Состав популяций и сроки персистенции бактерий Bordetella pertussis у больных коклюшем и контактных лиц в семейных очагах

Коклюш продолжает лидировать в группе управляемых инфекционных заболеваний, несмотря на проводимую в мире массовую вакцинацию с начала 1950-х годов XX столетия [1]. В экономически развитых странах, где охват детского населения прививками достигает 95%, с начала 2000-х годов отмечается рост заболеваемости коклюшем, приближающийся к уровню довакцинного периода [2—5]. В России в 2018—2019 гг. на фоне гиподиагностики отмечен двукратный рост количества регистрируемых случаев коклюша в сравнении с 2017 г. [6, 7]. Отмечается распространение атипичных форм коклюша среди подростков и взрослых, в том числе бессимптомного носительства [2, 8—10]. Так как коклюш является исключительно антропонозным инфекционным заболеванием, по-видимому, эти группы людей обеспечивают поддержание циркуляции возбудителя, прежде всего, в межэпидемический период. Поддержание циркуляции антропонозного возбудителя возможно за счет большого числа больных людей с разным течением заболевания либо/и за счет длительного бактерионосительства практически здоровыми людьми. Наличие и сроки бактерионосительства до последнего времени не изучались. Одно из первых обследований практически «здоровых» подростков и взрослых, выполненное нами в 2010 г., с использованием разработанной нами высокочувствительной тест-системы ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ-IS) показало наличие длительного носительства бактерий Bordetella pertussis [10, 11]. Дальнейшие исследования в этом направлении позволили выявить длительную (более 3 мес) персистенцию вирулентных и аттенуированных бактерий B. pertussis в носоглотке низших обезьян, иммунизированных противококлюшной вакциной ГамЖВК [12, 13]. Более поздние исследования, проведенные в семейных очагах коклюша, показали, что у 86% обследованных контактных лиц регистрируется ДНК бактерий B. pertussis, из них у 35% возбудитель обнаруживали при отсутствии кашля. В ряде случаев ДНК возбудителя обнаруживается в носоглотке контактных и реконвалесцентных лиц в течение всего срока наблюдения (6 мес) [14, 15], что значительно превышает сроки, установленные карантином при коклюше. Таким образом, использование высокочувствительной тест-системы ПЦР-РВ-IS позволило установить возможность длительной персистенции возбудителя коклюша у переболевших и бессимптомных бактерионосителей. Длительная персистенция бактерий в организме переболевших и вакцинированных людей может приводить к формированию мутантов B. pertussis, приспособившихся к выживанию в иммунизированном организме. Такие мутанты, прежде всего, по генам протективных антигенов, входящих в состав бесклеточных коклюшных вакцин, в большом количестве регистрируются при анализе популяции штаммов B. pertussis, циркулирующих в настоящее время [16].

Экспрессия более 550 генов бактерий B. pertussis, из которых 245 являются vir-активируемыми генами (virulence activated genes, vag) и 326 — vir-репрессируемыми (virulence repressed genes, vrg), регулируется двухкомпонентной системой BvgA/BvgS в результате фосфорилирования регулятора транскрипции BvgA (BvgA~P) сенсорной фосфокиназой BvgS. Все известные гены вирулентности бактерий, включая bvgAS, относятся к vag-генам, экспрессирующимся в вирулентной фазе I, при этом vrg-гены экспрессируются в IV фазе, в авирулентном состоянии бактерии. Промежуточные фазы вирулентности II и III характеризуются частичной экспрессией vag- и vrg-генов. Описаны два типа мутаций, индуцирующих переход от фазы I к фазе IV in vitro: мутация со сдвигом рамки считывания («frameshift») в гене bvgS [17] и мутации, возникающие в результате внедрений мобильных генетических элементов IS481 или IS1002 в специфический сайт оперона bvgAS [18, 19]. Изменение условий культивирования бактерий также может привести к обратимому изменению фазового состояния бактерий [20]. В последние десятилетия активно обсуждаются роль и значение фазовых состояний в обеспечении выживания бактерий в организме хозяина и в передаче другому хозяину. Если роль фазы I в патогенезе коклюша не подвергается сомнению, то фаза IV считалась некоторыми исследователями «тупиком эволюции», не имеющим значения для выживания и распространения возбудителя. Однако исследования последних лет указывают, что, по крайней мере, переживание бактерий в организме хозяина, скорее всего, происходит в авирулентном фазовом состоянии [2, 21, 22].

Инсерционные мутанты обнаружены нами в экспериментах с лабораторными мышами, обезьянами [12, 23] и в результате изучения популяций бактерий B. pertussis, присутствующих в носоглотке больных, реконвалесцентов и контактировавших с ними практически здоровых бактерионосителей [10, 14].

Эти данные, наряду с существованием большого количества псевдогенов в составе хромосомы B. pertussis, а также наличием фактов участия МГЭ в регуляции экспрессии генов других микроорганизмов, позволили нам сформулировать гипотезу, предполагающую участие IS-элементов B. pertussis в регуляции вирулентности возбудителя в результате их перемещения в оперон вирулентности bvgAS B. pertussis.

Цель настоящего исследования — оценка сроков персистенции и анализ состава популяций бактерий B. pertussis у больных коклюшем детей и контактных лиц в семейных очагах.

Исследование проводили на базе Детского научно-клинического центра инфекционных болезней ФМБА России. В период с 2015 по 2017 г. проведено проспективное, открытое, сплошное, одноцентровое исследование. Обследованы 80 детей с лабораторно подтвержденным диагнозом «коклюш», госпитализированных в детскую городскую клиническую больницу №5 им. Н.Ф. Филатова (ДГКБ №5 им. Н.Ф. Филатова) Санкт-Петербурга, а также 116 контактировавших с ними родственников из 59 семейных очагов. Пациентов и контактных лиц включали в протокол исследования после подписания информированного согласия.

Материал для выявления геномэквивалентов (ГЭ) ДНК B. pertussis отбирали с задней стенки носоглотки через нижний носовой ход с помощью гибких назофарингеальных велюр-тампонов («COPAN», Италия). Смывы с тампонов центрифугировали в течение 10 мин при 12 000 об/мин (центрифуга Eppendorf, Германия). Осадок ресуспендировали в 200 мкл деионизированной воды, ДНК выделяли с использованием магнитного сорбента в соответствии с инструкцией к набору Wizard Genomic DNA Purification System («Promega», США) [12].

Выявление ГЭ ДНК B. pertussis и инсерционных bvg-мутантов проводили методом ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанной нами тест-системы ПЦР-РВ-IS. Регистрацию интеграций IS481 в специфический сайт оперона bvgAS осуществляли с помощью гнездовой ПЦР. Специфичность продуктов второй реакции гнездовой ПЦР определяли путем секвенирования генома [12].

Бактериальную нагрузку возбудителя коклюша в верхних дыхательных путях и количество инсерционых мутантов B. pertussis у детей с диагнозом «коклюш» проводили при поступлении в стационар, при выписке и в динамике при катамнестическом наблюдении (1—6 мес). У контактных лиц в семейных очагах мазки брали у детей и взрослых в течение 1—6 мес после первичного обследования. Бактериальную нагрузку учитывали по количеству ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл образца, полученного после выделения ДНК B. pertussis из носоглоточных мазков и растворения в 200 мкл воды.

Для статистической обработки результатов исследований использованы методы описательной статистики. В таблицах представлены количественные значения ГЭ, определенные по результатам двух измерений. Средняя относительная ошибка количества ГЭ составила 20%.

Обследованы 80 детей с лабораторно подтвержденным коклюшем и 116 лиц, контактировавших с заболевшими коклюшем детьми в 59 семейных очагах. Детей с диагнозом «коклюш» разделили на три группы: младенцы до 1 года (n=49), дети раннего возраста от 1 до 3 лет (n=14) и школьники и подростки в возрасте 7—14 лет (n=17). Госпитализированные дети не были вакцинированы против коклюша или имели незаконченный курс вакцинации. Распределение по количеству ГЭ ДНК B. pertussis, выявленных при госпитализации в этих группах детей, представлено в табл. 1.

Таблица 1. Количество ГЭ ДНК B.pertussis при первичном обследовании детей с диагнозом «коклюш»

Примечание. * — количество ГЭ ДНК B. pertussis в 1 мл препарата.

У 64,7% детей старшего возраста при госпитализации обнаружено <1—3 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл образца. Такое же количество ГЭ ДНК B. pertussis зарегистрировали у 28,6% больных коклюшем в возрасте 1—3 года и только у 6,1% — в возрасте менее 1 года. В каждой из возрастных групп в 18—24% случаев зарегистрировано 3—30 ГЭ ДНК B. pertussis.В старшей группе зарегистрировано 30—100 ГЭ ДНК B. pertussis только у 11,8% больных, в возрасте 1—3 лет — у 50%, а в возрасте до 1 года — у 75,5% (см. табл. 1).

Среди контактных лиц взрослые старше 18 лет составили 59,5%, дети школьного возраста и подростки — 22,4%, дети раннего и дошкольного возраста — 18,1%. Привитыми от коклюша были 102 человека, не привитыми — 13 детей в возрасте 2—10 лет и 1 ребенок — не закончивший полный курс вакцинации. При сборе анамнеза и осмотре было установлено, что у 35,4% контактных лиц кашель отсутствовал, у 19,8% — отмечался типичный приступообразный кашель, у 44,8% — были жалобы на сухой кашель. Никому из контактных членов семьи диагноз «коклюш» не был установлен, хотя клинические признаки заболевания регистрировали у 64,6% обследуемых лиц, в том числе у 19,8% — в типичной форме [14].

Контактных лиц также разделили на три группы: взрослые от 18 лет и старше (n=64), дети от 4 до 17 лет (n=44), дети младше 3 лет (n=8). Для оценки распределения использовали те же значения количества ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл образца: >30 ГЭ; 3—30 ГЭ; и <1—3 ГЭ. Результаты анализа представлены в табл. 2.

Таблица 2. Количество ГЭ ДНК B.pertussis при первичном обследовании контактных лиц в семейных очагах

Примечание. * — количество ГЭ ДНК B. pertussis в 1 мл препарата.

Максимальную бактериальную нагрузку B. pertussis наблюдали в 37,5% случаев у детей в возрасте до 3 лет, у детей 7—14 лет и взрослых — в 18—20% случаев. У 42,2% взрослых, 25% детей 7—14 лет и 25% детей младше 3 лет зарегистрировали 3—30 ГЭ ДНК B. pertussis. Минимальное количество ГЭ ДНК B. pertussis зарегистрировано у 37,5% взрослых, 56,8% детей 7—14 лет и 37,5% детей в возрасте до 3 лет (см. табл. 2). Сухой навязчивый или приступообразный кашель отмечался у 40% взрослых, 80% детей 4—17 лет и 92% детей в возрасте младше 3 лет.

Состав популяции бактерий B. pertussis оценивали по наличию мутантов B. pertussis, содержащих интеграцию IS481 в оперон bvgAS. В качестве показателя гетерогенности состава популяции использовали величину n =N_INS/N_GE), где N_INS — количество ГЭ ДНК B. pertussis, содержащих интеграцию, а N_GE — общее количество ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл образца. Значения N_INS и N_GE определяли с помощью разработанной нами тест-системы ПЦР-РВ-IS [10—12]. Определение аналитической чувствительности, выполненное в результате титрования клонированной последовательности, содержащей фрагмент инсерции IS481 в опероне bvgAS, показало, что проведение ПЦР-РВ и однократной ПЦР позволяет зарегистрировать порядка 3 копий таких фрагментов в 5 мкл образца. Таким образом, событие интеграции может быть зарегистрировано в образцах, содержащих 3 копии ДНК B. pertussis в 5 мкл, если все они содержат искомую интеграцию. Например, доля ГЭ ДНК B. pertussis, содержащих инсерцию, составляет 10% от общего количества ГЭ. Это означает, что при заданной чувствительности в образце должно быть не менее 30 ГЭ ДНК B. pertussis. Титрование ДНК B. pertussis показывает, что ПЦР-РВ, основанная на амплификации повторяющейся последовательности IS481, способна выявлять ГЭ ДНК B. pertussis с концентрацией в 100 раз меньше — 0,05 ГЭ в 5 мкл. Задача выявления интеграций <1—3 ГЭ ДНК B. pertussis может быть решена либо за счет повышения чувствительности тест-системы, либо вследствие увеличения объема анализируемого образца. Использование метода гнездовой ПЦР (нестед-ПЦР) позволило нам реализовать оба подхода. Аналитическая чувствительность нестед-ПЦР повышается до 1 копии целевой мишени, а использование 3—5 реакций, поставленных одновременно, снижает минимально регистрируемое количество ДНК B. pertussis до заданного среднего значения в 0,5—1,0 ГЭ ДНК B. pertussis, содержащих только инсерционные мутанты и порядка 5 молекул при содержании интеграции не менее, чем в 10% геномов B. pertussis. Таким образом, поиск событий интеграций с помощью нестед-ПЦР целесообразно проводить в образцах, содержащих не менее 0,5—1,0 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл раствора, в 3—5 пробирках. Положительным результатом считается выявление искомого продукта ПЦР даже в одной пробе. Решающим условием достоверного определения положительного сигнала является его отсутствие в пробирках контроля (К-), содержащих реакционную смесь и воду.

Только часть образцов, выделенных нами от больных коклюшем и контактных лиц, удовлетворяла сформулированному критерию, поэтому для анализа с помощью нестед-ПЦР использовали все образцы ДНК B. pertussis, выделенные на разных этапах исследования и содержащие не менее 0,5—1 копии ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл. В табл. 3 представлены результаты анализа образцов, полученных от больных в динамике, содержащих не менее 1 копии ГЭ в 5 мкл. Номер образца, возраст обследованных, наличие и длительность кашлевого синдрома, количество ГЭ ДНК B. pertussis и наличие интеграций в исследуемой точке представлены в соответствующих графах табл. 3. В последней графе таблицы представлены значения количества ГЭ ДНК B. pertussis, наличие интеграций и номер образца, взятого у больного при госпитализации. Количество образцов от реконвалесцентов с содержанием ДНК, близким к выбранному параметру, составило 22. Образцы №№103, 223 и 26 взяты у одного больного в разные сроки, как и №№301 и 372. Число обследованных больных, удовлетворяющих сформулированным выше критериям, составило 20.

Таблица 3. Анализ интеграций IS481 в оперон bvgASB.pertussis у больных коклюшем детей в период реконвалесценции

Примечание. мес — месяцы наблюдения; к — сухой периодический кашель; КК — характерный коклюшный кашель; нет/есть — наличие интеграций IS481 в оперон bvgAS; ИО — интеграции IS481 в оперон bvgAS в образце при госпитализации отсутствуют; ИП — интеграции IS481 в оперон bvgAS в образце присутствуют. В последней графе таблицы последовательно указаны цифры: количество ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл, № образца, время отбора образца.

Для определения бактериальной нагрузки и состава популяции возбудителя коклюша при госпитализации с помощью ПЦР-РВ проанализированы образцы, содержащие не менее 10⁴ ГЭ B. pertussis. В 2 образцах (№№26 и 91), полученных при госпитализации, количество ГЭ ДНК B. pertussis соответствовало минимуму для достоверного определения интеграции с помощью ПЦР-РВ. Оба образца содержали около 5—7·10⁴ ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл, а ДНК B. pertussis имела вставки IS481 в оперон bvgAS с частотой около 5·10^–5. Методом нестед-ПЦР проанализировали 9 образцов, содержащих 10³—2·10⁴ ГЭ ДНК B. pertussis, и 11 образцов, содержащих от 8,5 до 200 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл. Ни в одном из этих образцов ни с одним из примененных методов ПЦР не были обнаружены bvg-мутанты, содержащие внедрение IS481 в оперон bvgAS.

На следующем этапе исследования в 22 образцах, взятых в период реконвалесценции через 2,5—6 мес, выявляли инсерционные мутанты B. pertussis. С помощью гнездовой ПЦР содержание мутантной хромосомы B. pertussis зарегистрировали в 5 образцах (см. табл. 3). Два образца из 5, полученных от больных при госпитализации, содержали в среднем 4,8·10³ ГЭ B. pertussis в 5 мкл, остальные — 4,7·10⁴. У 1 ребенка с диагнозом «коклюш» при госпитализации было обнаружено 18 ГЭ ДНК B. pertussis (№301) при отсутствии интеграций, а через 2,5 мес сухого кашля — 1 ГЭ ДНК B. pertussis (№372), содержащий IS481 в опероне bvgAS. Из 17 образцов, взятых при госпитализации, 2 содержали 4,7·10⁴ ГЭ ДНК; 6 — (2—6)·10³ ГЭ и 1 (№61) — порядка 2,3·10² ГЭ ДНК B. pertussis. Восемь образцов содержали <100 ГЭ ДНК B. pertussis. У 3 обследованных в течение 1—1,5 мес отмечали типичный «коклюшный» кашель. Четыре из 5 положительных образцов были взяты через 2—2,5 мес после госпитализации и 1 — через 6 мес. Возраст детей, в мазках которых обнаружены инсерционные мутанты B. pertussis, составлял от 3 мес до 1 года 9 мес. И только у 1 ребенка в возрасте 2 мес на момент обследования наблюдали характерный спастический кашель, тогда как у остальных детей кашель был сухой и редкий.

Таким образом, из 20 обследованных больных коклюшем детей, у которых в периоде реконвалесценции был обнаружен 1 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл и более, у 5 (25%) выявлены инсерционные мутанты с внедрениями IS481 в оперон bvgAS.

Согласно сформулированному нами критерию, для анализа отобрали 50 образцов от членов семей, контактировавших с больными коклюшем. В 7 образцах от контактных лиц в разные сроки наблюдения регистрировали инсерционные мутанты B. pertussis. В 19 случаях мазки были взяты в динамике дважды. В табл. 4 представлена характеристика кашля у контактных членов семьи на момент обследования, количество ГЭ ДНК B. pertussis и наличие инсерций в хромосоме B. pertussis.

Таблица 4. Интеграции IS481 в оперон bvgAS бактерийB.pertussis у членов семей, контактировавших с больными коклюшем

Примечание. * — первым взят образец с меньшим порядковым номером; мес — месяцы наблюдения, нед — недели наблюдения; к — сухой периодический кашель; КК — характерный коклюшный кашель; ко — кашель отсутствует; нет/есть — наличие интеграций IS481 в оперон bvgAS; е — однократное измерение интеграций IS481 в одной временной точке; ИО — интеграции IS481 на момент госпитализации отсутствуют; ИП — интеграции IS481 присутствуют на момент госпитализации. В последней графе таблицы последовательно указаны цифры: количество ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл, № образца, время отбора образца.

В 4 из 7 ПЦР-положительных образцов содержалось около 1 ГЭ ДНК B. pertussis, в 1 образце — 6 ГЭ, в 1 — 18 ГЭ и еще в 1 — 4·10⁴ ГЭ. Положительные образцы были у 3 детей в возрасте 14, 10 и 4 лет. Остальные образцы получены от взрослых контактных членов семей. Среди них образец от «практически здорового» на момент исследования контактного взрослого (№296), взятый одновременно с госпитализированным ребенком. Образец содержал 5·10⁴ ГЭ B. pertussis в 5 мкл. Образцы, не содержащие инсерционных мутантов B. pertussis, имели примерно то же количество ДНК B. pertussis. Основная масса «отрицательных» образцов, не выявивших инсерционных мутантов у детей в том же возрастном диапазоне, также содержала 1—10 ГЭ ДНК B. pertussis. Однако среди них обнаружено 7 образцов со значительно большим количеством ГЭ B. pertussis в 5 мкл — 50·10⁴.

Образцы в парах 33 и 233, 299 и 319, 287 и 378, 299 и 319, 199 и 335 принадлежали одному обследованному лицу. Итого 50 исследованных образцов принадлежали 47 контактировавшим членам семей. Следовательно, доля контактных лиц, в аспиратах которых были выявлены инсерционные мутанты B. pertussis, составила 14,9%.

В рамках настоящей работы проведено исследование с целью выявления корреляции между количеством обнаруженных бактерий B. pertussis и составом их популяции с тяжестью заболевания и формированием бактерионосительства у членов семей, контактных с больными коклюшем детьми. Из общего числа больных коклюшем выбрали детей, участвовавших более чем в одном обследовании. Для анализа состава популяции бактерий B. pertussis выбирали образцы, полученные в разные сроки наблюдения, в 5 мкл которых содержалось не менее 0,5—1 ГЭ ДНК B. pertussis.

Обращает на себя внимание большой разброс в значениях ГЭ ДНК B. pertussis — от 5·10⁴ до <1 ГЭ в 5 мкл образца у больных коклюшем детей разного возраста. У 64,7% детей 7—14 лет при первичном обследовании обнаружено <1—3 ГЭ ДНК B.pertussis в 5 мкл образца. То же количество ГЭ ДНК B. pertussis зарегистрировано у 28,6% больных коклюшем в возрасте 1—3 лет и только у 6,1% — в возрасте менее 1 года. В каждой из возрастных групп в 18—24% случаев зарегистрировано от 3—30 ГЭ ДНК B. pertussis. Более 30—100 ГЭ зарегистрировано у 11,8% больных детей 7—14 лет, у 50% — 1—3 лет, у 75,5% — младше 1 года (см. табл. 1).

Данные анамнеза больных коклюшем детей и контактных лиц не позволили сделать однозначное заключение об источнике инфекции в каждом из семейных очагов. Однако сопоставление данных табл. 1 и 2 показывает, что при первичном ПЦР-исследовании у контактных лиц регистрируется больше ГЭ ДНК B. pertussis (>30), чем у больных коклюшем. Вероятно, именно они являются источником инфекции. Наличие характерного для коклюша кашля у большинства детей и подавляющей части контактных лиц, в образцах которых выявлено значительно отличающееся друг от друга количество ГЭ ДНК B. pertussis, указывает на то, что на этапе реконвалесценции выраженность кашлевого синдрома не коррелирует с количеством персистирующих в носоглотке бактерий B. pertussis. Для понимания взаимосвязи между бактериальной нагрузкой и клинической картиной коклюша необходимы дальнейшие исследования, в том числе направленные на анализ соответствия иммунного ответа и состава популяций бактерий B. pertussis.

Отдельные ГЭ ДНК B. pertussis регистрировали в образцах реконвалесцентов через 6 мес после первичного ПЦР-анализа и госпитализации больного. При схожей клинической картине у детей младшего возраста (1—3 лет) регистрируется значительно большее количество бактерий B. pertussis, чем у детей старше 3 лет и взрослых. Снижение бактериальной нагрузки у детей старших возрастных групп и взрослых, вероятно, связано с увеличением по мере взросления количества контактов с возбудителем коклюша и формированием специфического иммунитета. Подтверждением этого могут служить результаты серологического анализа сывороток крови детей старших возрастных групп и взрослых, где до 70% обследованных содержат специфические антитела против возбудителя коклюша [24].

Полученные нами результаты показывают, что у больных детей младше 3 лет в периоде спазматического кашля бактериальная нагрузка в большинстве случаев составляет >2·10³ ГЭ ДНК B. pertussis в 1 мл (>30 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл). В этом случае для лабораторной диагностики коклюша может быть использована коммерческая тест-система, обеспечивающая чувствительность 3—5 копий в 5 мкл образца [25]. Однако ПЦР-диагностика коклюша с помощью коммерческой тест-системы в группе заболевших старше 7 лет и контактных лиц всех возрастов, скорее всего, будет неэффективна ввиду малого количества ДНК возбудителя коклюша в образцах, на что указывают результаты сравнения коммерческой тест-системы и ПЦР-РВ-IS, приведенные в предыдущем исследовании [14].

Анализ образцов, содержащих не менее 1 ГЭ ДНК B. pertussis в 5 мкл, методом нестед-ПЦР показал, что у 25% обследованных через 2,5—6 мес после первичного обследования регистрировали инсерционные bvg-мутанты B. pertussis. Учитывая, что большинство образцов отобрано в период реконвалесценции при малом количестве (1—2 копии) ДНК возбудителя коклюша, можно утверждать, что популяции бактерий B. pertussis в исследуемых образцах представлены инсерционными авирулентными мутантами и являются гомогенными. Однако нельзя исключить, что в образцах, содержащих >10 копий, популяции бактерий содержат интактные и мутантные бактерии B. pertussis.

Накопление инсерционных авирулентных мутантов B. pertussis происходит в процессе развития инфекции на поздних стадиях заболевания — от 2 до 6 мес. Кашель при этом не коррелирует с переходом бактерий B. pertussis в авирулентное состояние, и может быть обусловлен как последствиями действия коклюшного токсина, так и отмеченной нами гиперреактивностью бронхов при коклюше [26].

Инсерционные мутанты B. pertussis выявили у 14,9% контактных членов семей. Так же, как и у больных, более чем в ¹/₂ случаев в образцах, содержащих бактерии, несущие вставки IS-элементов, регистрировали порядка 1 ГЭ ДНК B. pertussis, в 2 образцах — 18,8 ГЭ и в 1 (№296) от взрослого члена семьи — 4·10⁴ ГЭ при отсутствии кашля. Предположительно, он заразился от своего ребенка и был в начальной стадии заболевания или переносил его в бессимптомной форме. Инсерционные мутанты B. pertussis удалось зарегистрировать в парных исследованиях образцов, полученных от контактных лиц: №№287 и 378, №№199 и 335 (см. табл. 4). В каждой из пар один из образцов, взятый в более поздние сроки, содержал инсерционные мутанты B. pertussis. Однако в парных исследованиях образцов от одних и тех же контактных лиц (№№233 и 33, №290 и 318, №299 и 319) инсерционные мутанты B. pertussis не были выявлены. Интервал между исследованиями в парах образцов №290 и 318, №299 и 319 составил 1 нед, а в паре №233 и 33, полученных от ребенка с длительным кашлем в течение 5 мес, зарегистрировано большое количество ГЭ ДНК B. pertussis (2,3·10³ и 1,4·10⁴ соответственно). Вероятно, первые 2 пары образцов получены от контактных лиц в начальной стадии заболевания, а пара образцов №233 и 33 — от пациента с длительным негладким течением коклюша. Нельзя исключить, что отсутствие инсерционных мутантов B. pertussis в некоторых образцах, взятых в поздние сроки реконвалесценции, может быть связано с выявленной нами зависимостью частоты транспозиции IS481 от циркулирующего штамма возбудителя коклюша [12].

Таким образом, нами показано, что при коклюше в период реконвалесценции в верхних дыхательных путях у 25% заболевших наблюдается формирование популяции персистирующих бактерий B. pertussis, частично представленной инсерционными авирулентными bvg-мутантами, способными длительно (в течение 2—6 мес) находиться в организме человека и участвовать в поддержании антропонозного резервуара коклюша. С меньшей частотой формирование инсерционных мутантов B. pertussis наблюдается у контактных с больными лиц. Больные коклюшем в типичных формах содержат большое количество вирулентных бактерий B. pertussis, популяция которых содержит не более 10^–5—10^–4 инсерционных мутантов. При атипичных формах коклюша, у реконвалесцентов и контактных лиц количество бактерий B. pertussis составляет (1—5)·10² в 1 мл и формируются малые популяции, состоящие преимущественно из инсерционных bvg-мутантов, способных к длительной персистенции в организме человека.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Настоящая статья не содержит каких-либо исследований с использованием животных в качестве объектов.

Все процедуры, выполненные в исследовании с участием людей, соответствуют этическим стандартам институционального и/или национального комитета по исследовательской этике и Хельсинкской декларации и ее последующим изменениям или сопоставимым нормам этики.

От каждого из включенных в исследование участников было получено информированное добровольное согласие.