Получение рекомбинантного RBD Spike-белка SARS-CoV-2 в клетках Escherichia coli, связывание с антителами и противовирусная активность

Принятые сокращения: ДТТ — дитиотреитол; ИПТГ — изопропил-β-D-тиогалактопиранозид; МЭ — меркаптоэтанол, ACE2 — ангиотензинпревращающий фермент 2; BCA — бицинхониновая кислота; COVID-19 — коронавирусная инфекция 2019 г. (COronaVIrus Disease 2019); eRBD — рецептор-связывающий домен, полученный в эукариотическом продуценте; RBD — рецептор-связывающий домен; RBM — рецептор-связывающий мотив; SARS-CoV-2 — коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома.

Пандемия коронавирусной инфекции 2019 г. (COVID-19), вызванная коронавирусом 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), продолжает представлять глобальную угрозу для здоровья человечества. На данный момент число заболевших COVID-19 во всем мире составляет более 638 млн человек. Число погибших от COVID-19 продолжает расти, несмотря на большой процент вакцинированных и переболевших, и стремится к 6,6 млн в мире [1].

Потребность в разработке мер борьбы с коронавирусной инфекцией привела к быстрому созданию и одобрению в качестве средств экстренной профилактики новых вакцин на различных платформах (субъединичные, векторные, инактивированные, мРНК-вакцины), а также терапевтических методов (с использованием моноклональных антител, химических ингибиторов, плазмотерапии и др.). Однако сдерживание пандемии COVID-19 осложняется появлением новых вариантов SARS-CoV-2, которые демонстрируют повышенную трансмиссивность. Кроме того, при этом снижается эффективность имеющихся вакцин [2].

Проведенные ранее исследования показали, что Spike-белок, находящийся на поверхности вириона SARS-CoV-2, содержит рецептор-связывающий домен (RBD), который связывается с находящимся на поверхности клеток человека ангиотензинпревращающим ферментом 2 (angiotensin-converting enzyme 2, ACE2), участвующим в проникновении вируса в клетку. Большинство вырабатывающихся у больных COVID-19 нейтрализующих антител взаимодействует с RBD [3]. Поэтому RBD Spike-белка SARS-CoV-2 является перспективной мишенью для разработки профилактических вакцин, а также терапевтических средств на его основе.

По имеющимся в литературе данным, структура RBD Spike-белка SARS-CoV-2 (319—541 а.о.) представлена пятью антипараллельными β-тяжами (β1, β2, β3, β4 и β7) с короткими соединительными спиралями и петлями, образующими скрученный β-лист. Эта структура вместе с примыкающими к ней α-спиралями формирует так называемый кор. Между тяжами β4 и β7 в коре имеется протяженная вставка, которая содержит короткие β5- и β6-тяжи, две α-спирали (α4 и α5) и петлю. Эта вставка соответствует мотиву RBM (receptor binding motif), содержащему большинство аминокислотных остатков, которые связываются с рецептором ACE2 [4].

Также следует отметить, что RBD содержит четыре дисульфидные связи: связь C480—C488 расположена в петле, взаимодействующей с рецептором ACE2, тогда как три другие связи — C379—C432, C336—C361 и C391—C525 — расположены на противоположной стороне RBD и стабилизируют его трехмерную структуру домена [5, 6]. Учитывая сложную структуру RBD, в основном его получают путем экспрессии в эукариотических клетках; при этом белок синтезируется в растворимой форме [7—13].

В ряде работ было показано, что для наработки RBD Spike-белка SARS-CoV-2 возможно также использование прокариотической системы экспрессии [14—18]. Эффективная бактериальная продукция может обеспечить наработку RBD в больших объемах и сделает его доступным для широкого применения в качестве компонента профилактических вакцин, терапевтических препаратов и диагностикумов.

Цель данной работы — получение синтезом в клетках Escherichia coli рекомбинантного белка, включающего RBM Spike-белка SARS-CoV-2, не уступающего по своей противовирусной активности RBD, полученному в эукариотическом продуценте (eRBD).

Штамм и векторы. В работе использовали бактериальный штамм Escherichia coli BL21 (DE3) (E. coli B F⁻dcm ompT hsdS(r_B⁻m_B⁻) gal λ(DE3) («Agilent Technologies», США), модифицированный плазмидный вектор pQE13 («Qiagen», США), в котором промотор T5 заменен на T7, и плазмиду pRep4 из E. coli M15 [pRep4] («Qiagen», США).

Получение генно-инженерных конструкций, кодирующих рекомбинантные белки 6His-RBD_shortи 6His-RBD_long. Белки 6His-RBD_short (24,4 кДа) и 6His-RBD_long (33,7 кДа) включают короткую (330—527 a.o.) либо длинную (314—597 a.o.) аминокислотную последовательность RBD S1 SARS-CoV-2 (UniProtKB: locus SPIKE_SARS2, accession P0DTC2), последовательность из 6 а.о. гистидина (6His) на N-конце, а также дополнительные остатки, соответствующие нуклеотидным последовательностям с введенными рестрикционными сайтами. Нуклеотидные последовательности химерных генов, кодирующих белки RBD_short и RBD_long, были спланированы таким образом, чтобы на 5′-конце находились сайты NcoI и BamHI, а на 3′-конце — сайты BglII и Kpn2I. Оптимизацию кодонного состава химерных генов проводили с помощью программы JCat (https://www.jcat.de/), корректировку вторичной структуры транскрибируемой РНК — с помощью веб-сервера DINAMelt (https://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-folding.php).

Синтетические гены встраивали в модифицированный плазмидный вектор pQE13 по сайтам BamHI и Kpn2I, в результате получили плазмиду pL919, кодирующую белок 6His-RBD_short, и плазмиду pL1060, кодирующую белок 6His-RBD_long. Модифицированный вектор pQE13 содержит в своем составе промотор фага лямбда T7 вместо исходного промотора фага T5.

Синтетические гены получали в компании «Евроген» (Россия). Правильность сборки последовательностей генов 6His-RBD_short и 6His-RBD_long подтверждена секвенированием.

Выращивание штаммов-продуцентов. Культуру трансформированных клетокE. coli BL21 выращивали в среде LB с добавлением канамицина (25 мг/л) и ампициллина (200 мг/л) на качалке при 180 об/мин и 37 °C до достижения OD₆₀₀ 1,0—1,2. Синтез белков индуцировали добавлением 0,5 мМ ИПТГ, далее культуру выращивали еще 4 ч в тех же условиях и центрифугировали в течение 30 мин при 5000 g и 10 °C. Биомассу хранили при –20 °C.

Разрушение клеток E. coli, выделение телец включения. Размороженную биомассу бактериальных клеток (1 г) суспендировали в лизирующем буфере (20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 1% Triton X-100, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид) в соотношении не менее чем 1:10 (w/v), вносили 100 мкг/мл лизоцима, инкубировали 20 мин при комнатной температуре и разрушали на ультразвуковой установке Vibra-Cell VCX 750 («Sonics», США; 40% амплитуда, 2,5 мин с перерывами 3 с через 2 с) на льду. Смесь центрифугировали в течение 30 мин при 20 000 g и 10 °C. Осадок, в котором содержались тельца включения, промывали дважды лизирующим буфером и 1 раз 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0.

Колоночная хроматография и электрофорез. Колоночную хроматографию на сорбентах WorkBeads 40 Ni-NTA («Bio-Works», Швеция) и WorkBeads 40S («Bio-Works», Швеция) проводили с применением хроматографической установки низкого давления Akta Start («Cytiva», США). Концентрацию белка на всех этапах определяли по поглощению при 280 нм растворов белков с использованием теоретических (расчетных) коэффициентов поглощения белков и с помощью набора Bicinchoninic acid (BCA) Protein Assay («AppliChem», Германия). Белковые экстракты клеток и образцы белков на различных стадиях очистки перед электрофорезом в ПААГ готовили в буфере для образцов с восстановителем 0,2 М ДТТ (дитиотреитол) или без него в растворе, подробная методика опубликована ранее [19].

Хроматография на сорбенте WorkBeads 40 Ni-NTA. Для выделения и очистки белков отмытые тельца включения растворяли в 8 М растворе мочевины в 30 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 10 мМ имидазоле, 200 мМ NaCl в соотношении не менее чем 1:20 (w/v) в течение 3 ч, центрифугировали 30 мин при 9000 g, полученный супернатант подвергали колоночной хроматографии на сорбенте WorkBeads 40 Ni-NTA. Супернатант наносили на колонку с сорбентом, уравновешенным раствором 8 М мочевины в 20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 10 мМ имидазола, 200 мМ NaCl со скоростью 1 мл/мин. Элюцию целевых белков проводили градиентом имидазола 10—500 мМ в 0,5 М NaCl, 8 М мочевины, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,0) в пяти объемах колонки.

Рефолдинг. Рекомбинантные белки, полученные после первого этапа хроматографии на WorkBeads 40 Ni-NTA, разбавляли буфером, содержащим 6 М гуанидин гидрохлорида, 0,1 М ДТТ, 30 мМ Tris-HCl, pH 8,0, до конечной концентрации белка ~0,1 мг/мл и инкубировали в течение 24 ч при 4 °C. Далее раствор денатурированных белков диализовали против 10 объемов буфера, содержавшего 1 М гуанидин гидрохлорида, 30 мМ Tris-HCl, pH 8,8, в течение 24 ч, с трехкратной сменой диализного буфера и центрифугировали в течение 30 мин при 9000 g. Полученный раствор разбавляли буфером для рефолдинга, содержавшим 1 M L-аргинина, 50 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 20 мМ глутатиона восстановленного и 2 мМ глутатиона окисленного в соотношении 1:1, до конечной концентрации белка ~0,05 мг/мл и инкубировали в течение 48 ч при 4 °C. Раствор рефолдированных белков диализовали против 10 объемов буфера, содержавшего 6 М мочевину, 30 мМ Tris-HCl, pH 6,8, в течение 24 ч с трехкратной сменой диализного буфера и центрифугировали в течение 30 мин при 9000 g.

Хроматография на сорбенте WorkBeads 40S. Связывание белков с сорбентом WorkBeads 40S и промывание колонки проводили в растворе 6 М мочевины в 30 мМ Tris-HCl-буфере, pH 6,8. Белки элюировали градиентом концентрации NaCl (0—1 М) в растворе 6 М мочевины в Tris-HCl-буфере, pH 6,8 в 5 CV (объемах колонки). Все операции проводили со скоростью 1 мл/мин. Фракции после элюции объединяли и последовательно диализировали против 10 объемов буфера, содержащего 4 М мочевины и 20 мМ натрий фосфата, pH 5,5, в течение 24 ч при 4 °C, далее против 10 объемов буфера, содержащего 2 М мочевины и 20 мМ натрий фосфата, pH 5,5, в течение 24 ч при 4 °C и против 10 объемов буфера, содержащего 20 мМ натрий фосфата, pH 5,5, в течение 24 ч при 4 °C. Диализ растворов белков проводили с использованием целлюлозной диализной мембраны Zellu Trans/ROTH 3,5 E657.1 («Carl ROTH», Германия) толщиной 25 мкм и нижним порогом пропускания 3500 Да.

Полученные препараты белков лиофильно высушивали и использовали для дальнейших исследований.

Молекулярную массу и теоретические значения некоторых параметров рекомбинантных белков рассчитывали с использованием интернет-ресурса https://web.expasy.org/protparam/.

Получение эукариотического eRBD проводили согласно методике, описанной в [19]. Аминокислотная последовательность RBD поверхностного Spike-белка вируса SARS-CoV-2 (319—541 а.о., идентификатор UniProtKB: locus SPIKE_SARS2, accession P0DTC2) была модифицирована с N-конца сигнальным пептидом щелочной фосфатазы SEAP (MLLLLLLLGLRLQLSLGI), а с C-конца — последовательностью глицин-серинового линкера и девяти гистидинов (GS-HHHHHHHHH).

Специфические гуманизированные моноклональные антитела. В качестве специфических моноклональных вируснейтрализующих антител были взяты антитела GamP2C5 [20] и GamXRH19, являющиеся компонентами препарата ГамКовиМаб (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, находится в стадии клинических испытаний), предназначенного для ранней этиотропной терапии коронавирусной инфекции, вызываемой вирусом SARS-CoV-2 (в стадии клинических исследований).

Оба антитела были получены при помощи культивирования стабильных клеточных линий-продуцентов CHO-S на среде SFM4CHO («Cytiva», США), а также хроматографической очистки с использованием сорбентов MabSelect SURE («Cytiva», США), Q Sepharose Fast Flow («Cytiva», США) и CHT I type 40 мкм («Bio-Rad», США).

Иммуноферментный анализ. Рекомбинантные белки иммобилизовали в лунках иммунологического планшета Maxisorp («Thermo Scientific», Дания) в 50 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере, pH 9,0, в течение ночи (100 нг на лунку) при 4 °C. Несвязавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере (PBS), pH 7,4, в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки промывали 0,1% раствором детергента Tween-20 в фосфатном буфере (PBS), pH 7,4 и добавляли 5% раствор сухого молока в фосфатном буфере, содержащем различные разведения антител GamP2C5 и GamXRH19 (1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,06, 0,03, 0,015 и 0,0075 мкг/мл). Каждое разведение вносили в трех повторах, инкубировали 1 ч при 37 °C и слабом перемешивании. Затем проводили 3-кратную отмывку 0,1% раствором детергента Tween-20 в фосфатном буфере. После отмывки вносили раствор конъюгата к IgG человека (933NA; «GE Healthcare», США), меченного пероксидазой хрена, и инкубировали 1 ч при 37 °C и слабом перемешивании. Далее проводили 5-кратную отмывку 0,1% раствором детергента Tween-20 в фосфатном буфере. Затем вносили раствор субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) и инкубировали 10 мин при комнатной температуре без перемешивания, после чего реакцию останавливали добавлением раствора 1 N серной кислоты. Оптическую плотность при длине волны 450 нм измеряли на мультипланшетном ридере с LVF-монохроматорами (на линейных переменных фильтрах) CLARIOstar («BMG Labtech», США).

Противовирусная активность. Исследование проводили по методике, описанной A. Acharya и соавт. [21]. Клетки Vero E6 сеяли в 96-луночные планшеты в количестве 2·10⁴ клеток на лунку в среде DMEM, содержащей 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (HI-FBS), через 24 ч вносили препараты белков до эквимолярной концентрации в ячейке 0,55 мкМ. Затем инкубировали клетки с препаратами белков в течение 2 ч при 37 °C. Далее добавляли 100 TCID₅₀ вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.1 и инкубировали 1 ч при 37 °C. Затем проводили отмывку клеток от несвязавшихся вирусных частиц и добавляли 200 мкл среды DMEM, содержащей 10% HI-FBS. Через 24 ч из каждой лунки собирали по 25 мкл среды для анализа вирусной нагрузки методом ПЦР в реальном времени.

Выделение РНК вируса проводили с использованием реагента для выделения суммарной РНК ExtractRNA («Евроген», Россия) по протоколу фирмы-производителя. Для ПЦР использовали набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 методом ПЦР с обратной транскрипцией ПОЛИВИР SARS-CoV-2 (ПНО «Литех», Россия). ПЦР проводили в дублях в термоциклере CFX96 («Bio-Rad», США) в режиме реального времени.

Коэффициент ингибирования (К_инг) рассчитывали по формуле:

где А_вир — титр вируса в среде с клетками без препарата (ГЭ/мл), А_преп — титр вируса в среде с клетками, которые были обработаны препаратом (ГЭ/мл).

Статистический анализ. Статистический анализ проводили с использованием пакета программ Statistica 12.0 («Statsoft», США). Нормальность распределения проверяли с помощью теста Колмогорова—Смирнова. Данные представляли как среднее±стандартное отклонение (SD) или как медиану и квартили. Статистическую значимость различий оценивали с помощью одностороннего дисперсионного анализа (one-way ANOVA) с апостериорным анализом по Тьюки либо с помощью критерия Краскела—Уоллиса. Различия считали значимыми при p<0,05.

Дизайн рекомбинантных белков RBD_shortи RBD_long. В работе получены две генно-инженерные конструкции, кодирующие белки 6His-RBD_short (330—527 а.о.) и 6His-RBD_long (314—597 а.о.). Границы последовательностей RBD_short и RBD_long по отношению к общепринятым границам RBD и RBM показаны на рис. 1 (см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_02_032_add.zip).

Из рис. 2 (см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_02_032_add.zip) видно, что выбранный нами короткий фрагмент RBD_short соответствует расположенному сверху компактному структурному субдомену Spike-белка (см. рис. 2), реализующему все контакты с ACE2-рецептором. Длинный фрагмент RBD_long, помимо этого, включает также фрагмент белка, соответствующий субдомену 1 (SD1), и два β-тяжа из субдомена 2 (SD2). Фрагмент RBD_short содержит 8 а.о. цистеина, которые участвуют в формировании четырех дисульфидных связей: C336— C361, C379—432, C391—525 и C480—488. В удлиненном фрагменте RBD_long присутствует еще одна S—S-связь C538— C590.

Получение и очистка рекомбинантных белков RBD_shortи RBD_long. Полученные генно-инженерные конструкции обеспечивали высокий уровень продукции белков 6His-RBD_short и 6His-RBD_long в клетках E. coli BL21 (рис. 3, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_02_032_add.zip).

Поскольку оба белка нарабатывались в нерастворимой форме в виде телец включения, первую стадию очистки металл-хелатной хроматографией на сорбенте WorkBeads 40 Ni-NTA проводили в денатурирующих условиях. Далее белки инкубировали с восстановителем S—S-связей ДТТ и ступенчато диализировали против рефолдирующего буфера. После рефолдинга белки дополнительно очищали на ионообменном сорбенте WorkBeads 40S. Для дальнейшей работы использовали фракции, в которых на электрофореграмме в невосстанавливающих условиях отсутствовали высокомолекулярные агрегаты, образованные в результате неправильного рефолдинга (см. рис. 3, б, дорожки 9 и 10).

Выход белков 6His-RBD_short и 6His-RBD_long составил 4,5 и 1,8 мг на 1 л культуры соответственно, степень очистки — 97—98%.

Взаимодействие рекомбинантных белков 6His-RBD_shortи 6His-RBD_longс вируснейтрализующими антителами. В качестве вируснейтрализующих антител использовали гуманизированные однодоменные моноклональные антитела GamP2C5 и GamXRH19.

На рис. 4 (см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_02_033_add.zip) приведены результаты иммуноферментного анализа связывания с вируснейтрализующими антителами GamP2C5 и GamXRH19 рекомбинантных белков 6His-RBD_short и 6His-RBD_long, а также эукариотического белка eRBD (319—541 а.о.), полученного в клетках CHO-S («Thermo Fisher Scientific», США) по методике, описанной в статье A. Karyagina и соавт. [19]. Показано, что эффективность взаимодействия рекомбинантного белка 6His-RBD_short с вируснейтрализующими антителами сопоставима с таковой для положительного контроля (eRBD). В случае рекомбинантного белка 6His-RBD_long взаимодействия с вируснейтрализующими антителами не наблюдалось.

Противовирусная активность рекомбинантных белков 6His-RBD_shortи 6His-RBD_longв отношении вируса SARS-CoV-2. Было проведено изучение цитотоксичности рекомбинантных белков 6His-RBD_short и 6His-RBD_long, а также белка eRBD в качестве контроля. Показано, что все препараты белков в исследуемой концентрации (0,55 мкМ) нетоксичны для клеток Vero E6 (МТТ-тест), так как отсутствовало снижение пролиферативной активности клеток при инкубировании с препаратами в течение 72 ч.

Анализ вирусной нагрузки в среде клеток через 24 ч после заражения вирусом SARS-CoV-2 показал ингибирование размножения вируса после обработки клеток препаратами белков eRBD (42,8%) и 6His-RBD_short (45,1%) в эквимолярных концентрациях (0,55 мкМ) (рис. 5, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2023_02_033_add.zip). У препарата 6His-RBD_long наблюдалось отсутствие ингибирования.

Большинство рекомбинантных субъединичных вакцин для профилактики коронавирусной инфекции, а также тест-системы для серологического тестирования заболевших и вакцинированных основываются на использовании RBD SARS-CoV-2, полученного экспрессией в клетках млекопитающих [22, 23].

Несмотря на некоторые преимущества (правильный фолдинг, посттрансляционная модификация), экспрессия белков в эукариотах требует больших временных и денежных затрат, сложных лабораторных условий. Только в нескольких исследованиях сообщалось об экспрессии RBD в прокариотических системах для изучения его структурных характеристик, взаимодействия с ACE2-рецептором и антителами переболевших COVID-19 [14, 17, 24, 25]. Однако одобренных для использования препаратов на основе прокариотического RBD нет.

В этой работе мы сконструировали два рекомбинантных белка для экспрессии в клетках E. coli, включающие различные по длине фрагменты Spike-белка, которые содержат участок RBM, играющий ключевую роль в связывании с ACE2-рецептором и нейтрализующими антителами [3]. Оба белка имеют сложную трехмерную структуру, стабилизированную несколькими дисульфидными мостиками.

При суперэкспрессии в бактериальных клетках генов эукариотических белков со сложной структурой, стабилизируемой дисульфидными связями, не происходит правильного фолдинга, и оба рекомбинантных белка 6His-RBD_short и 6His-RBD_long образуют нерастворимые тельца включения. После аффинной очистки белков был проведен длительный многоступенчатый рефолдинг, включающий стадии денатурации в присутствии гуанидин гидрохлорида, восстановление дисульфидных связей с помощью ДТТ, медленное снятие денатурирующих условий с последующей длительной инкубацией в присутствии пары глутатионов (окисленная/восстановленная формы) и антиагреганта аргинина.

Дополнительная очистка на катионообменнике Workbeads 40S после рефолдинга 6His-RBD_short и 6His-RBD_long позволила удалить оставшиеся примесные белки.

Иммуноферментный анализ показал сравнимые результаты взаимодействия белков 6His-RBD_short и eRBD с гуманизированными однодоменными моноклональными антителами GamP2C5 и GamXRH19, специфичными в отношении RBD Spike-белка SARS-CoV-2, обладающими высокой противовирусной активностью [20] и являющимися компонентами препарата ГамКовиМаб для экстренной профилактики и ранней этиотропной терапии коронавирусной инфекции, вызываемой вирусом SARS-CoV-2, успешно прошедшего I фазу клинических исследований. При этом рекомбинантный белок 6His-RBD_long на основе длинного фрагмента RBD практически не взаимодействовал с антителами. Это может быть обусловлено неправильным рефолдингом данного варианта белка, содержащего дополнительную аминокислотную последовательность, соответствующую структурному домену, который в нативном виде является частью структуры Spike-белка. Можно предположить, что в случае включения в структуру длинного фрагмента RBD данного домена приводит к его взаимодействию с другими структурными доменами 6His-RBD_long, что проводит к образованию различных конформаций. Об этом может свидетельствовать наблюдающаяся размытость полос белка, а также отсутствие различий в подвижности белка в присутствии и при отсутствии восстанавливающего агента в препаратах после рефолдинга на электрофореграмме в невосстанавливающих условиях (см. рис. 3, б, дорожки 9, 10). Активный белок 6His-RBD_short имеет более тонкие полосы в геле с различной подвижностью в присутствии и при отсутствии восстанавливающего агента (см. рис. 3, а, дорожки 9, 10).

Исследование противовирусной активности препаратов рекомбинантных белков 6His-RBD_short и 6His-RBD_long в отношении вируса SARS-CoV-2 проводили на клетках линии Vero E6. У прокариотического (6His-RBD_short) и эукариотического вариантов белков были получены сопоставимые значения коэффициентов ингибирования, определяющих способность препятствовать проникновению вируса SARS-CoV-2 в клетки. Наблюдаемые результаты свидетельствуют об эффективном взаимодействии рекомбинантных белков с ACE2-рецептором на поверхности клеток. При этом 6His-RBD_long не оказывал ингибирующего действия на проникновение и размножение вируса.

Отличительной особенностью данного исследования является практически аналогичное поведение эукариотического (eRBD) и прокариотического (6His-RBD_short) препаратов в отношении связывания с антителами и противовирусной активности. Имеющиеся данные литературы свидетельствуют о том, что RBD, синтезированный в клетках E. coli, отличается сниженной в ~2 раза эффективностью взаимодействия с сыворотками переболевших COVID-19 (по данным иммуноферментного анализа) [26], а также показывает сравнительно слабое связывание со специфическими антителами крыс [27] по сравнению с eRBD.

Известно, что при экспрессии белков в прокариотах отсутствуют характерные для эукариот посттрансляционные модификации, в первую очередь гликозилирование. Укороченный фрагмент RBD Spike-белка (330—527 а.о.), на основе которого был создан рекомбинантный белок 6His-RBD_short, содержит два сайта гликозилирования (Asn331, Asn343), не входящих в RBM, поэтому гликозилирование не должно влиять на связывание RBD с ACE2. В работе L. Núñez-Muñoz и соавт. было показано, что экспрессированные в E. coli рекомбинантные белки на основе участков RBD, не содержащих сайты гликозилирования, способны эффективно распознаваться антителами выздоровевших после COVID-19 пациентов, а также обладают противовирусной активностью [28].

Определяющим фактором для эффективного связывания RBD с ACE2 является нативная конформация белка, обусловленная в первую очередь правильным образованием дисульфидных связей. В работе A. Grishin и соавт. было показано, что дисульфидные связи играют критическую роль в поддержании правильной структуры RBD, обеспечивая высокоаффинное взаимодействие с клеточным рецептором ACE2 [6]. При этом связывание RBD с ACE2 снижалось на два порядка в присутствии восстановителей, таких как ДТТ.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что нам удалось разработать методику получения в клетках E. coli рекомбинантного белка 6His-RBD_short, не уступающего eRBD по взаимодействию как со специфическими антителами, так и с клетками млекопитающих. После проведения дополнительных исследований разработанный рекомбинантный белок 6His-RBD_short может быть рассмотрен в качестве перспективного препарата для использования в терапевтических целях в качестве блокатора рецептора ACE2.

Финансирование работы

Исследование было проведено в рамках выполнения государственного задания Минздрава России №056-00119-21-00 («Разработка препарата блокатора рецептора ACE2 для профилактики и терапии коронавирусной инфекции»).

Соблюдение этических стандартов

Настоящая статья не содержит описания исследований, выполненных кем-либо из авторов данной работы, с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.