. aureus является наиболее распространенным патогеном, выделяемым из инфицированных кожных ран пациентов с диабетом, которые особенно подвержены развитию хронических, незаживающих ран [1, 9].

Важной проблемой, которая увеличивает смертность пациентов — это антибиотикорезистентность микроорганизмов. Чаще всего раневые инфекции вызывают стафилококки (в первую очередь, Staphylococcus aureus, а также S. epidermidis) стрептококки группы А (Streptococcus spp., S. pyogenes), Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Acinetobacter spp., Pseudomonas aeruginosa. В зависимости от типа раны, особенностей пациента и его окружения в ранах могут доминировать разные микроорганизмы, включая полирезистентные штаммы, что делает терапию малоэффективной или неэффективной вовсе. Кроме того, в процессе длительного лечения ранее чувствительные микроорганизмы могут развивать устойчивость к препаратам, что часто ведет к возникновению множественной устойчивости и даже панрезистентности.

Заражение этими микроорганизмами происходит, как правило, в стационарах (особенно при длительной госпитализации) — и в коллективах. Специфика флоры ран зависит от стационара и окружения пациента (если проходит амбулаторное лечение) [1, 8].

Особенно опасны штаммы, формирующие биопленки в раневом ложе, поскольку они с трудом поддаются терапии современными антимикробными препаратами, поэтому крайне важна разработка новых стратегий, предотвращающих формирование биопленок или вызывающих их разрушение [10, 11].

Лечение хронических язвенных ран является критической проблемой здравоохранения во всем мире, связанной с высоким риском заболеваемости и смертности. Например, диабет является важным фактором предрасположенности к образованию язв кожи, особенно на стопах, что часто осложняется инфекцией. При синдроме диабетической стопы (СДС) можно обнаружить несколько патогенов, но наиболее распространенным является S. aureus. Он обычно образует биопленки, уклоняясь от действия как иммунной системы хозяина, так и антибиотиков, что затрудняет современные стратегии лечения. Отсутствие эффективного лечения еще больше усугубляется, если учесть тревожный рост распространенности метициллинрезистентного S. aureus (MRSA) при СДС. Таким образом, разработка новых терапевтических стратегий для СДС имеет решающее значение, для чего срочно требуются соответствующие и надежные модели [9].

Одним из важных аспектов является разработка новых форм уже зарегистрированных ранее препаратов на основе их активной фармацевтической субстанции (АФС). Например, таблетированная форма препарата, который уже показал эффективность, часто бывает недостаточно результативна для пациентов, находящихся в тяжелом состоянии, в том числе на ИВЛ, так как нарушается всасываемость препарата из ЖКТ. В некоторых случаях нет необходимости введения препаратов внутрь при кожных инфекциях. В этом случае наружная форма в виде мази или порошка может быть применена в рамках как монотерапии, так и в комплексе с приемом внутрь.

Разработка моделей кожной инфекции с целью испытаний новых форм уже зарегистрированных ранее препаратов является важным звеном доклинических исследований.

В литературе описано три основных типа моделей кожной инфекции, различающихся по способу внесения патогена: нанесение на поверхность кожи, внутрикожное/подкожное введение, и введение в открытую рану (рис. 1). По типу получаемых раневых участков модели можно классифицировать на: инфекции кожного мешочка, модели эксцизионных ран, а также ожоговые модели (ожоги 2-й степени).

Рис. 1. Виды кожных инфекций по способу внесения. Раневая инфекция (2) предполагает инфицирование всей толщины кожи и подкожной клетчатки [1].

Также различают модели с иммуносупрессией и без нее. Возможность их применения определяется степенью патогенности исследуемых штаммов. Модель с иммуносупрессией не может применяться для исследования микроорганизмов с высокой вирулентностью, поскольку их летальная доза для иммуносупрессированных модельных животных может быть крайне низка, а гибель может наступать в течение суток, и даже часов. Кроме того, при отсутствии или близких к нулю концентрациях лейкоцитов невозможно оценить воздействие на них патогенных микроорганизмов, изучить механизмы инфекционного процесса, а некоторые экспериментальные препараты едва успевают оказать воздействие на патогены.

Тем не менее, важно отметить, что между кожей грызунов и человека существуют иммунологические и физиологические различия. В первую очередь, эти отличия заключаются в том, что в отличие от кожи человека, кожа грызунов заживает в первую очередь за счет стягивания кожи над раневым ложем, а не формирования грануляционной ткани и эпителизации [12].

Это связано с тем, что кожа грызунов богата дендритными эпидермальными Т-клетками (Dendritic epidermal T-cells (DETC)), которые отвечают за обнаружение повреждений кожи, способствуют заживлению ран (в первую очередь, стягивание) и укрепляют барьерную функцию кожи [13]. Среди таких Т-клеток различают первичные клетки и клетки памяти. В эпидермисе мыши 5% — это иммунные клетки, такие как клетки Лангерганса и Т-клетки. Большинство резидентных в эпидермисе Т-клеток — это γδ Т-клетки сильно разветвленной древовидной формы, простирающие дендриты как базально, так и апикально; вместе с клетками Лангерганса эти γδ Т-клетки образуют сеть в слоях эпидермиса. Считается, что DETC распознают определенный набор «стрессовых антигенов», индуцированных на поврежденных кератиноцитах при помощи TCR, независимым от главного комплекса гистосовместимости (MHC) способом [1, 14]. Стимуляция рецепторов T-клеток (TCR) и повреждение кожи вызывают выработку IL-17A подгруппой DETC. Эксперименты показали, что IL-17A крайне важен для заживления ран. После повреждения кожи IL-17A, производимый DETC, индуцирует экспрессию множественных защитных молекул хозяина в эпидермальных кератиноцитах, способствуя заживлению. Эти результаты подтверждают важную и уникальную роль DETC, продуцирующих IL-17A, в барьерной функции эпидермиса и заживлении ран у грызунов [13]. Такие отличия накладывают определенные ограничения при разработке моделей раневых инфекций планировании экспериментов.

В первую очередь требуется предотвратить стягивание кожи над раневым ложем. Это может быть достигнуто при помощи двух основных подходов. Первый — это иммуносупрессия, при которой нарушаются механизмы заживления (например, модели диабетических язв, [9] и др. Второй — наложение физических преград, препятствующих сокращению кожи (применяется для изучения высоковирулентных штаммов упомянутых выше групп, где не подходит модель с иммуносупрессией) [1].

На основе литературных источников были составлены методические рекомендации по основным методам разработки и использования моделей раневых инфекций для доклинических испытаний препаратов и их новых лекарственных форм на мышах и крысах.

Животные: линии и содержание

Эксперименты на животных должны проводиться в соответствии с рекомендациями Коллегии Евразийской Экономической Комиссии от 22.12.2020, №33, Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 № 81: [15, 16], и Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [17].

Для разработки моделей раневой инфекции используют мышей и крыс различного возраста массой 18—22 г (мыши) и 180—220 г (крысы) [2].

Животных содержат в стандартных условиях при комнатной температуре и 12-часовом цикле света/темноты со свободным доступом к комбикорму и воде [17—19]. При необходимости (в случае наиболее серьезного хирургического вмешательства) мышам вводят витаминные добавки и анестезию в период экспериментов ввиду их малых размера и массы тела [9].

В зависимости от специфики проводимого исследования, могут быть использованы различные линии животных, например мыши: DBA/2, C57BL/6 [9], BALB/C [11, 20], трансгенные мыши [3] и т.д.

Содержат животных с инфицированными ранами, как правило, по одному во избежание взаимных повреждений и повреждения повязок самим животным.

Способы получения открытых ран

В зависимости от специфики исследования, получают раны различной формы и разнообразными способами. Основными типами являются: раны, созданные при помощи скальпеля/лезвия — круглой или квадратной формы площадью 1,5×1,5 см (мыши), 2×2 см (крысы), группы царапин, полученные с помощью игл [2, 18, 21], с использованием стилета для биопсии кожи диаметром от 5 мм [12, 19, 22].

Рекомендовано предварительно готовить кожу, сбривая мех на спине мышей (средняя область), затем остатки волос удаляют кремом для депиляции, удаляют крем, протирая кожу ватным тампоном, смоченным в теплой воде. Кожу после этого обрабатывают 70% этанолом. Подготовка осуществляется, как правило, непосредственно перед экспериментом, реже — за сутки до него [17, 18].

В некоторых случаях получают две симметричные эксцизионные раны на всю толщину кожи с помощью стилета для биопсии, помещая мышей на бок, оттягивая кожу спины и перфорируя ее складку (рис. 2 А), для того, чтобы одну рану впоследствии использовать для высевов из нее, а другую — для гистопатологического анализа [9]. В остальных случаях — единственную рану после эксперимента разделяют пополам для анализов разного типа, а в процессе эксперимента проводят наблюдение за динамикой патологического процесса и заживления, в т.ч. при помощи специального оборудования (если в работе используются люминесцентные штаммы патогенов) [12, 19] и др.

Рис. 2. Иллюстрация этапов работы при моделировании кожной инфекции: получение эксцизионной раны, ее инфицирование и наложение повязки:

A — создание двух симметричных ран на всю толщину кожи с помощью пункционной биопсии; B — шинированные раны с силиконовыми кольцами, закрепленными цианакрилатным клеем и четырьмя узловыми хирургическими швами; C — инфицирование раны с поликарбонатными мембранами, инокулированными S. aureus; D — покрытие раны самоклеящейся повязкой; E — характерное фото биопленки, покрывающей рану (2 дня после инокуляции); F — покрытие ран стерильной прозрачной полуокклюзионной повязкой с последующим наложением эластичной повязки после удаления поликарбонатных мембран с патогеном [9].

Из-за особенностей кожи грызунов, требуется принимать меры для предотвращения стягивания кожи при разработке моделей.

Один из вариантов — получение полнослойных ран большой площади, как в исследованиях [2, 18] с последующим покрытием раневой поверхности мембраной Tegaderm для исключения контаминации раны [18], либо квадратом пленки парафильм, марлей и микроспоровой хирургической лентой [19].

Чтобы свести к минимуму сокращение ран, при этом не создавая обширной раневой поверхности, вокруг каждой раны многие исследователи фиксируют на коже мышей кольцевые силиконовые шины с внутренним диаметром 5—6 мм (до 8 мм) с помощью цианакрилатного клея, закрепляя их дополнительно хирургическими швами (рис. 2 В). Во время процедуры раны поддерживают увлажненными физиологическим раствором [1, 9, 10, 12]. Сверху раневую поверхность покрывают также мембраной Tegaderm. Все затем покрывают фиксирующей повязкой, например, Omnifix или Durapore 3М [9].

Модель инфекции воздушного мешочка и модель ожоговой раневой инфекции

К раневым моделям инфекций также порой относят такие модели кожных инфекций, как внутрикожные/подкожные, формирующие впоследствии раневые поверхности: [1, 19, 23] или ожоговые [8], при которых не предусмотрено получение открытых ран напрямую. В первом случае инфицированные раны получают либо введением фиксированного объема сначала воздуха, а затем суспензии микроорганизмов непосредственно в кожу или под кожу шприцем: [7, 23], либо иссекая небольшой участок кожи на холке [11].

При разработке модели ожоговой инфекции получают ожоги второй степени при помощи нагретого в кипящей воде латунного стержня. Для того чтобы вызвать такой ожог у животных, латунный стержень (10×10×100 мм) нагревают в течение 15 мин. Затем конец нагретого стержня прикладывают к выбритой спине мышей на 45 с. Сразу после создания ожога животным вводят внутрибрюшинно 0,5 мл стерильного физиологического раствора для восполнения жидкости с целью предотвращения шока. Через 30 мин в область ожога на спине животного вводят подкожно бактериальный инокулят в виде суспензии [8].

Анестезия и обезболивание

Как правило, применяют два основных способа анестезии при разработке моделей раневых инфекций: внутрибрюшинную и ингаляционную.

Внутрибрюшинно вводят анестетики (75 мг/кг кетамина и 1 мг/кг медетомидина) или/и анальгетик (0,1 мг/кг бупренорфина) [9]. Либо используют смесь кетамина (90 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг), а бупренорфин — в меньшей концентрации (0,05 мг/кг) [12]. В дальнейшем животные получают анальгетик подкожно с максимальными интервалами 12 часов в течение двух дней после начала эксперимента, далее — при необходимости [9, 12].

Ингаляционно используют, как правило, изофлуран с концентрацией 2% (объем/объем) [21], изофлуран (2%) в кислороде [19], либо в более высокой концентрации — за сутки до создания ран (4%) для индукции и от 1,5 до 2,5% для поддержания эффекта обезболивания [18]. Также анальгетики дают с водой в случае, когда они необходимы длительно (при двойных шинированных ранах или ожогах, в случае особенностей экспериментальных животных и пр.). Например, в качестве послеожогового анальгетика дают ацетаминофен (0,25 мг/мл) с питьевой водой [8].

Инфицирование ран

Приготовление инокулята

Подготовка инокулята имеет свои особенности в зависимости от характеристик исследуемого штамма: прежде всего, степени его патогенности, а также способности формировать биопленки.

При разработке модели важно знать, образует ли взятый в работу штамм биопленки. В зависимости от этого инфицирование проводят либо суспензией клеток, либо бактерии выращивают на мембранах, которые затем помещают в раны.

В большинстве случаев используют бактериальную суспензию определенной концентрации (как правило, 10⁵—10⁹ КОЕ/мл), внося от 10 мкл до 300 мкл суспензии в каждую рану. Исходную суспензию в этом случае выращивают в течение суток при 37 °C на жидкой среде TSB (триптон-соевый бульон), либо LB (Luria Bertani Broth). Численность бактерий в суспензии, как правило, определяют по оптической плотности (OD600), предварительно оценив для каждого штамма и условий культивирования связь значений оптической плотности и численности. После оценки плотности суспензии ее доводят до нужной концентрации физиологическим раствором, или PBS [2, 9, 18, 19]. Контрольные группы инокулируют чистым физиологическим раствором или PBS соответственно.

Авторы работы по разработке модели ожоговой инфекции [8] бактериальный инокулят готовили с меньшим сроком инкубации в питательном бульоне: в течение ночи с последующим центрифугированием (10 000 об/мин в течение 10 мин) и промывкой, в конце — с ресуспендированием в физиологическом растворе.

При работе со штаммами, способными формировать биопленки, материал для инокуляции выращивают на стеклянных шариках в TSB [11, 25] или мембранных дисках диаметром 5 мм (для мышей) [9]. Исходные культуры выращивают на чашках Петри с MSA (маннитово-солевым агаром) или колумбийским агаром в течение ночи, отсевая впоследствии микроорганизмы из одиночных колоний на шарики, либо мембраны.

В работах [11, 25] предложен многоступенчатый метод получения инокулята для обеспечения его повышенной жизнеспособности. Из замороженной исходной культуры микроорганизмы предложено помещать в 10 мл TSB со стеклянными шариками, где инкубировать в течение 24 ч. Затем для обеспечения чистоты штамма аликвоты культур по 10 мкл наносят на колумбийский агар и инкубируют аналогичное время. Этот процесс повторяют три раза для повышения жизнеспособности бактерий. Для дальнейших экспериментов одну колонию из 24-часовых чашек с чистой культурой вносят в 10 мл жидкой TSB с помощью стерильной петли, тщательно перемешивают и инкубируют при 37 °C в течение 24 ч. После инкубации путем серийных разведений в TSB получают бактериальную суспензию с концентрацией 1,0×10⁵ КОЕ/мл. Эту суспензию можно использовать на последующих этапах эксперимента [11, 25].

Способы ведения инокулята в раны

В зависимости от типа раны и особенностей используемых в работе штаммов инокуляция патогеном может проводиться разными способами.

В случае открытых ран, суспензию патогена наносят на раневую поверхность в оптимальном для заражения объеме при помощи автоматической пипетки, покрывая затем раневую поверхность мембраной [18], либо на раневую поверхность накладывают мембрану, на которой выращена биопленка (в случае использования штаммов, способных к этому), а через некоторое время, например, после начала наружного лечения экспериментальным препаратом, ее меняют на другую мембрану, которой покрывают раневую поверхность с нанесенным препаратом.

Например, A.I. Mendes и соавт. предлагают использовать поликарбонатные мембраны с размером пор 0,2 мкм: их разрезают на диски диаметром 5 мм, стерилизуют с обеих сторон УФ-светом в течение 30 мин, а затем помещают на маннитово-солевой агар (MSA) [9]. Раны инфицируют путем помещения поликарбонатной мембраны, инокулированной S. aureus, лицевой стороной вниз для прямого контакта биопленки с раневым ложем (рис. 2 C). После этого раны закрывали самоклеящейся повязкой, например, Durapore™ (3 М, США) (рис. 2 D).

Суспензию штамма S. aureus Rosenbach (ATCC BAA 2313) авторы получали с использованием изолированных колоний, ранее выращенных на MSA, которые ресуспендировали в физиологическом растворе и далее инокулировали на мембраны (10² КОЕ/мембрана). Инокулированные мембраны инкубировали в течение ночи при 37 °C для выращивания биопленки (до достижения примерно 10⁹ КОЕ/мембрана) [9].

При разработке моделей кожных раневых инфекций, не предполагающих открытых ран, инокулят в виде суспензии вводят внутрикожно при помощи шприца [19].

Для того, чтобы получить емкость для введения инокулята, мышам подкожно вводят 2 мл воздуха для формирования воздушного мешочка и заражают 0,2—0,3 мл от 2,4×10⁸ до 3,5×10⁸ бактериальной суспензии [7]. В случае ожоговой инфекции инокулят, также определенного объема, вводят в мешочек с экссудатом, предварительно отбирая оттуда жидкость и промывая PBS [8].

Инкубация in vivo

В эксперимент, как правило, вводят несколько групп животных для посмертной фиксации динамики развития инфекционного процесса и лечебного эффекта экспериментального препарата.

Уровень выживаемости контролируют каждый день. Чаще берут 2 и более точек для анализа промежуточных показателей [2, 9] и др., чтобы уже в процессе эксперимента делать высевы из ран и получать гистологические препараты.

Эвтаназию в некоторых случаях осуществляют только в конце эксперимента (если используются люминесцентные штаммы патогенов и системы визуализации для оценки численности микроорганизмов) [19].

В процессе эксперимента в случае значительного хирургического вмешательства животным вводят витаминные добавки (например, Дюфалит®) и физиологический раствор для регидратации, дают дополнительное обезболивание, помещают под согревающую лампу, а непосредственно перед его началом вводят 1 мг/кг атипамезола внутримышечно для устранения эффекта анестезии.

В случае замены поликарбонатных мембран, покрывающих раны, на которых была выращена биопленка на мембраны с препаратом, в процессе эксперимента животным вводят легкое седативное средство (7,5 мг/кг кетамина и 1 мг/кг медетомидина внутрибрюшинно) для удаления поликарбонатных мембран. В последствии применяется местное лечение, а на раны накладывают стерильную прозрачную полуокклюзионную повязку Tegaderm (3М, США), после чего сверху накладывают эластичную повязку, например, Omnifx (Hartmann) (рис. 2 F) [9].

Для изучения динамики развития инфекционного процесса на открытых раневых поверхностях, пораженных патогенными микроорганизмами (или ранах, покрытых прозрачными мембранами), нередко используются трансгенные люминесцентные штаммы со встроенными генами люциферазы (например, в работах [12, 18, 21, 24]). Этот метод имеет большое преимущество в том, что можно количественно отслеживать динамику процесса in vivo, измеряя интенсивность излучения микроорганизмов камерой, оценивая их численность, а затем проводить анализ их пространственного распределения при помощи специального программного обеспечения (ПО). Можно также с высокой точностью напрямую рассчитывать площадь каждой раны, отслеживать ее динамику в процессе эксперимента у живых мышей, и лишь в его конце провести контроль других показателей. Недостатком метода является то, что при генетической трансформации свойства штаммов могут изменяться, и даже в случае, когда известно, что у трансформированного штамма экспрессируются все известные факторы патогенности, требуется предварительная проверка его патогенности в экспериментах in vivo.

Оценка эффективности заражения и динамики развития инфекционного процесса

Оценка динамики инфекционного процесса проводится на разных уровнях. В большинстве работ приводятся такие: оценка общего состояния животных, общего состояния ран и динамики их размеров, оценка генерализации инфекции, оценка численности микроорганизмов в ранах и очаге инфекции, гистопатологическое исследование ран, оценка биомаркеров воспаления и генерализации инфекции. Благодаря этим методам возможно изучение активности патогенов, а также эффективности экспериментального препарата против патогенных микроорганизмов, которое на последнем этапе подтверждается снижением количества бактерий в ране и очаге воспаления. Для оценки внешнего состояния животных и инфицированных ран, как правило, разрабатывают шкалы на основе тех, что приняты в медицине для оценки состояния пациентов.

Ниже данные группы методик разобраны подробнее.

Общее состояние животных и внешние признаки

Общее состояние животных оценивают по таким признакам, как особенности поведения, наличие вялости, аппетит (скорость поедания корма), изменение веса, состояние шерсти, наличие выделений из глаз и т.д. [2]. Оценивать общее состоянию мышей (степень выраженности заболевания), например, предлагается по произвольной шкале от 5 до 0, отраженного несколькими клиническими признаками. Нормальное и ничем не примечательное состояние оценивать как 5; легкие признаки заболевания, определяемые как сонливость и взъерошенная шерсть, оценивать как 4; умеренно выраженные признаки заболевания, определяемые как сильная сонливость, взъерошенная шерсть и сгорбленная спина, оценивать как 3; тяжелые признаки заболевания — прикрытые глаза со скоплением выделений вокруг них в сочетании с вышеуказанными признаками оценивать как 2; агонизирующее состояние оценивать как 1; и смерть оценивать как 0. Доза введенных микроорганизмов, дающая 100% летальность, принимается за оптимальную летальную дозу LD100 [20].

Общее состояние ран

Степень отека и эритемы. Как правило, используют балльные шкалы, разработанные на основе медицинских клинических стандартов для человека и модифицированных с учетом особенностей экспериментальных животных и штаммов по балльной системе. Используют либо интегральный показатель состояния, либо отдельные баллы по каждому признаку. Примеры интегральной 5-балльной шкалы для оценки состояния ран даны в работах: [2, 20]. Баллы (0—5) присваиваются таким образом: 0 — здоровая кожа, 5 — массивный отек и интенсивное покраснение.

Часто баллами оценивают не общее состояние ран, а отдельные показатели их состояния, и затем суммируют баллы, что позволяет более точно оценить динамику и особенности конкретных патогенных штаммов и реакцию животных на них.

Пример разработанной шкалы для оценки эффекта лечения раневой инфекции, вызванной S. aureus и P. aeruginosa (цит. по [11]):

• заживление: 0 — нормальное заживление, 1 — расхождение краев раны;

• экссудат: 0 — сухая рана, 1 — влажная рана с незначительным выделением экссудата, 2 — влажная рана с обильным экссудатом;

• отек: 0 — отсутствие отека, 1 — значительный отек, 2 — очень сильный отек;

• покраснение: 0 — отсутствие покраснения, 1 — наличие покраснения.

Динамика размеров ран. Размеры ран фиксируют самыми различными способами: от прямого измерения до расчета их площади при помощи фотофиксации и анализа изображений при помощи компьютерных программ.

Группу методов, связанных с оценкой размеров ран и анализом динамики их заживления, называют планиметрия. Планиметрические методы включают определение длины, ширины, периметра и площади поверхности ран. Их подразделяют на контактные (подразумевают необходимость контакта кожи и какого-либо объекта, предназначенного для переноса контуров раневой поверхности) и бесконтактные. Недостатком контактных методов, основанных на таком принципе, является необходимость стерилизации контактирующего с раной объекта, а также соблюдения в последующем правил обращения и утилизации в связи с загрязнением биологическими жидкостями.

Подсчет площади осуществляют либо вручную: по формулам или эталонам площади, либо автоматически. Автоматический подсчет осуществляется за счет переноса полученного контура на компьютер и обработка при помощи ПО с эталоном площади. В случае мелких грызунов существенно удобнее использовать фотофиксацию. Фотографируют с помощью цифрового фотоаппарата рану и условный эталон площади, полученные цифровые изображения переносят на компьютер [26].

Следует отметить, что в настоящее время наиболее часто из описанных выше способов применяются простейшие измерительные приспособления, например, линейка или штангенциркуль [2, 26].

При необходимости высевов из ран по окончании эксперимента, одновременно с оценкой динамики их заживления и численности микроорганизмов бесконтактным способом, на раны накладывается прозрачная повязка [12].

Существуют даже мобильные приложения для оценки динамики площадей и состояния ран, однако они применимы в клинических исследованиях, тогда как в доклинических рационально использовать фото или видеокамеры с матрицей высокого разрешения, с последующей обработкой изображений на компьютерном ПО, таких, как: Universal Desktop Ruler и ImageJ [27, 28].

Стоит отметить, что фотофиксацию динамики ран, как правило, имеет смысл применять при работе с люминесцентными штаммами, в случае, когда при помощи камеры параллельно оценивают и другие характеристики процесса развития раневой инфекции, в том числе, численность микроорганизмов в раневом ложе [12, 18, 21], либо при получении ран нестандартной формы (например, [2]).

Что касается расчета динамики площади по формулам как наиболее доступного способа, то в разных источниках формулы различаются в зависимости от типа ран и их формы. Для мышей и крыс в работе J. Liang et al. [2], например, для квадратных ран рассчитывают площадь раны как площадь прямоугольника, для округлых ран предложено измерение штангенциркулем по двум взаимно перпендикулярным диаметрам, а затем расчет площади по формуле: S=π(L/2)*(W/2), где L — длина, W — ширина. Скорость заживления ран предложено рассчитывать по формуле p=(1—S_i/S₀)×100%, где S_i — площадь раны в день i, а S₀ — площадь первичной раны. Также фиксируют продолжительность раневой инфекции (до полного стягивания раны и восстановления кожного покрова). В современной русскоязычной литературе также встречается аналогичный подход: расчет скорости заживления раны (СЗ) производят по формуле: СЗ=((S₀—S)/S₀×100%)/T, где S₀ — исходная площадь; S — площадь раны на момент измерения; T — количество дней между измерениями [29].

Для мышей подробные протоколы приведены в работах [7, 24].

Оценка генерализации инфекции

Наличие микроорганизмов в крови и внутренних органах (легких, печени, почках, селезенке, ЦНС) — основные показатели, которые изучают для оценки генерализации инфекции. Такую оценку используют при исследованиях раневых инфекций нерегулярно, однако наиболее крупные исследования в обязательном порядке содержат такую информацию [2, 7, 12, 22].

Забор крови осуществляют у живых мышей. Производят его из передней части века в разные дни эксперимента. Взятые образцы используют как исходный раствор, последовательно разводя их до 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, и 1 мл, высевают на чашки Петри с маннитово-солевым агаром. Инкубация в этом случае проводится в течение 48 ч при температуре 37 °C, после чего выполняют подсчет колоний на чашках. Для подсчета оптимально выбирать чашки с количеством колоний в диапазоне 30—300 [2]. Аналогичным образом рассевают образцы органов, предварительно гомогенизированные в физиологическом растворе [7, 12, 23].

Оценка численности микроорганизмов в раневом ложе

Оценка численности патогенов на раневой поверхности осуществляется двумя основными способами: посевы из инфицированных ран и оценка in situ: при помощи сканирующей электронной микроскопии (СЭМ, рис. 3) или оценки люминесценции (при использовании соответствующих штаммов). Оба способа, как правило, используются параллельно. Основным методом является выделение бактерий из ран и их подсчет, тем более что высевы позволяют оценить наличие и численность именно жизнеспособных патогенных микроорганизмов, что крайне важно при интерпретации результатов [12].

Рис. 3. Пример исследования действия препарата на инфицированнованную раневую поверхность (СЭМ).

Предотвращение образования биопленок MRSA на хирургической повязке, покрывающей раны (Tegaderm), 3 дня после внесения инфекции у обработанных препаратом ASP-105 и контрольных животных (N=5 на группу). Изображения получены при увеличении ×2000 (A) и ×10 000 (B). На повязках от животных после лечения бактерии не идентифицируются, в отличие от контрольных животных, где видна плотная биопленка с четко определяемыми клетками стафилококка (B) [12].

В случае подкожного инфицирования, в различные моменты времени после заражения инфильтрат из кожного мешочка собирают путем предварительной инъекции 1 мл PBS в кожный мешочек и аспирации инфильтрата. Количество клеток в инфильтрате возможно измерить с помощью гемоцитометра, а жизнеспособность клеток косвенно определять путем окрашивания трипановым синим [7].

Для определения численности патогенов путем рассевов, после эвтаназии животных раны выделяют в стерильных условиях (участки ткани, соответствующие по размерам исходной раневой поверхности), предварительно удалив мембраны, покрывающие раневые поверхности, после чего образцы ткани гомогенизируют.

Навески гомогената ткани помещают в стерильный физиологический раствор 1:10 и встряхивают в течение 1 мин в вортексе для диспергирования бактерий. Далее, разводят и высевают на чашки Петри с MSA или TSBY, используя метод серийных разведений. Инкубация проводится аналогично образцам крови и внутренних органов.

Культивирование на агаризованной среде проводят в течение суток при 37 °C. Далее осуществляют подсчет КОЕ на чашках Петри [2, 7—9].

Гистопатология ран

Во всех исследованиях, как минимум, по окончании эксперимента проводится гистопатологическая оценка состояния ран. Для этого раны выделяют после эвтаназии животных (участки ткани, соответствующие по размерам исходной раневой поверхности) [17].

Для гистологического анализа либо создают отдельные раны, как уже было сказано выше, либо инфицированную ткань разделяют по центру раны, взяв ее часть для гистопатологического анализа. Инфицированную ткань погружают в нейтральный забуференный раствор формальдегида (4%, мас./об.), обезвоживают в этиловом спирте (серии возрастающих концентраций), затем помещают в ксилол [19]. Затем эти образцы заливают в парафин и делают срезы толщиной 4-5 нм с использованием микротома для окрашивания гематоксилином и эозином (HE) и по Граму [9, 23], либо дополнительно окрашивают и трихромом Массона (МТ). Хранят образцы для гистологического анализа в 10% формалине для гистологического исследования [19].

Пример окрашивания и оценки интенсивности воспаления по гистологическим препаратам приведен на рис. 4. При гистопатологическом исследовании оценивают наличие и обилие бактерий в очаге воспаления, наличие участков инфильтрации и т.д.

Рис. 4. Гистологическое исследование раневой ткани у мышей с разной активностью воспалительного процесса трех типов ран (округлой, квадратной и группы царапин) при разном увеличении.

а — срез инфицированной кожи животного (окраска гематоксилином, HE, ×40). Черными стрелками показаны зоны инфильтрации; б — срез инфицированной кожи животного (окраска HE, ×400) (цит. по [2]).

При работе со штаммами микроорганизмов, формирующими биопленки, сложно стандартизировать мониторинг состояния ран, поскольку их характер очень различается у разных патогенов и даже может существенно различаться у штаммов одного вида, а плотные биопленки могут препятствовать оценке состояния ран. В основном приходится полагаться на качественные или полуколичественные методы (высевы из ран, микроскопия, гистопатология и т.д.). Для более точной оценки динамики состояния подопытных животных могут быть использованы различные биомаркеры.

Оценка биомаркеров заживления ран и генерализации инфекции

В некоторых работах приводят данные по оценке биомаркеров заживления ран (включая местные и общие маркеры) и другие количественные характеристики состояния животных, включая индикаторы повреждения органов и их систем. Методы данной группы являются высокоточными, но при этом трудоемкими и дорогостоящими. Их применение требуется в тех случаях, когда необходимо получить развернутые характеристики состояния животных, а описанные выше методы не дают достоверных различий в полученных экспериментальных данных. Например, если на мышах и крысах не получается выявить достаточно четкую картину ввиду их особенностей (в т.ч. малого размера), или особенностей исследуемого препарата, и при этом нужно выбрать экспериментальный препарат для дальнейших исследований из нескольких сходных кандидатов [7, 19]. Основные методики, применяемые при разработке и использовании моделей кожной инфекции, приведены ниже.

ОТ-ПЦР, ИФА раневой ткани

Образцы тканей, выделенные из ран, после отделения рекомендуется хранить при -80 °C для анализа методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА).

Биомаркеры заживления ран, которые измеряют и т.д. в гомогенатах тканей кожи, включают интерлейкин 1β (IL-1β), интерлейкин 6 (IL-6) и матриксные металлопротеиназы 1 и 9 (MMP-1 и MMP-9). Уровни IL-1β и IL-6 измеряли с помощью наборов ELISA и в соответствии с инструкциями производителя (мышиный IL-1β, CUSABIO, CSB-E08054m; Мышиный IL-6, CUSABIO, CSB-E04639m).

Количественный анализ экспрессии генов ММП-1 и ММП-9 рекомендуют проводить с помощью набора qRT-ПЦР (QuantiTectR 205311, Германия). Тотальную РНК — выделять из тканей мыши с использованием набора miRNeasy в соответствии с рекомендациями производителя. Метод 2-ΔΔCt рекомендовано использовать для определения изменения уровней мРНК в образцах для каждого гена и стандартизировать по эталонному гену [19].

По уровню экспрессии генов биомаркеров воспаления определяется воздействие патогенов на организм животного, а также динамика воспалительного процесса при терапии экспериментальным препаратом. Конкретные критерии оценки будут зависеть от особенностей патогена и вызываемого им заболевания, механизмов патогенетического процесса, а также природы препарата и его лекарственной формы и должны быть определены в рамках разработки конкретной модели.

Цитокины в сыворотке

Цитокины в сыворотке являются маркерами воспалительных процессов. Их уровни отражают состояние иммунной системы, что, в свою очередь, позволяет оценить состояние подопытных животных и сделать вывод о степени патогенности изучаемых штаммов микрооганизмов, а также эффективности исследуемого препарата. Уровень цитокинов у инфицированных мышей, предложили измерять с помощью набора Milliplex MAP Mouse Cytokine Kit (Millipore, Billerica, MA, United States) на анализаторе Luminex 200 (Luminex, Austin, TX, United States). Оценку данных авторы предлагают проводить, применяя 5-параметрическую логистическую кривую с использованием программного обеспечения Luminex IS 2.3.

Модель кожной инфекции на мышах при инфицирования стрептококком группы А продемонстрировала, что циркулирующие цитокины TNF, IL-1β, MCP-1 и IFN-γ значительно повышены уже через сутки после, свидетельствуя о тяжелой системной воспалительной реакции (рис. 5 A) [7].

Рис. 5. Выявление системного воспаления и повышенной экспрессии рецепторов TNF в мозге после подкожной инфекции GAS:

A — сыворотка, собранная у каждого животного, используемая для определения уровней TNF, IL-1, MCP-1 и IFN через 0, 24 и 48 ч после заражения. n=8–12 мышей на группу; B — через 48 ч инфекции уровни РНК TNFR1 и TNFR2 в мозге определены с помощью ПЦР в реальном времени. n=5–8 мышей на группу. p<0,01, p<0,001 (цит. по [7]).

Биомаркеры состояния центральной нервной системы при кожной инфекции

В ряде случаев требуется оценка влияния кожной инфекции на центральную нервную систему, поскольку это является важным критерием патогенности исследуемых штаммов, а также для разработки и испытаний препаратов для борьбы с ними. В литературных источниках предложены следующие методики оценки по биомаркерам.

Выделение РНК и ПЦР в реальном времени. Данная методика позволяет оценить экспрессию определенных генов животных, продукты которых могут быть маркерами воспаления и повреждения нервных клеток. Авторы Y.H. Liu и соавт. [7] предложили выделять общую РНК из цельного головного мозга мышей с использованием REzol (PROtech, Тайбэй, Тайвань). Для обратной транскрипции рекомендуется применять обратную транскриптазу M-MLV (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и олиго(dT) праймеры; ПЦР в реальном времени — выполнять с использованием SYBR, как реализовано в системе ПЦР в реальном времени ABI StepOnePlus (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США). Экспрессию каждого гена рекомендуют нормализовать по актину.

Экспрессия рецепторов TNF в мозге. Повышенная экспрессия генов рецепторов TNF (фактора некроза опухоли, ФНО) в мозге может говорить о нейровоспалении у мышей, инфицированных GAS. Периферический ФНО, ключевой медиатор сепсиса, является индикатором острой фазы реакции, которая инициирует каскад цитокинов. Известно, что периферический ФНО играет важную роль в патогенезе септической энцефалопатии (SAE) и участвует в нарушении ГЭБ при многих заболеваниях мозга [30—33]. Уровни мРНК TNFR1 и TNFR2 повышены в мозге инфицированных мышей (рис. 5 B). Таким образом, периферический ФНО представляется важным медиатором GAS-индуцированного воспаления центральной нервной системы через сигнализацию рецепторов ФНО (TNFR), поэтому определение экспрессии таких рецепторов играет важную диагностическую роль [7]. Определение уровней упомянутых индикаторов и мониторинг их динамики позволяет оценить как тяжесть воспалительного процесса в нервной системе, так и эффективность лечения за счет сравнения их с контрольными группами.

Проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Данный тип маркеров используют прежде всего для оценки способности патогенов повреждать нейроны, кроме того, при доклинических исследованиях необходимо понимать, способен ли тестируемый препарат также преодолевать ГЭБ, чтобы воздействовать на патоген, ингибируя его повреждающую активность относительно нейронов.

Для количественной оценки проницаемости ГЭБ для малых молекул используют флуоресцеин натрия. Liu и соавт. [7] предложили вводить мышам внутрибрюшинно по 200 мкл 10% флуоресцеина натрия (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). До данной методике через 40 мин следует анестезировать мышей и перфузировать 10 мл PBS. Затем необходимо извлечь головной мозг, гомогенизировать его в 50% трихлоруксусной кислоте и центрифугировать при 10 000 g в течение 10 мин. Далее супернатант разбавляют 0,8 объема 5 M NaOH, и после этого проводить измерения с помощью флуориметра при длинах волн: возбуждение — 485 нм и испускание — 515 нм. Стандартные растворы флуоресцеина натрия (1—1000 нг/мл) рекомендуется использовать для расчета его содержания в мозговой ткани, которое нормализуют по отношению к общему количеству белка в гомогенате.

Известно также, что повышенный уровень экспрессии матриксной металлопептидазы (ММП-9) в инфицированном мозге связан с нейровоспалением. ММП-9 — ключевое соединение, способствующее нарушению ГЭБ [34, 35]. Например, показано, что при инфицировании кожи стрептококками группы А (GAS), Проницаемость ГЭБ значительно увеличена по сравнению с контрольной группой [7]. Интерпретация результатов таких тестов должна проводиться с учетом особенностей патогена и реакции подопытных животных на внесение инфекции.

Иммунофлуоресценция Iba-1 и окрашивание Fluoro-Jade C. Для мышей также предложена методика определения иммунофлуоресценции Iba-1 (белка, который экспрессируется в регуляторных клетках микроглии макрофагах при их активации, обладая актин-связывающей активностью), а также окрашивание красителем Fluoro-Jade C для оценки состояния нейронов головного мозга. Для этого мышей подвергают транскардиальной перфузии 4% параформальдегидом (PFA) в PBS.

Для изучения иммунофлуоресценции Iba-1 мозг постфиксируют в 4% PFA в течение 24 ч, а затем переносят в 30% сахарозу на 24 ч. Криостатные срезы мозга (толщиной 10 мкм) фиксируют в этаноле, блокируют нормальной сывороткой и инкубируют в течение ночи при 4 °C с первичными антителами против Iba-1 (1:1000, Dako, Carpinteria, CA, United States), а затем со вторичными антителами (Alexa FluorR 488, Life Technologies, Grand Island, NY, United States). Визуализируют изображения с помощью конфокального микроскопа, с последующей обработкой с помощью программного обеспечения, например, EZ-C1 (Nikon, Токио, Япония) [7].

Для окрашивания Fluoro-Jade C депарафинированные и регидратированные срезы помещают в 0,06% раствор перманганата калия на 10 мин. После 1—2 мин промывки водой срезы переносят в 0,0001% раствор красителя Fluoro-Jade C, растворенного в 0,1% уксусной кислоте, на 10 мин. После этого их промывают дистиллированной водой, накрывают покровным стеклом и затем визуализируют (рис. 6).

Рис. 6. Маркеры дегенерации нейронов, под действием кожной инфекции, вызванной стрептококками группы А (GAS), в тканях головного мозга инфицированной мыши. Положительные по Fluoro-Jade C (зеленые) клетки обнаружены во всех отделах мозга инфицированных мышей, что говорит о повреждении нейронов (цит. по [7]).

По интенсивности флуоресценции Iba-1 можно судить о наличии и активности воспалительных процессов в головном мозге, а окрашивание нейронов Fluoro-Jade C говорит об их повреждении.

Вестерн-блоттинг для Phospho-p65. Ядерный белок Phospho-p65, является маркером опухолеобразования и воспаления в целом, регулируя работу фактора транскрипции NF-κB (ядерного фактора каппа B) — ключевого фактора, направляющего различные иммунные реакции. По этой причине количественная оценка Phospho-p65 также может дать информацию о состоянии мозговой ткани. Для этого исследования необходимо выделить ядерную фракцию клеток мозга. В работе [7], где изложена данная методика, было выделено 20 г ядерного белка и проведено разделение при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия (SDS-PAGE) и образцы перенесены на поливинилиденфторидные (ПВДФ) мембраны. Мембраны блокируют 3% BSA в течение 1 ч и инкубируют в течение ночи с первичными антителами против Phospho-p65 (#3033, Cell Signaling, Danvers, MA, США) и ламина B1 (#ab16048, Abcam, Cambridge, MA, США) в разведении 1:1000 в блокирующем буфере. После промывки буфером TBST (20 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl и 0,1% Твин-20) три раза по 5 мин каждый, мембраны предложено инкубировать с антикроличьими антителами (#401315, Calbiochem, Gibbstown, NJ, США) в разведении 1:30000 в течение 1 ч и визуализировать с помощью ECL (Millipore, Billerica, MA, США). Было показано, что фосфорилирование белка p65 приводит к последующей экспрессии регулируемых NF-kB генов и активации сигналинга фактора NF-kB, что в свою очередь, приводит к нейровоспалению [7].

Заключение

Резюме по методам оценки раневых моделей

Стоит отметить, что несмотря на постоянное совершенствование методологии разработки раневых инфекций и появление множества новых методик, основными методами оценки эффективности заражения и терапии экспериментальными препаратами можно считать оценку общего состояния животных, смертность, микробиологические и гистопатологические исследования, позволяющие определить количество жизнеспособных клеток патогена, а также оценить непосредственно состояние очагов воспаления, активность воспалительного процесса, что помогает контролировать достоверность результатов в т.ч. полученных другими методами [9].

Для штаммов, формирующих биопленки, лучше всего подходит модель эксцизионных ран, так как она представляет открытую раневую поверхность с самого начала эксперимента, куда удобно вносить патоген, чьи пленки выращены на дисках мембран. В меньшей степени подходит ожоговая модель, поскольку в ней формирование открытой раневой поверхности сразу не происходит, однако термическое повреждение кожи и инфицирование волдырей впоследствии приводит к формированию инфицированного раневого ложа при использовании высокопатогенных штаммов. На раневую поверхность или инфицированные волдыри обязательно нужно помещать стерильные мембраны для предотвращения стягивания кожи, под которые экспериментальным животным можно вносить препарат, накладывая сверху повязки для возможности высева из ран и с покрывающих раны мембран, а также изучать их другими методами, не получая контаминации. В случае, если одной мембраны для предотвращения стягивания кожи над раневым ложем будет недостаточно, можно фиксировать края ран силиконовыми шинами, однако это является более серьезным вмешательством, и потому может требовать дополнительных мер поддержки экспериментальных животных: обогрев, введение витаминных добавок и физиологического раствора.

Стандартизация методов, применяемых при разработке моделей раневых инфекций, является достаточно сложной задачей, ввиду разнообразия задач, особенностей патогенов и т.п. Поэтому важно принимать во внимание основные принципы работы с раневыми инфекциями при разработке моделей под конкретные задачи.

Преимущества биомаркеров — более точная оценка динамики состояния ран и общего состояния животных, что особенно важно при сравнении, например, кандидатных соединений со сходным действием для выбора дальнейшей стратегии разработки, а также сравнительной оценки патогенности различных возбудителей.

Основные принципы выбора типа модели

Что касается выбора формы раны для конкретного исследования, то здесь стоит учитывать множество факторов. Прежде всего, выбор зависит от целей исследования, типа препарата, его физико-химических свойств, лекарственной формы, типа и агрессивности микроорганизмов, с которыми проводится работа. Полнослойные (эксцизионные) раны используют, как правило, при работе с патогенами, специализирующимся, в первую очередь, на контаминации открытых ран, кроме того, такие раны подойдут для моделей диабета, пост-хирургического лечения и при прочих иммунодефицитных состояниях, когда затруднено заживление ран, а также формируются язвы [1, 9]. Ожоговые модели раневых инфекций чаще всего применяются для разработки противоожоговых средств. Поврежденные ожогом ткани можно контаминировать, как и эксцизионные раны, для моделирования ожоговой инфекции [8, 20]. Все модели этих типов подходят для разработки как антимикробных, так и ранозаживляющих препаратов. Выбор формы раны зависит от особенностей микроорганизмов. В большинстве случаев при разработке моделей раневых инфекций используют открытые раны разной формы и глубины.

При работе с высокоагрессивными штаммами патогенов, способными вызывать генеразизованные инфекции, может быть достаточно и царапин на коже для внесения в них патогена. Кожные мешочки, так же как и царапины, могут быть хорошим вариантом для раневых моделей с использованием возбудителей инфекций с высокой патогенностью. Несмотря на относительно небольшое повреждения покровов в таких моделях, на месте внесения патогена нередко формируются язвы, что позволяет проводить дальнейшие микробиологические исследования, различные виды визуализации, молекуляной диагностики и т.д. [2, 7, 23].

В начале исследования необходимо использовать несколько типов ран для выбора оптимального варианта для разрабатываемой модели.

Благодарности

Авторы благодарят Администрацию ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России.

Финансирование работы

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российский Федерации.

Соблюдение этических стандартов

Эксперименты на животных, использованных в работах, использованных для составления настоящих методических рекомендаций, проводились в соответствии с рекомендациями Коллегии Евразийской Экономической Комиссии от 22.12.2020, №33, Решением Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 №81 (Рекомендации Коллегии ЕЭК, 2020; Решение Совета ЕЭК №81, 2016).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с участием людей или животных в качестве объектов исследований.