Введение
Коклюш продолжает лидировать в группе управляемых инфекционных заболеваний, несмотря на проводимую в мире массовую вакцинацию с начала 1950-х годов XX столетия [1]. В экономически развитых странах, где охват детского населения прививками достигает 95%, с начала 2000-х годов отмечается рост заболеваемости коклюшем, приближающийся к уровню довакцинного периода [2—5]. В России в 2018—2019 гг. на фоне гиподиагностики отмечен двукратный рост количества регистрируемых случаев коклюша в сравнении с 2017 г. [6, 7]. Отмечается распространение атипичных форм коклюша среди подростков и взрослых, в том числе бессимптомного носительства [2, 8—10]. Так как коклюш является исключительно антропонозным инфекционным заболеванием, по-видимому, эти группы людей обеспечивают поддержание циркуляции возбудителя, прежде всего, в межэпидемический период. Поддержание циркуляции антропонозного возбудителя возможно за счет большого числа больных людей с разным течением заболевания либо/и за счет длительного бактерионосительства практически здоровыми людьми. Наличие и сроки бактерионосительства до последнего времени не изучались. Одно из первых обследований практически «здоровых» подростков и взрослых, выполненное нами в 2010 г., с использованием разработанной нами высокочувствительной тест-системы ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ-IS) показало наличие длительного носительства бактерий Bordetella pertussis [10, 11]. Дальнейшие исследования в этом направлении позволили выявить длительную (более 3 мес) персистенцию вирулентных и аттенуированных бактерий B. pertussis в носоглотке низших обезьян, иммунизированных противококлюшной вакциной ГамЖВК [12, 13]. Более поздние исследования, проведенные в семейных очагах коклюша, показали, что у 86% обследованных контактных лиц регистрируется ДНК бактерий B. pertussis, из них у 35% возбудитель обнаруживали при отсутствии кашля. В ряде случаев ДНК возбудителя обнаруживается в носоглотке контактных и реконвалесцентных лиц в течение всего срока наблюдения (6 мес) [14, 15], что значительно превышает сроки, установленные карантином при коклюше. Таким образом, использование высокочувствительной тест-системы ПЦР-РВ-IS позволило установить возможность длительной персистенции возбудителя коклюша у переболевших и бессимптомных бактерионосителей. Длительная персистенция бактерий в организме переболевших и вакцинированных людей может приводить к формированию мутантов B. pertussis, приспособившихся к выживанию в иммунизированном организме. Такие мутанты, прежде всего, по генам протективных антигенов, входящих в состав бесклеточных коклюшных вакцин, в большом количестве регистрируются при анализе популяции штаммов B. pertussis, циркулирующих в настоящее время [16].
Экспрессия более 550 генов бактерий B. pertussis, из которых 245 являются vir-активируемыми генами (virulence activated genes, vag) и 326 — vir-репрессируемыми (virulence repressed genes, vrg), регулируется двухкомпонентной системой BvgA/BvgS в результате фосфорилирования регулятора транскрипции BvgA (BvgA~P) сенсорной фосфокиназой BvgS. Все известные гены вирулентности бактерий, включая bvgAS, относятся к vag-генам, экспрессирующимся в вирулентной фазе I, при этом vrg-гены экспрессируются в IV фазе, в авирулентном состоянии бактерии. Промежуточные фазы вирулентности II и III характеризуются частичной экспрессией vag- и vrg-генов. Описаны два типа мутаций, индуцирующих переход от фазы I к фазе IV in vitro: мутация со сдвигом рамки считывания («frameshift») в гене bvgS [17] и мутации, возникающие в результате внедрений мобильных генетических элементов IS481 или IS1002 в специфический сайт оперона bvgAS [18, 19]. Изменение условий культивирования бактерий также может привести к обратимому изменению фазового состояния бактерий [20]. В последние десятилетия активно обсуждаются роль и значение фазовых состояний в обеспечении выживания бактерий в организме хозяина и в передаче другому хозяину. Если роль фазы I в патогенезе коклюша не подвергается сомнению, то фаза IV считалась некоторыми исследователями «тупиком эволюции», не имеющим значения для выживания и распространения возбудителя. Однако исследования последних лет указывают, что, по крайней мере, переживание бактерий в организме хозяина, скорее всего, происходит в авирулентном фазовом состоянии [2, 21, 22].
Инсерционные мутанты обнаружены нами в экспериментах с лабораторными мышами, обезьянами [12, 23] и в результате изучения популяций бактерий B. pertussis, присутствующих в носоглотке больных, реконвалесцентов и контактировавших с ними практически здоровых бактерионосителей [10, 14].
Эти данные, наряду с существованием большого количества псевдогенов в составе хромосомы B. pertussis, а также наличием фактов участия МГЭ в регуляции экспрессии генов других микроорганизмов, позволили нам сформулировать гипотезу, предполагающую участие IS-элементов B. pertussis в регуляции вирулентности возбудителя в результате их перемещения в оперон вирулентности bvgAS B. pertussis.
Цель настоящего исследования — оценка сроков персистенции и анализ состава популяций бактерий B. pertussis у больных коклюшем детей и контактных лиц в семейных очагах.
Материал и методы
Исследование проводили на базе Детского научно-клинического центра инфекционных болезней ФМБА России. В период с 2015 по 2017 г. проведено проспективное, открытое, сплошное, одноцентровое исследование. Обследованы 80 детей с лабораторно подтвержденным диагнозом «коклюш», госпитализированных в детскую городскую клиническую больницу №5 им. Н.Ф. Филатова (ДГКБ №5 им. Н.Ф. Филатова) Санкт-Петербурга, а также 116 контактировавших с ними родственников из 59 семейных очагов. Пациентов и контактных лиц включали в протокол исследования после подписания информированного согласия.
Материал для выявления геномэквивалентов (ГЭ) ДНК B. pertussis отбирали с задней стенки носоглотки через нижний носовой ход с помощью гибких назофарингеальных велюр-тампонов («COPAN», Италия). Смывы с тампонов центрифугировали в течение 10 мин при 12 000 об/мин (центрифуга Eppendorf, Германия). Осадок ресуспендировали в 200 мкл деионизированной воды, ДНК выделяли с использованием магнитного сорбента в соответствии с инструкцией к набору Wizard Genomic DNA Purification System («Promega», США) [12].
Выявление ГЭ ДНК B. pertussis и инсерционных bvg-мутантов проводили методом ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанной нами тест-системы ПЦР-РВ-IS. Регистрацию интеграций IS481 в специфический сайт оперона bvgAS осуществляли с помощью гнездовой ПЦР. Специфичность продуктов второй реакции гнездовой ПЦР определяли путем секвенирования генома [12].
Бактериальную нагрузку возбудителя коклюша в верхних дыхательных путях и количество инсерционых мутантов B. pertussis у детей с диагнозом «коклюш» проводили при поступлении в стационар, при выписке и в динамике при катамнестическом наблюдении (1—6 мес). У контактных лиц в семейных очагах мазки брали у детей и взрослых в течение 1—6 мес после первичного обследования. Бактериальную нагрузку учитывали по количеству ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл образца, полученного после выделения ДНК B. pertussis из носоглоточных мазков и растворения в 200 мкл воды.
Для статистической обработки результатов исследований использованы методы описательной статистики. В таблицах представлены количественные значения ГЭ, определенные по результатам двух измерений. Средняя относительная ошибка количества ГЭ составила 20%.
Результаты
1. Распределение больных коклюшем детей и контактных лиц в семейных очагах по количеству ГЭ ДНК B. pertussis в образцах
Обследованы 80 детей с лабораторно подтвержденным коклюшем и 116 лиц, контактировавших с заболевшими коклюшем детьми в 59 семейных очагах. Детей с диагнозом «коклюш» разделили на три группы: младенцы до 1 года (n=49), дети раннего возраста от 1 до 3 лет (n=14) и школьники и подростки в возрасте 7—14 лет (n=17). Госпитализированные дети не были вакцинированы против коклюша или имели незаконченный курс вакцинации. Распределение по количеству ГЭ ДНК B. pertussis, выявленных при госпитализации в этих группах детей, представлено в табл. 1.
Таблица 1. Количество ГЭ ДНК B. pertussis при первичном обследовании детей с диагнозом «коклюш»
| Количество ГЭ ДНК B.pertussis в 5 мкл образца | Возраст | ||
| ≤1 года (n=49) (%) | 1—3 года (n=14) (%) | 7—14 лет (n=17) (%) | |
| ≤1—3 (2—6·102)* | 6,1 | 28,6 | 64,7 |
| 3—30 (6·102—6·103)* | 18,4 | 21,4 | 23,5 |
| ≥30 (≥6·103)* | 75,5 | 50,1 | 11,8 |
Примечание. * — количество ГЭ ДНК B. pertussis в 1 мл препарата.
У 64,7% детей старшего возраста при госпитализации обнаружено <1—3 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл образца. Такое же количество ГЭ ДНК B. pertussis зарегистрировали у 28,6% больных коклюшем в возрасте 1—3 года и только у 6,1% — в возрасте менее 1 года. В каждой из возрастных групп в 18—24% случаев зарегистрировано 3—30 ГЭ ДНК B. pertussis.В старшей группе зарегистрировано 30—100 ГЭ ДНК B. pertussis только у 11,8% больных, в возрасте 1—3 лет — у 50%, а в возрасте до 1 года — у 75,5% (см. табл. 1).
Среди контактных лиц взрослые старше 18 лет составили 59,5%, дети школьного возраста и подростки — 22,4%, дети раннего и дошкольного возраста — 18,1%. Привитыми от коклюша были 102 человека, не привитыми — 13 детей в возрасте 2—10 лет и 1 ребенок — не закончивший полный курс вакцинации. При сборе анамнеза и осмотре было установлено, что у 35,4% контактных лиц кашель отсутствовал, у 19,8% — отмечался типичный приступообразный кашель, у 44,8% — были жалобы на сухой кашель. Никому из контактных членов семьи диагноз «коклюш» не был установлен, хотя клинические признаки заболевания регистрировали у 64,6% обследуемых лиц, в том числе у 19,8% — в типичной форме [14].
Контактных лиц также разделили на три группы: взрослые от 18 лет и старше (n=64), дети от 4 до 17 лет (n=44), дети младше 3 лет (n=8). Для оценки распределения использовали те же значения количества ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл образца: >30 ГЭ; 3—30 ГЭ; и <1—3 ГЭ. Результаты анализа представлены в табл. 2.
Таблица 2. Количество ГЭ ДНК B. pertussis при первичном обследовании контактных лиц в семейных очагах
| Количество ГЭ ДНК B.pertussis в 5 мкл образца | Возраст | ||
| ≤3 лет (n=8) (%) | 4—17 лет (n=44) (%) | взрослые (n=64) (%) | |
| ≤1—3 (2—6·102)* | 37,5 | 56,8 | 37,5 |
| 3—30 (6·102—6·103)* | 25 | 25,0 | 42,2 |
| ≥30 (≥6·103)* | 37,5 | 18,2 | 20,3 |
Примечание. * — количество ГЭ ДНК B. pertussis в 1 мл препарата.
Максимальную бактериальную нагрузку B. pertussis наблюдали в 37,5% случаев у детей в возрасте до 3 лет, у детей 7—14 лет и взрослых — в 18—20% случаев. У 42,2% взрослых, 25% детей 7—14 лет и 25% детей младше 3 лет зарегистрировали 3—30 ГЭ ДНК B. pertussis. Минимальное количество ГЭ ДНК B. pertussis зарегистрировано у 37,5% взрослых, 56,8% детей 7—14 лет и 37,5% детей в возрасте до 3 лет (см. табл. 2). Сухой навязчивый или приступообразный кашель отмечался у 40% взрослых, 80% детей 4—17 лет и 92% детей в возрасте младше 3 лет.
2. Состав популяций бактерий B. pertussis у больных коклюшем детей и контактных лиц в семейных очагах
Состав популяции бактерий B. pertussis оценивали по наличию мутантов B. pertussis, содержащих интеграцию IS481 в оперон bvgAS. В качестве показателя гетерогенности состава популяции использовали величину n =NINS/NGE), где NINS — количество ГЭ ДНК B. pertussis, содержащих интеграцию, а NGE — общее количество ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл образца. Значения NINS и NGE определяли с помощью разработанной нами тест-системы ПЦР-РВ-IS [10—12]. Определение аналитической чувствительности, выполненное в результате титрования клонированной последовательности, содержащей фрагмент инсерции IS481 в опероне bvgAS, показало, что проведение ПЦР-РВ и однократной ПЦР позволяет зарегистрировать порядка 3 копий таких фрагментов в 5 мкл образца. Таким образом, событие интеграции может быть зарегистрировано в образцах, содержащих 3 копии ДНК B. pertussis в 5 мкл, если все они содержат искомую интеграцию. Например, доля ГЭ ДНК B. pertussis, содержащих инсерцию, составляет 10% от общего количества ГЭ. Это означает, что при заданной чувствительности в образце должно быть не менее 30 ГЭ ДНК B. pertussis. Титрование ДНК B. pertussis показывает, что ПЦР-РВ, основанная на амплификации повторяющейся последовательности IS481, способна выявлять ГЭ ДНК B. pertussis с концентрацией в 100 раз меньше — 0,05 ГЭ в 5 мкл. Задача выявления интеграций <1—3 ГЭ ДНК B. pertussis может быть решена либо за счет повышения чувствительности тест-системы, либо вследствие увеличения объема анализируемого образца. Использование метода гнездовой ПЦР (нестед-ПЦР) позволило нам реализовать оба подхода. Аналитическая чувствительность нестед-ПЦР повышается до 1 копии целевой мишени, а использование 3—5 реакций, поставленных одновременно, снижает минимально регистрируемое количество ДНК B. pertussis до заданного среднего значения в 0,5—1,0 ГЭ ДНК B. pertussis, содержащих только инсерционные мутанты и порядка 5 молекул при содержании интеграции не менее, чем в 10% геномов B. pertussis. Таким образом, поиск событий интеграций с помощью нестед-ПЦР целесообразно проводить в образцах, содержащих не менее 0,5—1,0 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл раствора, в 3—5 пробирках. Положительным результатом считается выявление искомого продукта ПЦР даже в одной пробе. Решающим условием достоверного определения положительного сигнала является его отсутствие в пробирках контроля (К-), содержащих реакционную смесь и воду.
Только часть образцов, выделенных нами от больных коклюшем и контактных лиц, удовлетворяла сформулированному критерию, поэтому для анализа с помощью нестед-ПЦР использовали все образцы ДНК B. pertussis, выделенные на разных этапах исследования и содержащие не менее 0,5—1 копии ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл. В табл. 3 представлены результаты анализа образцов, полученных от больных в динамике, содержащих не менее 1 копии ГЭ в 5 мкл. Номер образца, возраст обследованных, наличие и длительность кашлевого синдрома, количество ГЭ ДНК B. pertussis и наличие интеграций в исследуемой точке представлены в соответствующих графах табл. 3. В последней графе таблицы представлены значения количества ГЭ ДНК B. pertussis, наличие интеграций и номер образца, взятого у больного при госпитализации. Количество образцов от реконвалесцентов с содержанием ДНК, близким к выбранному параметру, составило 22. Образцы №№103, 223 и 26 взяты у одного больного в разные сроки, как и №№301 и 372. Число обследованных больных, удовлетворяющих сформулированным выше критериям, составило 20.
Таблица 3. Анализ интеграций IS481 в оперон bvgAS B. pertussis у больных коклюшем детей в период реконвалесценции
| № п.п. | № образца | Количество ГЭ B. pertussis в 5 мкл в точке i | Возраст ребенка | Длительность и течение заболевания в точке i | Интеграции | Количество ГЭ ДНК B.pertussis в 5 мкл образца при госпитализации |
| 1 | 103 | 0,9 | 1 год | 3 мес, к | Нет | 4,7·104, №26, ИП |
| 2 | 223 | 0,8 | 1 год | 5 мес, к | Нет | 4,7·104, №26, ИП |
| 3 | 213 | 1,7 | 4 мес | 2 мес, к | Нет | 12, №168, ИО |
| 4 | 117 | 2,3·102 | 1 мес | 2 мес, к | Нет | 1,8·103, №45, ИО |
| 5 | 226 | 1,1 | 1 год 8 мес | 5 мес, к | Нет | 19, №32, ИО |
| 6 | 349 | 1,0 | 1 мес | 6 мес, к | Нет | 29, №116, ИО |
| 7 | 375 | 3,2 | 2 мес | 3 мес, к | Нет | 2,1·103, №285, ИО |
| 8 | 340 | 1,9 | 1 мес | 4 мес, к | Нет | 43, №192, ИО |
| 9 | 234 | 0,9 | 7 мес | 2,5 мес, КК | Нет | 15, №150, ИО |
| 10 | 100 | 0,8 | 9 мес | 2 мес, к | Нет | 2,3·102, №61, ИО |
| 11 | 339 | 10 | 4 мес | 6 мес, к | Есть | 5·103, №69, ИО |
| 12 | 372 | 1,0 | 10 мес | 2,5 мес, к | Есть | 18, №301, ИО |
| 13 | 253 | 1,1 | 3 года | 3 мес, к | Нет | 15, №127, ИО |
| 14 | 252 | 1,1 | 7 лет | 3 мес, к | Нет | 8,5, №134, ИО |
| 15 | 343 | 2,5 | 5 мес | 2 мес, к | Нет | 2,7·103, №247, ИО |
| 16 | 224 | 2,2 | 3 мес | 2,5 мес, к | Есть | 4,4·103, №139, ИО |
| 17 | 187 | 0,9 | 1 год 9 мес | 2,5 мес, к | Есть | 2,4·104, №109, ИО |
| 18 | 231 | 10 | 1 мес | 1,5 мес, КК | Нет | 6,1·103, №181, ИО |
| 19 | 166 | 1,0 | 1 мес | 3 мес, к | Нет | 1,9·103, №78, ИО |
| 20 | 373 | 1,0 | 1 год 9 мес | 3 мес, к | Нет | 10, №210, ИО |
| 21 | 148 | 3,3 | 2 мес | 2 мес, КК | Есть | 7·104, №91, ИП |
| 22 | 176 | 15 | 1 мес | 1 мес, КК | Нет | 6,1·103 №138, ИО |
Примечание. мес — месяцы наблюдения; к — сухой периодический кашель; КК — характерный коклюшный кашель; нет/есть — наличие интеграций IS481 в оперон bvgAS; ИО — интеграции IS481 в оперон bvgAS в образце при госпитализации отсутствуют; ИП — интеграции IS481 в оперон bvgAS в образце присутствуют. В последней графе таблицы последовательно указаны цифры: количество ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл, № образца, время отбора образца.
Для определения бактериальной нагрузки и состава популяции возбудителя коклюша при госпитализации с помощью ПЦР-РВ проанализированы образцы, содержащие не менее 104 ГЭ B. pertussis. В 2 образцах (№№26 и 91), полученных при госпитализации, количество ГЭ ДНК B. pertussis соответствовало минимуму для достоверного определения интеграции с помощью ПЦР-РВ. Оба образца содержали около 5—7·104 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл, а ДНК B. pertussis имела вставки IS481 в оперон bvgAS с частотой около 5·10–5. Методом нестед-ПЦР проанализировали 9 образцов, содержащих 103—2·104 ГЭ ДНК B. pertussis, и 11 образцов, содержащих от 8,5 до 200 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл. Ни в одном из этих образцов ни с одним из примененных методов ПЦР не были обнаружены bvg-мутанты, содержащие внедрение IS481 в оперон bvgAS.
На следующем этапе исследования в 22 образцах, взятых в период реконвалесценции через 2,5—6 мес, выявляли инсерционные мутанты B. pertussis. С помощью гнездовой ПЦР содержание мутантной хромосомы B. pertussis зарегистрировали в 5 образцах (см. табл. 3). Два образца из 5, полученных от больных при госпитализации, содержали в среднем 4,8·103 ГЭ B. pertussis в 5 мкл, остальные — 4,7·104. У 1 ребенка с диагнозом «коклюш» при госпитализации было обнаружено 18 ГЭ ДНК B. pertussis (№301) при отсутствии интеграций, а через 2,5 мес сухого кашля — 1 ГЭ ДНК B. pertussis (№372), содержащий IS481 в опероне bvgAS. Из 17 образцов, взятых при госпитализации, 2 содержали 4,7·104 ГЭ ДНК; 6 — (2—6)·103 ГЭ и 1 (№61) — порядка 2,3·102 ГЭ ДНК B. pertussis. Восемь образцов содержали <100 ГЭ ДНК B. pertussis. У 3 обследованных в течение 1—1,5 мес отмечали типичный «коклюшный» кашель. Четыре из 5 положительных образцов были взяты через 2—2,5 мес после госпитализации и 1 — через 6 мес. Возраст детей, в мазках которых обнаружены инсерционные мутанты B. pertussis, составлял от 3 мес до 1 года 9 мес. И только у 1 ребенка в возрасте 2 мес на момент обследования наблюдали характерный спастический кашель, тогда как у остальных детей кашель был сухой и редкий.
Таким образом, из 20 обследованных больных коклюшем детей, у которых в периоде реконвалесценции был обнаружен 1 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл и более, у 5 (25%) выявлены инсерционные мутанты с внедрениями IS481 в оперон bvgAS.
Согласно сформулированному нами критерию, для анализа отобрали 50 образцов от членов семей, контактировавших с больными коклюшем. В 7 образцах от контактных лиц в разные сроки наблюдения регистрировали инсерционные мутанты B. pertussis. В 19 случаях мазки были взяты в динамике дважды. В табл. 4 представлена характеристика кашля у контактных членов семьи на момент обследования, количество ГЭ ДНК B. pertussis и наличие инсерций в хромосоме B. pertussis.
Таблица 4. Интеграции IS481 в оперон bvgAS бактерий B. pertussis у членов семей, контактировавших с больными коклюшем
| № п.п. | № образца | Количество ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл образца | Возраст контактных лиц (годы) | Время наблюдения и клиническая картина заболевания | Интеграции | Количество ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл образца при первом/повторном обследовании* |
| 1 | 356 е | 1,8 | 30 | ко | Нет | — |
| 2 | 289 е | 17 | 33 | ко | Нет | — |
| 3 | 191 е | 1,0 | 34 | ко | Нет | — |
| 4 | 155 е | 8 | 52 | 2 нед, к | Нет | — |
| 5 | 177 е | 80 | 33 | ко | Нет | — |
| 6 | 319 | 30 | 22 | 1 нед, к | Нет | 10, №299, ко, ИО |
| 7 | 367 е | 0,7 | 28 | 2 мес, к | Нет | — |
| 8 | 314 е | 1,0х·103 | 27 | ко | Нет | — |
| 9 | 310 е | 6 | 25 | ко | Есть | — |
| 10 | 316 е | 29 | 23 | ко | Нет | — |
| 11 | 324 е | 10 | 31 | ко | Нет | — |
| 12 | 296 е | 4,0·104 | 35 | ко | Есть | — |
| 13 | 298 е | 9 | 36 | ко | Нет | — |
| 14 | 293 е | 9 | 9 | ко | Нет | — |
| 15 | 378 | 0,6 | 30 | 3,5 мес, ко | Есть | 5; №287; ко, ИО |
| 16 | 180 | 5 | 27 | ко | Нет | 3,5·103; №203; 1 нед, КК; ИО |
| 17 | 27 е | 0,6 | 12 | ко | Нет | — |
| 18 | 175 | 12 | 32 | 2 мес, к | Нет | 10; №137; 1 мес, КК, ИО |
| 19 | 318 | 1,9·103 | 31 | 1 нед, к | Нет | 50; №290; ко, ИО |
| 20 | 335 | 1,0 | 4 | 3,5 мес, кн | Есть | 4,8; №199; 3 нед, к, ИО |
| 21 | 344 | 13,5 | 52 | 2 нед, к | Нет | 2,8; №331; 1 нед, к, ИО |
| 22 | 214 | 1,0 | 32 | 2,5 мес, к | Нет | 1,4; №162; 3 нед, КК, ИО |
| 23 | 136 | 0,9 | 30 | 2 нед, к | Нет | 0,4; №227; 3 мес, к, ИО |
| 24 | 229 е | 3,1 | 7 | 5 мес, к | Нет | — |
| 25 | 233 | 2,3·103 | 14 | 5,5 мес, к | Нет | 4·104; №33; 2 нед, к, ИО |
| 26 | 225 | 0,9 | 13 | 5,5 мес, к | Нет | 2,3·102; №37; 2 нед, к, ИО |
| 27 | 355 е | 4,3 | 6 | 4,5 мес, к | Нет | — |
| 28 | 230 е | 1,3 | 4 | 2,5 мес, к | Нет | — |
| 29 | 164 е | 18,5 | 10 | 1 мес, к | Есть | — |
| 30 | 97 е | 6,1 | 10 | 1 мес, к | Нет | — |
| 31 | 304 е | 2,1·102 | 55 | ко | Нет | — |
| 32 | 246 е | 7,5 | 32 | 1 нед, к | Нет | — |
| 33 | 70 е | 1,2 | 6 | 1нед, к | Нет | — |
| 34 | 239 | 0,5 | 26 | 1,5 мес, к | Нет | 3,8·105; №196; 2 нед, КК, ИО |
| 35 | 211 е | 1,1 | 33 | 2 мес, к | Нет | — |
| 36 | 282 е | 39,5 | 8 | 1 нед, к | Нет | — |
| 37 | 277 | 1,5 | 34 | 3 нед, к | Есть | 3,85·102, №266, 1 нед, к, ИО |
| 38 | 295 е | 1,2 | 14 | ко | Есть | — |
| 39 | 125 | 1,7 | 2 г | ко | Нет | 7·102; №71; 1 мес, КК, ИО |
| 40 | 217 е | 5,5 | 56 | 2 нед, к | Нет | — |
| 41 | 291 е | 1,0 | 64 | ко | Нет | — |
| 42 | 297 е | 1,6 | 58 | ко | Нет | — |
| 43 | 53 е | 1,0 | 8 | 1 мес, к | Нет | — |
| 44 | 201 е | 3,3 | 30 | 3 нед, КК | Нет | — |
| 45 | 240 е | 1,0 | 29 | 1,5 мес, к | Нет | — |
Примечание. * — первым взят образец с меньшим порядковым номером; мес — месяцы наблюдения, нед — недели наблюдения; к — сухой периодический кашель; КК — характерный коклюшный кашель; ко — кашель отсутствует; нет/есть — наличие интеграций IS481 в оперон bvgAS; е — однократное измерение интеграций IS481 в одной временной точке; ИО — интеграции IS481 на момент госпитализации отсутствуют; ИП — интеграции IS481 присутствуют на момент госпитализации. В последней графе таблицы последовательно указаны цифры: количество ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл, № образца, время отбора образца.
В 4 из 7 ПЦР-положительных образцов содержалось около 1 ГЭ ДНК B. pertussis, в 1 образце — 6 ГЭ, в 1 — 18 ГЭ и еще в 1 — 4·104 ГЭ. Положительные образцы были у 3 детей в возрасте 14, 10 и 4 лет. Остальные образцы получены от взрослых контактных членов семей. Среди них образец от «практически здорового» на момент исследования контактного взрослого (№296), взятый одновременно с госпитализированным ребенком. Образец содержал 5·104 ГЭ B. pertussis в 5 мкл. Образцы, не содержащие инсерционных мутантов B. pertussis, имели примерно то же количество ДНК B. pertussis. Основная масса «отрицательных» образцов, не выявивших инсерционных мутантов у детей в том же возрастном диапазоне, также содержала 1—10 ГЭ ДНК B. pertussis. Однако среди них обнаружено 7 образцов со значительно большим количеством ГЭ B. pertussis в 5 мкл — 50·104.
Образцы в парах 33 и 233, 299 и 319, 287 и 378, 299 и 319, 199 и 335 принадлежали одному обследованному лицу. Итого 50 исследованных образцов принадлежали 47 контактировавшим членам семей. Следовательно, доля контактных лиц, в аспиратах которых были выявлены инсерционные мутанты B. pertussis, составила 14,9%.
В рамках настоящей работы проведено исследование с целью выявления корреляции между количеством обнаруженных бактерий B. pertussis и составом их популяции с тяжестью заболевания и формированием бактерионосительства у членов семей, контактных с больными коклюшем детьми. Из общего числа больных коклюшем выбрали детей, участвовавших более чем в одном обследовании. Для анализа состава популяции бактерий B. pertussis выбирали образцы, полученные в разные сроки наблюдения, в 5 мкл которых содержалось не менее 0,5—1 ГЭ ДНК B. pertussis.
Обращает на себя внимание большой разброс в значениях ГЭ ДНК B. pertussis — от 5·104 до <1 ГЭ в 5 мкл образца у больных коклюшем детей разного возраста. У 64,7% детей 7—14 лет при первичном обследовании обнаружено <1—3 ГЭ ДНК B.pertussis в 5 мкл образца. То же количество ГЭ ДНК B. pertussis зарегистрировано у 28,6% больных коклюшем в возрасте 1—3 лет и только у 6,1% — в возрасте менее 1 года. В каждой из возрастных групп в 18—24% случаев зарегистрировано от 3—30 ГЭ ДНК B. pertussis. Более 30—100 ГЭ зарегистрировано у 11,8% больных детей 7—14 лет, у 50% — 1—3 лет, у 75,5% — младше 1 года (см. табл. 1).
Данные анамнеза больных коклюшем детей и контактных лиц не позволили сделать однозначное заключение об источнике инфекции в каждом из семейных очагов. Однако сопоставление данных табл. 1 и 2 показывает, что при первичном ПЦР-исследовании у контактных лиц регистрируется больше ГЭ ДНК B. pertussis (>30), чем у больных коклюшем. Вероятно, именно они являются источником инфекции. Наличие характерного для коклюша кашля у большинства детей и подавляющей части контактных лиц, в образцах которых выявлено значительно отличающееся друг от друга количество ГЭ ДНК B. pertussis, указывает на то, что на этапе реконвалесценции выраженность кашлевого синдрома не коррелирует с количеством персистирующих в носоглотке бактерий B. pertussis. Для понимания взаимосвязи между бактериальной нагрузкой и клинической картиной коклюша необходимы дальнейшие исследования, в том числе направленные на анализ соответствия иммунного ответа и состава популяций бактерий B. pertussis.
Отдельные ГЭ ДНК B. pertussis регистрировали в образцах реконвалесцентов через 6 мес после первичного ПЦР-анализа и госпитализации больного. При схожей клинической картине у детей младшего возраста (1—3 лет) регистрируется значительно большее количество бактерий B. pertussis, чем у детей старше 3 лет и взрослых. Снижение бактериальной нагрузки у детей старших возрастных групп и взрослых, вероятно, связано с увеличением по мере взросления количества контактов с возбудителем коклюша и формированием специфического иммунитета. Подтверждением этого могут служить результаты серологического анализа сывороток крови детей старших возрастных групп и взрослых, где до 70% обследованных содержат специфические антитела против возбудителя коклюша [24].
Обсуждение
Полученные нами результаты показывают, что у больных детей младше 3 лет в периоде спазматического кашля бактериальная нагрузка в большинстве случаев составляет >2·103 ГЭ ДНК B. pertussis в 1 мл (>30 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл). В этом случае для лабораторной диагностики коклюша может быть использована коммерческая тест-система, обеспечивающая чувствительность 3—5 копий в 5 мкл образца [25]. Однако ПЦР-диагностика коклюша с помощью коммерческой тест-системы в группе заболевших старше 7 лет и контактных лиц всех возрастов, скорее всего, будет неэффективна ввиду малого количества ДНК возбудителя коклюша в образцах, на что указывают результаты сравнения коммерческой тест-системы и ПЦР-РВ-IS, приведенные в предыдущем исследовании [14].
Анализ образцов, содержащих не менее 1 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл, методом нестед-ПЦР показал, что у 25% обследованных через 2,5—6 мес после первичного обследования регистрировали инсерционные bvg-мутанты B. pertussis. Учитывая, что большинство образцов отобрано в период реконвалесценции при малом количестве (1—2 копии) ДНК возбудителя коклюша, можно утверждать, что популяции бактерий B. pertussis в исследуемых образцах представлены инсерционными авирулентными мутантами и являются гомогенными. Однако нельзя исключить, что в образцах, содержащих >10 копий, популяции бактерий содержат интактные и мутантные бактерии B. pertussis.
Накопление инсерционных авирулентных мутантов B. pertussis происходит в процессе развития инфекции на поздних стадиях заболевания — от 2 до 6 мес. Кашель при этом не коррелирует с переходом бактерий B. pertussis в авирулентное состояние, и может быть обусловлен как последствиями действия коклюшного токсина, так и отмеченной нами гиперреактивностью бронхов при коклюше [26].
Инсерционные мутанты B. pertussis выявили у 14,9% контактных членов семей. Так же, как и у больных, более чем в 1/2 случаев в образцах, содержащих бактерии, несущие вставки IS-элементов, регистрировали порядка 1 ГЭ ДНК B. pertussis, в 2 образцах — 18,8 ГЭ и в 1 (№296) от взрослого члена семьи — 4·104 ГЭ при отсутствии кашля. Предположительно, он заразился от своего ребенка и был в начальной стадии заболевания или переносил его в бессимптомной форме. Инсерционные мутанты B. pertussis удалось зарегистрировать в парных исследованиях образцов, полученных от контактных лиц: №№287 и 378, №№199 и 335 (см. табл. 4). В каждой из пар один из образцов, взятый в более поздние сроки, содержал инсерционные мутанты B. pertussis. Однако в парных исследованиях образцов от одних и тех же контактных лиц (№№233 и 33, №290 и 318, №299 и 319) инсерционные мутанты B. pertussis не были выявлены. Интервал между исследованиями в парах образцов №290 и 318, №299 и 319 составил 1 нед, а в паре №233 и 33, полученных от ребенка с длительным кашлем в течение 5 мес, зарегистрировано большое количество ГЭ ДНК B. pertussis (2,3·103 и 1,4·104 соответственно). Вероятно, первые 2 пары образцов получены от контактных лиц в начальной стадии заболевания, а пара образцов №233 и 33 — от пациента с длительным негладким течением коклюша. Нельзя исключить, что отсутствие инсерционных мутантов B. pertussis в некоторых образцах, взятых в поздние сроки реконвалесценции, может быть связано с выявленной нами зависимостью частоты транспозиции IS481 от циркулирующего штамма возбудителя коклюша [12].
Заключение
Таким образом, нами показано, что при коклюше в период реконвалесценции в верхних дыхательных путях у 25% заболевших наблюдается формирование популяции персистирующих бактерий B. pertussis, частично представленной инсерционными авирулентными bvg-мутантами, способными длительно (в течение 2—6 мес) находиться в организме человека и участвовать в поддержании антропонозного резервуара коклюша. С меньшей частотой формирование инсерционных мутантов B. pertussis наблюдается у контактных с больными лиц. Больные коклюшем в типичных формах содержат большое количество вирулентных бактерий B. pertussis, популяция которых содержит не более 10–5—10–4 инсерционных мутантов. При атипичных формах коклюша, у реконвалесцентов и контактных лиц количество бактерий B. pertussis составляет (1—5)·102 в 1 мл и формируются малые популяции, состоящие преимущественно из инсерционных bvg-мутантов, способных к длительной персистенции в организме человека.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.
Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.
От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.