Рекомбинантный фактор роста костной ткани BMP-2 человека, получаемый синтезом в клетках Escherichia coli. Часть 1: от очистки белка до экспериментальных моделей исследования эффективности

Костный морфогенетический белок 2 (Bone Morphogenetic Protein 2, BMP-2) относится к семейству белков TGF-β (Transforming Growth Factor β). В клетках человека BMP-2 синтезируется в виде гликозилированного белка-предшественника длиной 396 а.о., который состоит из сигнального пептида (23 а.о.), пропептида (259 а.о.) и зрелого белка (114 а.о.). При попадании в эндоплазматический ретикулум происходит отщепление сигнального пептида с N-конца белка, далее в аппарате Гольджи происходит его димеризация и протеолитический гидролиз после Arg-283. После этого зрелая форма белка, представляющая собой гомодимер, секретируется из клетки (рис. 1) [1, 2]. При димеризации между остатками Cys-78 мономеров образуется дисульфидная связь. Каждый из мономеров в свою очередь имеет 3 внутренних дисульфидных связи между Cys-43 и Cys-111, Cys-47 и Cys-113, Cys-14 и Cys-79, образующих структурный мотив «цистиновый узел» (cystine knot) [3]. Активная димерная форма BMP-2 взаимодействует с двумя типами клеточных рецепторов; к первому относятся BMPR1a и BMPR1b, ко второму — BMPR2, ActRIIа и ActRIIb (см. рис. 1). Взаимодействие гомодимера BMP-2 с рецепторами обоих типов приводит к их активации путем автофосфорилирования. Далее происходит активация сигнальных белков семейства SMAD путем фосфорилирования [4]. Активированный комплекс белков SMAD регулирует транскрипцию соответствующих генов, что, в конечном счете, приводит к проявлению биологических свойств BMP-2, основным из которых является синтез новообразованной костной ткани (остеогенез) [5]. Препарат INFUSE Bone Graft Kit (Medtronic, США), продаваемый в Европе под названием InductOS Kit (Wyeth, США), представляет собой адсорбирующую коллагеновую губку, пропитанную рекомбинантным BMP-2, полученным синтезом в эукариотических клетках. Этот препарат используют при переломах и для лечения заболеваний опорно-двигательной системы у пациентов в США и странах Западной Европы [6, 7]. Одна доза препарата (зависящая от размера дефекта костной ткани) включает от 1 до 12 мг белка. Учитывая низкий выход белка при его синтезе в эукариотических клетках и, соответственно, высокую стоимость производства, при таком расходе белка стоимость препарата очень велика — она исчисляется в тысячах долларов, что ограничивает возможность его применения в российской медицинской практике.

Образование комплекса BMP-2 с рецепторами обоих типов запускает активацию белков SMAD (сигнальные медиаторы BMP рецепторов), которые проникают в ядро и регулируют транскрипцию соответствующих генов [4].

Привлекательной альтернативой синтезу в клетках эукариот является получение биологически активного rhBMP-2 в бактериальных системах экспрессии, которые обеспечивают значительно больший выход белка и тем самым обеспечивают существенное удешевление получаемых на его основе препаратов. Синтез в бактериальных продуцентах, как правило, приводит к отложению белка в составе телец включений и требует проведения достаточно длительной процедуры рефолдинга с целью получения активной димерной формы BMP-2 с правильно сформированными дисульфидными связями. Несмотря на отсутствие гликозилирования, характерного для белка, полученного синтезом в эукариотических клетках, белок, полученный прокариотическим синтезом, способен взаимодействовать с клеточными рецепторами и обладает специфическими in vitro и in vivo активностями, не уступающими BMP-2, полученному в клетках эукариот [8, 9]. В многочисленных работах показана его способность к остеоиндукции при применении с различными носителями в различных моделях на лабораторных животных. Имеются первые данные о клиническом применении препаратов на основе BMP-2, синтезированного клетками прокариот [10—15]. Целью данного обзора является рассмотрение текущего состояния разработок в области получения новых материалов на основе BMP-2, синтезированного в бактериальных продуцентах, и перспектив их внедрения в медицинскую практику.

Получение rhBMP-2 в клетках E. coli описано в нескольких работах [16—27]. С целью повышения выхода белка при синтезе в клетках E. coli используют процедуру оптимизации кодонного состава зрелой формы BMP-2. Это позволяет достичь высокого уровня синтеза BMP-2 — 50—60% от суммарного белка клетки [26, 28, 29].

В большинстве случаев при синтезе в клетках E. coli образуются нерастворимые тельца включений. Схемы очистки, различающиеся в деталях, как правило, включают растворение телец включений и рефолдинг [6, 17, 18, 22, 23, 26], приводящий к получению димерной формы белка, обладающей биологической активностью.

Рефолдинг BMP-2 проводят с использованием различных химических агентов, таких как окисленный и восстановленный глутатионы [18, 22, 23], дитиотреитол (ДТТ) [20, 26], цистеин/цистин [23], обеспечивающих условия дисульфидного обмена; L-аргинин [20, 22, 23], снижающий степень агрегации; и других в различных комбинациях, условиях ионной силы, при разной температуре. В некоторых работах описано систематическое исследование с целью подбора лучших условий для рефолдинга. Так, в работе L. Vallejo и соавт. [17] проведено сравнение нескольких буферов для рефолдинга, включающих 3-(1-пиридино)-1-пропансульфонат (3-(1-pyridinio)-1-propanesulfonate, PPS), пиридин-3 сульфоновую кислоту (pyridine-3 sulfonic acid, PSA), 2-(циклогексиламино) этансульфоновую кислоту (2-(cyclohexylamino) ethanesulfonic acid, CHES) или никотиновую кислоту (nicotinic acid, NA). Рефолдинг проводили в течение 4 дней при 20 °С. Наилучший результат был получен в случае присутствия в буфере для рефолдинга CHES. Однако, поскольку данный реагент является дорогостоящим, были предприняты дальнейшие попытки оптимизации условий рефолдинга на основе буферов с более дешевыми компонентами. В работе S. Long и соавт. [20] был опробован набор буферов, среди которых был отобран буфер, включающий 55 мМ Tris-HCl, pH 8,2, 10,56 мМ NaCl, 0,44 мМ KCl, 550 мМ гуанидин хлорида, 2,2 мМ MgCl₂, 2,2 мМ CaCl₂, 550 мМ L-аргинина, 1 мМ ДТТ. Инкубацию проводили в течение ночи при 0 °С, после чего мономерную и димерную формы BMP-2 разделяли на колонке с гепарин-сефарозой. Мономерную форму и смесь мономерной и димерной форм, полученные после хроматографии, опять подвергали рефолдингу с последующей хроматографической очисткой. Путем многократного повторения стадий рефолдинга и хроматографии на гепарин-сефарозе удалось перевести в активную димерную форму более 60% BMP-2, изначально синтезированного в виде телец включений. В работе D. Nasrabadi и соавт. [23] был проведен сравнительный анализ различных окислительно-восстановительных систем и схем рефолдинга, оптимальной среди которых оказалась двухстадийная схема, включающая инкубацию в течение 48 ч в буфере, содержащем по 0,1 мМ окисленного и восстановленного глутатионов, и инкубацию в течение 2 ч с раствором равного объема, содержащим BMP-2, предварительно полученным с 0,5 мМ окисленного и 5 мМ восстановленного глутатионов с последующим диализом. Приведенная схема позволила повысить долю димерной формы.

Как правило, рефолдинг проводят при достаточно низкой концентрации BMP-2, обычно составляющей 0,1 мг/мл. При этом в одной из работ описана процедура пульс-ренатурации в присутствии CHES, позволяющая получить рефолдированный белок в концентрации 2,1 мг/мл [18]. Описан способ рефолдирования BMP-2 на колонке со слабым катионообменником в окислительных условиях с постепенным понижением концентрации денатурирующего агента и последующей гель-фильтрацией [30].

В одной из работ [28] описано получение растворимой формы BMP-2, синтезируемой в клетках E. coli Rogetta-gami B (DE3) c одновременной экспрессией гена тиоредоксина. Очистка белка, полученного таким образом, не требовала стадий растворения телец включений и рефолдинга. Полученный белок обладал активностью in vitro.

В ряде случаев для повышения растворимости и стабилизации BMP-2, синтезируемого в клетках E. coli, используются подходы с получением BMP-2 в составе слитых конструкций с различными tag доменами, такими как 6-His-тиоредоксин [29], s-tag (15-звенный олигопептид из рибонуклеазы А поджелудочной железы быка), димеризационный домен «лейциновая молния» из транскрипционного фактора дрожжей GCN4 [24, 27]. Показана биологическая активность BMP-2 с tag доменами как in vitro [27, 29], так и in vivo [31—36], а также возможность получения активной димерной формы зрелого BMP-2 после протеолитического отщепления соответствующих доменов [27, 37].

Описан пример получения в клетках E. coli варианта BMP-2 с присоединенным к нему коллаген-связывающим доменом из фактора фон Виллебранда [38]. Такой белок лучше, чем нативный фактор, связывается с коллаген-содержащими матриксами, в частности с деминерализованным костным матриксом (ДКМ), и проявляет статистически достоверно более выраженную активность in vivo [39]. BMP-2 с коллаген-связывающим доменом в комбинации с коллаген-содержащим носителем эффективен на модели спондилодеза у крыс в очень низкой дозе — 0,02 мг/см³, что позволяет рассматривать такой препарат в качестве альтернативы INFUSE Bone Graft Kit (Medtronic, США), многочисленные побочные эффекты которого связаны с высокими дозами входящего в него BMP-2 эукариотического происхождения, в спинальной хирургии.

В единственном широко применяемом в настоящее время в США и странах Западной Европы препарате INFUSE Bone Graft Kit (Medtronic, США) в качестве носителя BMP-2 используется коллагеновая губка. Первые проведенные клинические испытания препарата показали его высокую эффективность и безопасность, на основании чего было выдано разрешение FDA на его применение в спинальной хирургии для лечения переломов длинных костей и в черепно-лицевой хирургии. Это привело к очень широкому применению препарата. Так, в США процент операций по спондилодезу с использованием BMP-2 вырос с 0,69% в 2002 г. до 24,89% в 2006 г. [40]. Одновременно с ростом популярности препарата стали появляться статьи об осложнениях, вызываемых его применением, таких как эктопический остеогенез, отек мягких тканей и др. Были проведены дополнительные клинические исследования, направленные на уточнение данных об эффективности и безопасности BMP-2 [41]. Высокая эффективность применения INFUSE Bone Graft Kit была подтверждена, а риск для пациентов был оценен в 10—50 раз выше, чем в изначально проведенных клинических исследованиях. Причинами такой высокой частоты осложнений могут быть случаи неправильного применения препарата, а также неоптимальный носитель (коллагеновая губка) и/или очень высокое — миллиграммовое — количество вводимого в организм фактора, в миллионы раз превышающее содержание BMP-2 в костной ткани [42].

В связи с этим важнейшими направлениями исследований в области регенеративной медицины являются разработка новых носителей для BMP-2 и подходов к уменьшению концентрации фактора в препаратах без снижения эффективности материалов. Такие исследования проводятся как на основе использования BMP-2, синтезированного в клетках эукариот, и таких работ — большинство, так и на основе BMP-2, полученного синтезом в клетках E. coli. Например, в работе H.S.Yang и соавт. [43] показано, что гепарин-конъюгированный фибрин (HCF — Heparin Conjugated Fibrin) демонстрирует лучшие свойства по сравнению с адсорбирующей коллагеновой губкой в качестве носителя BMP-2 прокариотического происхождения: выход BMP-2 в случае HCF происходит в течение 20 дней, а в случае коллагеновой губки — в течение 6 дней, активность in vitro BMP-2, вышедшего из HCF, выше, 100% репарация краниальных дефектов у мышей на сроке 8 нед после операции в случае HCF наблюдается при дозе 0,5 мкг, а в случае коллагеновой губки — при 2 мкг BMP-2.

Носители для BMP-2 можно условно разделить на 4 группы: носители природного происхождения (коллаген, фибрин, фибриноген, органическая составляющая кости и т.д.), неорганические носители (гиалуроновая кислота, гидроксилапатит, соли кальция, неорганическая составляющая кости), синтетические носители (различные полимеры: PCL, PDLLA и т.п.) и композитные носители (состоящие из нескольких компонентов). В табл. 1 приведены примеры исследования эффективности применения природных, неорганических и композитных носителей в комплексе с прокариотическим BMP-2 на различных моделях in vitro и in vivo. Наиболее часто в качестве носителей для BMP-2 используют материалы на основе коллагена в различных формах: в виде мембран, блоков, гелей и т.д. [39, 44], а также композитные носители [45—52].

В большинстве работ проводится сравнительное исследование материалов, содержащих и не содержащих BMP-2. Так, с применением носителей из фибронектина, желатина и коллагена [39, 53, 54, 58] было показано, что биологическая активность материалов с BMP-2 в составе носителя выше, чем на материалах без фактора, как в опытах на животных моделях, так и на культурах эукариотических клеток. Подобные результаты были получены и с применением неорганических матриксов — фосфатов кальция, биокерамики, гидроксилапатита, гиалуроновой кислоты [46, 48, 55—58], которые также обладают улучшенной остеогенной активностью в комплексе с BMP-2.

Хорошие результаты по восстановлению костных дефектов были отмечены при использовании модификаций природных носителей неорганическими компонентами (хитозан — фосфат кальция), неорганических с дополнительными составляющими (гидроксилапатит — магний) [45, 47]. Подобные модификации замедляют выход BMP-2 из носителя, что продемонстрировано на клеточных и животных моделях. Достаточно часто используются композиты синтетических полимеров с неорганическими компонентами [49—51], которые при использовании совместно с BMP-2 показывают хороший остеоиндуктивный эффект. В работах J. Patel и соавт. [49] и N. Moser и соавт. [50] охарактеризованы материалы с замедленным выходом BMP-2 из носителей, что позволило уменьшить дозу белка и получить более равномерный рост костной ткани.

Таким образом, работа по созданию новых, более эффективных по сравнению с адсорбирующей коллагеновой губкой, носителей BMP-2, в частности BMP-2 прокариотического происхождения, ведется во многих направлениях и пока далека до завершения. Основной тенденцией в этой области является создание материалов с замедленной скоростью выхода BMP-2 из носителя. Конечной целью этих разработок является снижение эффективной дозы BMP-2 в остеопластических материалах.

Материалы, содержащие BMP-2 как эукариотического, так и прокариотического происхождения, тестируются на одних и тех же моделях лабораторных животных. Выбор конкретной модели определяется не типом белка, а конечной целью исследования; свойствами носителя; бюджетом проекта, в рамках которого выполняется эксперимент; предшествующим опытом исследовательской группы. Тем не менее в данном обзоре, описывая ту или иную экспериментальную модель, мы приводим примеры использования конкретной модели для тестирования материалов с BMP-2, синтезированного в клетках прокариот.

Наиболее распространенными моделями, используемыми для тестирования эффективности материалов, содержащих BMP-2, являются модели, основанные на хирургически создаваемых дефектах костной ткани, так называемых дефектах критического размера. Дефектом критического размера называют дефект, который самопроизвольно, без какого-либо лечения, не зарастает в течение жизни лабораторного животного или на протяжении эксперимента [59]. Наиболее распространенными дефектами критического размера, используемыми в различных лабораториях, являются дефекты костей свода черепа и длинных костей.

Круглый дефект теменной кости свода черепа обычно делается специальным хирургическим инструментом — трепаном, при этом очень важным является полное удаление кости без повреждения твердой мозговой оболочки. Диаметр дефекта критического размера зависит от вида животного: у мышей это 5 мм, у крыс — 8 мм, у кроликов — 15 мм, у обезьян — 15 мм, у собак — 20 мм, у овец — 22 мм [60]. Большинство исследований проводится на грызунах — мышах и крысах, поскольку работа с более крупными животными требует существенно больших материальных затрат и более трудоемка. При этом следует отметить, что особенно в случае мышей маленький размер дефекта и незначительная толщина костей требуют особой точности при проведении хирургических манипуляций, поэтому нельзя исключить появления ошибок, которые могут сказаться на результатах эксперимента. Модель дефекта критического размера свода черепа является, вероятно, самой распространенной экспериментальной моделью при исследовании остеогенности различных материалов вследствие ее высокой стандартизуемости и достаточно легкого хирургического доступа. Модель дефекта критического размера свода черепа крыс используется, например, в работе, показывающей остеоиндуктивность BMP-2, синтезированного в клетках E. coli, при его введении в дефект на адсорбирующей коллагеновой губке [61].

Сегментарные (с удалением части кости) дефекты длинных костей очень разнообразны как по месту локализации, так и по размерам, варьирующим от 0,4 см у мышей до 7—7,5 см у собак, коз и приматов [62]. Они используются реже, чем краниальные дефекты, поскольку выполнение операций по созданию таких дефектов требует более сложного хирургического доступа, в большинстве случаев нужно осуществлять внутреннюю или внешнюю фиксацию костей. Тем не менее, например, при разработке материалов, которые планируется применять для лечения несращений при переломах длинных костей, такого рода модели используются часто. В качестве примера использования таких моделей для оценки эффективности материалов с BMP-2 бактериального происхождения можно привести работу корейской группы исследователей, выполненную на моделях сегментарных дефектов малоберцовой кости крыс и лучевой кости кроликов [44].

Потребность в получении новых материалов для спинальной хирургии привела к разработке ряда моделей на животных, в основном на крысах и кроликах, в некоторых случаях — на более крупных животных, в которых исследуется эффективность сращения позвонков при введении BMP-2 с разными носителями. Так, в работе T. Matsumoto и соавт. [63] на модели спондилодеза поясничных позвонков у кроликов показана эффективность материала, представляющего собой композит из полимера PLA-PEG (Poly-D,L-Lactic Acid/PolyEthylene Glycol block copolymer) с β-трикальцийфосфатом, с введенным в него BMP-2, полученным в клетках E. coli.

При разработке новых материалов для дентальной имплантологии и челюстно-лицевой хирургии используют различные модели дефектов челюсти. Например, в работе J.-S. Lee и соавт. [64] для сравнения остеогенных свойств двух материалов с BMP-2, полученным синтезом в клетках E. coli, использовали сразу 2 экспериментальных модели — модель синус-лифтинга у кроликов и модель заполнения исследуемым материалом лунок удаленных зубов у собак породы бигль.

Также широко используется модель эктопического остеогенеза, которая хирургически реализуется с помощью внутримышечной или подкожной имплантации лабораторным животным, в частности, мышам и крысам, носителей с BMP-2 или BMP-2 в сочетании с другими факторами. Примером работы, включающей использование модели эктопического остеогенеза, является исследование, в котором было показано, что дексаметазон усиливает эктопический остеогенез при внутримышечном введении крысам блока из β-трикальцийфосфата, пропитанного BMP-2 бактериального происхождения [65]. Другим примером является процитированная выше работа J. Lee и соавт. [61], в которой остеоиндуктивность BMP-2, синтезированного в E. coli, оценивалась также по степени эктопического остеогенеза у крыс при подкожном введении фактора на коллагеновой губке.

Таким образом, рекомбинантный BMP-2, синтезируемый в клетках E. coli, представляет собой пример эукариотического белкового фактора, для которого удалось решить, казалось бы, непреодолимую по сложности задачу — разработать эффективные технологии синтеза белка в гетерологичной системе экспрессии генов с последующей очисткой и рефолдингом, приводящие к получению активного димера с правильно организованной системой дисульфидных связей: одной межмолекулярной и тремя внутримолекулярными в каждом мономере. На большом экспериментальном материале, включающем исследования с использованием широкого спектра разнообразных носителей и моделей на лабораторных животных, показана эффективность BMP-2 прокариотического происхождения в отношении индукции остеогенеза, не уступающая таковой для эукариотического рекомбинантного BMP-2.

Вторая часть обзора будет посвящена совместному применению BMP-2 c другими факторами в составе одного материала, а также медицинскому применению материалов с добавлением BMP-2 бактериального происхождения.

Благодарности. Авторы выражают благодарность д.б.н. Бокше И.С. за обсуждение обзора.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (грант №16-15-00133).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.