Рекомбинантные варианты вируса гепатита С в Сибири

Авторы:
  • Е. В. Чуб
    ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, 630559, Кольцово, Россия
  • Г. Ф. Сиволобова
    ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, 630559, Кольцово, Россия
  • С. В. Нетесов
    Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, Россия
  • Г. В. Кочнева
    ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, 630559, Кольцово, Россия; Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, Россия
Журнал: Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(2): 64-75
Просмотрено: 657 Скачано: 74

Введение

Вирус гепатита С (ВГС) характеризуется чрезвычайно высокой степенью генетического разнообразия. В соответствии с существующей классификацией выделяют 7 основных генетических групп (генотипов) ВГС и 67 субтипов с 30% уровнем дивергенции нуклеотидных последовательностей [1]. Эволюция ВГС обусловлена, главным образом, точечными мутациями, связанными с ошибками в работе РНК-полимеразы вируса при репликации. Альтернативным способом приобретения изменчивости для ВГС может быть генетическая рекомбинация вирусных РНК.

Несмотря на то что рекомбинация была выявлена для многих РНК-содержащих вирусов, в течение многих лет данные о рекомбинации ВГС считались сомнительными [2] и предполагалось, что эти события крайне редки в естественных условиях, а образующиеся рекомбинанты, как правило, нежизнеспособны [3]. Такое представление было основано на следующих причинах. Во-первых, до 2002 г. не было опубликовано работ по выявлению и описанию характерных свойств рекомбинантных изолятов ВГС [4]. Во-вторых, существуют экспериментальные доказательства того, что в ВГС-инфицированных клетках предотвращается суперинфекция другими изолятами ВГС [5]. Учитывая, что для свершения акта вирусной рекомбинации необходимо одновременное заражение одной и той же клетки двумя различными вирусными частицами, невозможность подобной суперинфекции предотвращает появление рекомбинантных изолятов [6].

Тем не менее в 1999 г. при исследовании образцов, собранных от ВГС-инфицированных жителей Санкт-Петербурга, были получены противоречивые результаты. Так, дополнительное определение нуклеотидной последовательности района 5’UTR-core для 146 ранее секвенированных по гену NS5b изолятов выявило несоответствие результатов генотипирования по разным областям генома. Шесть образцов были отнесены к субтипу 2k при анализе района 5’UTR-core, в то время как филогенетический анализ фрагмента гена NS5b отнес их к субтипу 1b. Для остальных изолятов подобных генотипических расхождений получено не было. Эти 6 изолятов, полученные от разных пациентов, формировали отдельные кластеры на филогенетических деревьях, построенных для обоих исследуемых районов генома, располагаясь при этом на ветвях, образованных разными генотипами, что косвенно свидетельствовало об их общем рекомбинантном происхождении. В дальнейшем была подтверждена точка рекомбинации, расположенная в гене NS2 между нуклеотидами 3175 и 3176 [4].

После первого случая обнаружения и подтверждения рекомбинации стали появляться и другие сообщения о новых естественных рекомбинантах ВГС. Данные обо всех обнаруженных на текущий момент рекомбинантных меж-генотиповых изолятах ВГС, имеющих естественное происхождение с подтвержденной точкой рекомбинации, представлены в табл. 1 [4,

Таблица 1. Природные межгенотиповые рекомбинанты ВГС Примечание. * — единственная циркулирующая рекомбинантная форма ВГС — CRF01_1b2k.
7—24]. Все они, за исключением изолятов типа 2b/1a, 2b/1b и 2k/1b, были выявлены однократно. Рекомбинантные изоляты ВГС типа 2b/1a, 2b/1b и 2k/1b были описаны в целом ряде исследований [8—12, 14, 15, 22, 25]. Филогенетический анализ пяти геномных последовательностей изолятов 2b/1а и четырех 2b/1b не показал никакой видимой кластеризации рекомбинантных последовательностей друг с другом, что свидетельствует об их происхождении в результате индивидуальных событий рекомбинаций [22]. Напротив, рекомбинантные изоляты ВГС типа 2k/1b, впервые обнаруженные в Санкт-Петербурге, проявляют филогенетическую общность, образуя отдельную кладу при сравнении с изолятами субтипов 1b и 2k. Это является аргументом в пользу их происхождения в результате единственного акта рекомбинации, а не множественных событий с участием аналогичных родительских изолятов [16]. На сегодняшний день эти изоляты образуют единственную известную циркулирующую рекомбинантную форму (CRF-рекомбинантная форма была выявлена неоднократно у различных пациентов) ВГС. Поэтому по аналогии с номенклатурой, принятой для рекомбинантов ВИЧ-1, эту форму предложено было назвать CRF01_1b2k.

Интересно отметить, что точка рекомбинации для большинства межгенотипных рекомбинантов располагается на стыке генов NS2 и NS3, а 5’-часть генома относится ко второму генотипу [26]. Кроме межгенотипных рекомбинантов ВГС, выявлен целый ряд межсубтипных рекомбинантных изолятов без какого-либо определенного группирования сайтов рекомбинации [27].

Главное исходное условие для образования рекомбинантного штамма — это одновременное заражение организма-хозяина двумя различными изолятами, а также их одновременное присутствие в одной и той же клетке. Это могут быть вирусные квазивиды, что является предпосылкой для образования внутрисубтипных рекомбинантов, или микстинфекция — для внутри- и межгенотипных рекомбинантов. Однако, хотя микстинфекции ВГС или суперинфекция обнаруживаются, особенно после переливания крови, пересадки органов и гемодиализа, а также среди лиц, употребляющих наркотоки внутривенно, весьма редкое образование жизнеспособных рекомбинантных штаммов говорит о существовании определенных лимитирующих факторов.

Одним из таких факторов может быть известное разделение ВГС-вариантов между плазмой крови и мононуклеарами периферической крови (МПК), когда вследствие автономной репликации ВГС в МПК квазивиды, циркулирующие в плазме крови, отличаются от содержащихся в МПК [28]. Были описаны случаи выявления в плазме крови и МПК изолятов ВГС различных генотипов и субтипов. Так, при циркулирующем в плазме крови ВГС субтипе 1а, МПК содержали смесь ВГС субтипов 1а и 1b, при этом только В-клетки содержали субтип 1b, а моноциты и CD8 T-лимфоциты — циркулирующий 1а [28]. В другом случае, при наличии в плазме крови ВГС генотипа 4 в МПК выявляли ВГС генотипов 4 и 1 (генотип 1 — в В- и CD8 Т-клетках, генотип 4 — в моноцитах). Эта генотипическая раздробленность сохранялась, по крайней мере, в течение года, и, как предполагается, является результатом микстинфекции [29].

Другим лимитирующим фактором является уже упомянутая ранее невозможность суперинфекции клетки разными вариантами ВГС [5], а также быстрое превалирование одного из изолятов над остальными при одновременной множественной инфекции ВГС [30]. Тем не менее в 2007 г. появилась первая экспериментальная работа по выявлению множественных внутригенотипных рекомбинантов при одновременном заражении шимпанзе ВГС двух субтипов, 1а и 1b [31]. Эта работа продемонстрировала способность различных изолятов ВГС эффективно рекомбинировать in vivo с частотой кроссинговера 3·10–5/нуклеотид при допущении, что рекомбинация идет равномерно вдоль всего генома. Позже формирование рекомбинантов ВГС было продемонстрировано in vitro в клетках гепатомы человека Huh7.5, инфицированных культурально-адаптированным реплицирующимся японским изолятом JFH1 генотипа 2а и нереплицирующимися природными изолятами генотипов 1а, 1b, 3а и 4а [32]. Однако частота образования рекомбинантов ВГС в условиях in vitro была в 10 раз ниже в сравнении с другими флавивирусами, что, по всей видимости, обусловлено неспособностью природных изолятов ВГС реплицироваться в культурах клеток и соответственно реализацией только одного механизма рекомбинации — нерепликативного.

Механизмы рекомбинации ВГС

Описано 2 механизма рекомбинации: репликативный и нерепликативный, и каждый имеет свои ограничения. Процесс рекомбинации может встречать препятствия на различных уровнях, что мешает частому появлению жизнеспособных рекомбинантов [33]. Эти ограничения, так же, как и более слабый уровень репликации рекомбинантного штамма по сравнению с родительским, могут объяснять низкую частоту выявления рекомбинантных изолятов.

Наиболее популярная теория образования рекомбинантных изолятов ВГС включает репликативный механизм, описанный для других РНК-вирусов и известный так же, как «copy-choice model» или «template-switching mechanism» [34]. Он подразумевает синтез рекомбинантной цепи в два этапа: 1) синтез РНК с матрицы-РНК-донора, последующая остановка RdRp и диссоциация репликативного комплекса от матрицы; 2) связывание комплекса RdRp-синтезированный фрагмент кРНК с матрицей-акцептором с образованием нового репликативного комплекса, и переключение с копирования матрицы-донора на копирование матрицы-акцептора без высвобождения синтезируемой цепи. Этот механизм зависит от наличия специфических последовательностей, а также требует особой вторичной структуры РНК.

В случае RF1_2k/1b были обнаружены две стабильные шпилечные структуры HS1 и HS2, расположенные до и после точки рекомбинации в «+» цепи родительских генотипов 1b и 2k, но при этом они отсутствуют у известных рекомбинантов 2k/1b и в «–» цепи генотипов 1b и 2k. Район между шпильками HS1 и HS2 содержит короткий участок (н.o. 3177−3188) высококонсервативной для всех генотипов нуклеотидной последовательности, которая может служить в качестве матрицы при повторной инициации синтеза РНК на акцепторной цепи. Последовательность поли (А) (н.o. 3270−3275), характерная для субтипа 2k, может играть роль промотора. Несмотря на то что в случае ВГС синтез «+» цепи РНК происходит чаще, чем синтез «–» цепи, наиболее вероятно, что рекомбинация произошла во время синтеза «–» цепи с РНК родительского генотипа 1b в качестве матрицы-донора и РНК генотипа 2k в качестве матрицы-акцептора [35].

Репликативный механизм формирования другого меж-генотипового рекомбинантного варианта 2i/6 также был подтвержден. В регионе вокруг точки рекомбинации была обнаружена нуклеотидная последовательность с высокой степенью гомологии между двумя предполагаемыми родительскими генотипами и стабильные шпилечные структуры в «+» цепи референсного изолята 6-го генотипа [17].

Присутствие последовательности генотипа 2 в структурной части генома межгенотипных рекомбинантых изолятов косвенно подтверждает, что этот генотип предрасположен к рекомбинации ВГС, особенно на втором этапе образования репликативного комплекса и повторной инициации репликации, подразумевая, что не все генотипы ВГС способны к рекомбинации [36].

Второй возможный механизм рекомбинации — это нерепликативное воссоединение разрывов. Этот механизм был описан для ВГС в условиях отсутствия функциональной вирусной полимеразы in vitro [32]. Важно отметить, что точки разрывов в жизнеспособных рекомбинантах ВГС располагались вдоль всего генома вируса. Это свидетельствует в пользу гипотезы, что разрывы индуцируются случайно механически или эндорибонуклеазами клетки, а не только в строго локализованных участках рибозимов, как предполагалось ранее [37]. В целом модель нерепликативной рекомбинации по механизму «разрыв—воссоединение» выглядит следующим образом. Вирусные геномы, присутствующие в цитоплазме клетки, могут подвергаться случайным разрывам эндонуклеазами, рибозимами или механическим воздействием. При этом образуются геномные фрагменты с 3’-P или 5’-OH-концами, которые могут самолигироваться или соединяться с помощью клеточных лигаз. В результате образуется большая популяция негомологичных рекомбинантов с аберрантными геномными структурами, большинство из которых нежизнеспособны. Однако единичные геномные варианты могут оказаться способными к трансляции функциональных белков и реплицироваться в клетке. Кроме того, жизнеспособные рекомбинанты могут подвергаться дальнейшей коррекции по репликативному механизму рекомбинации с формированием высокоактивных вариантов, которые способны быстро распространяться от клетки к клетке и занять доминантную позицию в вирусной популяции [34]. Таким образом, два типа рекомбинации, репликативный и нерепликативный, могут эффективно комбинироваться друг с другом с формированием большого разнообразия рекомбинантных вариантов ВГС.

Выявление CRF01_1b2k в Сибири

В 2001—2002 гг. при анализе 132 образцов крови больных острым гепатитом С в Алтайском крае нами были выявлены 3 изолята ВГС (KNG318, KNG327 и HIA1002), генотипирование которых показало неоднозначные результаты [7]. Анализ фрагмента области Core этих изолятов показал их принадлежность к субтипу 2k, анализ фрагмента области NS5b — к субтипу 1b. С целью подтверждения рекомбинации субтипов 2k/1b для изолятов KNG318 и KNG327 была определена полная нуклеотидная последовательность гена NS2, описанного к моменту нашего исследования как возможное местоположение точки рекомбинации [4]. Сравнение полученных последовательностей с гомологичными, депонированными в базе данных GenBank, а также результаты анализа с использованием метода bootscan подтвердили наличие точки перекреста для выявленных рекомбинантных изолятов KNG318 и KNG327 в нуклеотидной позиции 3175 генома ВГС (согласно нумерации нуклеотидов изолята pJ6CF субтипа 2а, AF177036 в базе данных GenBank) [7].

Нужно отметить, что пациенты KNG318 и HIA1002 являлись супругами, один из которых признался во внутривенном употреблении наркотиков. Таким образом, два рекомбинантных варианта с этой маркировкой имеют одно и то же происхождение. Однако вариант KNG327 не связан с двумя предыдущими, и источник инфицирования ВГС в данном случае остался невыясненным.

Выявление рекомбинантов ВГС типа 2k/1b в Сибири, которая существенно удалена от места их первичного обнаружения в Санкт-Петербурге [4], позволяет предположить распространенность рекомбинантов данного типа на всей территории России. Сравнительно небольшая выявляемость рекомбинантных изолятов ВГС в первую очередь может быть связана с принятой повсеместно практикой использовать для установления генотипа только один район генома, в качестве которого чаще всего выступает 5’-UTR как наиболее консервативный и диагностически значимый регион. При таком способе генотипирования рекомбинантные изоляты ВГС типа 2k/1b при проведении рутинной лабораторной диагностики будут определены как изоляты ВГС генотипа 2, что повлечет за собой выбор схемы лечения более легкой, чем это может быть необходимо для достижения стойкого вирусологического ответа.

Для определения изолятов с данным типом рекомбинации мы разработали метод скринингового генотипирования с использованием ПЦР со специфическими праймерами. Были выбраны последовательности праймеров в гене NS2, специфические для субтипов 1b и 2k, таким образом, что точка рекомбинации располагалась внутри целевого продукта. Поскольку изоляты ВГС, циркулирующие на территории России, в подавляющем числе случаев относятся к субтипам 1b, 3a и субтипам генотипа 2: 2а, 2с и 2k, было решено включить в нашу мультипраймерную систему также праймеры для определения изолятов субтипа 3а. Структуры праймеров приведены в табл. 2.

Таблица 2. Праймеры для скринингового генотипирования изолятов ВГС Примечание. * — для вырожденных положений использована однобуквенная номенклатура IUPAC/IUB; ** — ориентация: S — сенс, AS — антисенс. Указаны положения праймеров на геноме прототипного изолята HCV-1 [38].
Амплифицированный продукт второго раунда имел разную длину для каждого из генотипов (193 п.н. — для 1b, 430 п.н. — для 2а, 2с и 2k, 309 п.н. — для 2k/1b рекомбинантных изолятов, 242 п.н. — для изолятов субтипа 3а). Детекцию проводили в 1% агарозном геле, результат представлен на рис. 1.
Рис. 1. Электрофореграмма в 1% агарозном геле продуктов амплификации в мультипраймерной системе для скринингового генотипирования изолятов ВГС. 1, 2 — субтип 1b; 3 — субтип 2а; 4, 5 — рекомбинантные изоляты типа 2k/1b; 6, 7 — субтип 3а.

Для оценки специфичности созданной диагностической мультиплексной системы в качестве анализируемых образцов использовали 50 изолятов ВГС, для которых была определена нуклеотидная последовательность фрагментов генов Сore и NS5b, на основании чего был точно установлен субтип ВГС. Во всех 50 случаях был получен положительный результат в ПЦР и установлен субтип, соответствующий определенному ранее (табл. 3).

Таблица 3. Оценка специфичности мультипраймерной системы Примечание. * — субтип ВГС определен на основании филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов Core и NS5b.

Далее разработанную тест-систему использовали для выявления рекомбинантов ВГС типа 2k/1b в Новосибирске в период 2005—2014 гг. Было исследовано 1010 образцов сывороток крови, полученных от пациентов ГУЗ «Государственный Новосибирский областной клинический диагностический центр» (Новосибирск) с подозрением на ВГС-инфекцию, а также обратившихся в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора для диагностики ВГС. Маркеры ВГС были выявлены в 581 образце, которые затем анализировали с использованием разработанной мультиплексной тест-системы. Генотип был определен для 496 образцов: субтип 1b был установлен для 278 (56,0%) образцов, субтип 3а — для 155 (31,3%), генотип 2 определили в 58 (11,7%) случаях, 5 (1,0%) образцов являлись рекомбинантами типа 2k/1b. Для 85 образцов не удалось установить генотип, используя созданную систему для генотипирования, вследствие отрицательного результата ПЦР, несмотря на наличие РНК ВГС, установленное в результате ПЦР-анализа области 5’-UTR.

Полученный нами результат показывает состоятельность созданной тест-системы, подходящей для скринингового генотипирования. Положительного результата, т. е. установления генотипа, удалось достичь для 85% исследованных образцов. Кроме того, использование данной системы позволило выявить 5 новых рекомбинантных изолятов типа 2k/1b, не прибегая к определению нуклеотидной последовательности двух различных регионов генома, что дает несомненный финансовый и временной выигрыш. К недостаткам созданной системы можно отнести несколько более низкую чувствительность по сравнению с чувствительностью ОТ-ПЦР района 5’-UTR, а также ограни-ченный спектр выявляемых субтипов и невозможность определять другие типы рекомбинантных изолятов ВГС. С другой стороны, более 90% изолятов ВГС, выявляемых на территории России и до 99% на территории Сибири, относятся к субтипам 1b, 2a, 2c и 3a [39—45], которые успешно выявляются нашей тест-системой, что делает ее подходящей для скринингового генотипирования в клинической практике.

Для четырех вновь выявленных рекомбинантных изолятов (PSA-62, PSA-108, PSA-1001 и PSA-1742) были определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов Core, E1, NS2 и NS5b. Для изолята PSA-424 определена последовательность полного генома. Нуклеотидную последовательность фрагмента гена NS2 использовали для подтверждения точки рекомбинации, остальные полученные последовательности применялись при проведении филогенетического анализа рекомбинантных изолятов.

Филогенетическое сравнение сибирских изолятов 2k/1b с описанными ранее

Значительная распространенность рекомбинантной формы ВГС типа 2k/1b может свидетельствовать как об общем происхождении и последующей дивергенции таких вариантов патогена в различных регионах, так и о независимых актах рекомбинации. На сегодняшний день не имеется однозначных данных для выявления истинных путей возникновения и распространения рекомбинантных форм ВГС. С одной стороны, субтип 1b является превалирующим как на территории России, так и в странах Западной Европы [46], а изоляты субтипа 2k хоть и не столь многочисленны, но в единичных случаях выявляются не только в России (в частности, в Санкт-Петербурге [4]), но и за ее пределами (например, в Молдове [47], Узбекистане [48] и Франции [49]), что свидетельствует о существенной распространенности данного субтипа. Параллельная циркуляция ВГС этих двух субтипов на значительной территории могла привести и к нескольким независимым событиям рекомбинации. С другой стороны, доля в популяции рекомбинантных форм ВГС показывает, что, хотя рекомбинация имеет место в эволюции ВГС, это событие достаточно редкое, по крайней мере по сравнению с ВИЧ. В пользу единого происхождения выявленных к настоящему времени рекомбинантов типа 2k/1b свидетельствует, в первую очередь, высокое филогенетическое родство между всеми обнаруженными изолятами этого типа.

Это подтверждается проведенным нами анализом последовательностей фрагментов генов Core (359 н.о.), E1 (384 н.о.), NS2 (255 н.о.) и NS5b (338 н.о.) выявленных в настоящее время изолятов CRF01_1b2k (n=47), которые имелись в базе данных GenBank к моменту написания данной статьи. Для оценки уровня вариабельности указанных регионов генома в анализ были включены нуклеотидные последовательности прототипных изолятов субтипов 1b, изолятов субтипа 2k — в качестве родительских субтипов и субтипа 3a — в качестве внешней группы. Для всех рассмотренных районов генома была показана высокая идентичность рекомбинантных изолятов, при этом уровень гомологии последовательностей рекомбинантных изолятов был несколько выше, чем в случае их сравнения с последовательностью прототипного изолята родительского субтипа (табл. 4).

Таблица 4. Сравнение уровня гомологии нуклеотидных последовательностей различных регионов генома изолятов ВГС CRF01_1b2k Примечание. * — количество рекомбинантных изолятов, для которых последовательности соответствующих фрагментов генома присутствовали в базе данных GenBank на момент анализа.

Филогенетический анализ фрагментов генов Core-E1 и NS5b показал, что изоляты ВГС CRF01_1b2k, выявленные в Сибири и других регионах России и мира, образуют близкородственные кладистические группы (по одной на каждом дереве), не включающие нерекомбинантные прототипные изоляты любого другого типа (рис. 2, 3).

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное методом NJ, нуклеотидных последовательностей фрагмента генов Core/E1 (861−1298 н.о., в соответствии с системой нумерации AF009606) рекомбинантных изолятов ВГС типа 2k/1b. Приведены индексы статистической поддержки узлов дерева, превышающие 70, а также масштаб шкалы генетических расстояний. Вертикальная скобка объединяет рекомбинантные изоляты ВГС типа 2k/1b, полужирным отмечены сибирские изоляты.
Рис. 3. Филогенетическое дерево, построенное методом NJ, нуклеотидных последовательностей фрагмента гена NS5b (8283−8568 н.о., в соответствии с системой нумерации AF009606) рекомбинантных изолятов ВГС типа 2k/1b. Приведены индексы статистической поддержки узлов дерева, превышающие 70, а также масштаб шкалы генетических расстояний. Вертикальная скобка объединяет рекомбинантные изоляты ВГС типа 2k/1b, полужирным отмечены сибирские изоляты.
При этом не было отмечено группирования изолятов по территориальному признаку (месту выявления и происхождения) и по предполагаемым путям инфицирования. Индексы статистической поддержки узлов были высокими (71 и 88% для филогенетических деревьев, построенных на основании последовательностей фрагментов генов core/E1 и NS5B соответственно), но не достигли статистической значимости, возможно, из-за малой длины проанализированных последовательностей.

Для проверки этого предположения был проведен анализ протяженных последовательностей рекомбинантных изолятов, с использованием полногеномных последовательностей изолята PSA424 и 11 рекомбинантных изолятов из базы данных GenBank. Филогенетический анализ проводили отдельно для 5’-части генома до точки рекомбинации (рис. 4, а)

Рис. 4. Филогенетические деревья, построенные методом NJ, нуклеотидных последовательностей 5’-части, длиной 3139 н.о. (А) и 3’-части, длиной 5952 н.о. (Б) генома рекомбинантных изолятов ВГС. Приведены индексы статистической поддержки узлов дерева, превышающие 70, а также масштаб шкалы генетических расстояний. Вертикальная скобка объединяет рекомбинантные изоляты ВГС типа 2k/1b.
и для 3’-части после точки рекомбинации (см. рис. 4, б). При использовании этого подхода удалось показать статистически значимые индексы поддержки узлов (96 и 100%).

Наблюдаемый высокий уровень гомологии нуклеотидных последовательностей и филогенетическая близость всех рекомбинантных изолятов типа 2k/1b, показанная для двух удаленных друг от друга геномных регионов, расположенных по разные стороны от точки рекомбинации, а также в районе ее расположения, четко указывают на общность происхождения изолятов в результате единственного акта рекомбинации. Таким образом, существующая в настоящий момент вирусная популяция СRF1_1b2k, по всей вероятности, является результатом распространения одного и того же рекомбинанта, а не следствием конвергентной эволюции различных рекомбинантных вирусных штаммов.

Расчеты, проведенные для 12 вышеуказанных полногеномных последовательностей рекомбинантных изолятов с помощью метода молекулярных часов, показали, что рекомбинация вероятнее всего произошла в интервале 1957—1970 гг. (рис. 5).

Рис. 5. Хронограммы, построенные на основании нуклеотидных последовательностей 5’-части генома (от начала гена Core до точки рекомбинации) длиной 2862 н.о. (А) и 3’-части генома (от точки рекомбинации до конца гена NS5b) длиной 5937 н.о. (Б), изолятов CRF01_1b2k и родительских подтипов. Времена дивергенции оценены с использованием программы TreeAnnotator v1.5.4 из пакета Beast, которые затем визуализировали в программе FigTree. Значения времен дивергенции в годах приведены в узлах дерева. Расчетное время дивергенции изолятов CRF01_1b2k и VAT-96, наиболее близкого родительского изолята субтипа 2k, составляет около 60 лет, тогда же началось раcхождение CRF01_1b2k и ближайших изолятов субтипа 1b. Учитывая, что дивергенция внутри клады CRF01_1b2k началась 35—46 лет назад, можно предположить, что наиболее вероятное время образования рекомбинантной формы находится в интервале 1957—1970 гг.
Эти данные несколько отличаются от данных J. Raghwani и соавт. [8], которые рассчитали время образования рекомбинантной формы в период 1923—1956 гг. Расхождения временных интервалов могут объясняться использованием J. Raghwani и соавт. не полногеномных последовательностей СRF1_1b2k для расчета времени дивергенции, а значительно более коротких фрагментов генов Core/E1 и NS5B.

Несмотря на то что за последние годы изоляты СRF1_1b2k выявляли в таких странах, как Россия, Азербайджан, Армения, Узбекистан, Грузия, Эстония, Ирландия, Германия, Израиль, Кипр, США, Франция и Нидерланды, большинство из них прямо или косвенно были связаны со странами бывшего Советского Союза. Филогене-тически близкие (по результатам анализа области Core-E1) к рекомбинантам изоляты ВГС субтипа 2k также были выделены в Молдове (VAT96, номер в базе данных GenBank AB031663), на территории Алтайского края (ALT837, AB327019) и в нашем исследовании в Новосибирской области (PSA1106, PSA1802). В связи с этим наиболее вероятным местом происхождения CRF01_1b2k представляется территория бывшего Советского Союза. К такому же заключению пришли и другие ученые [8, 16].

Эпидемиологические особенности инфекции CRF01_1b2k

Изоляты 2k/1b, впервые обнаруженные в Санкт-Петербурге и являющиеся объектом исследования в нашей работе, образуют единственную известную широко циркулирующую рекомбинантную форму ВГС CRF01_1b2k. К настоящему моменту выявлено около 100 рекомбинантных изолятов этого типа в разных странах, включая изоляты, обнаруженные нами. Средний возраст лиц, инфицированных CRF01_1b2k, на момент диагностирования у них ВГС составлял 34,5 года, что соответствует и изолятам, выявленным в России, — 33,2 года. Рекомбинантные изоляты намного чаще выявляли у мужчин, чем у женщин.

В наших исследованиях на территории Сибири были обнаружены 8 изолятов CRF01_1b2k и только 2 изолята, относящихся к одному из родительских субтипов 2k. Вероятно, приобретение рекомбинантом неструктурной части генома, содержащей гены, кодирующие репликативный комплекс родительского субтипа 1b, дало преимущество в распространении по сравнению с субтипом 2k. Этот факт большей встречаемости рекомбинантной формы можно объяснить попаданием CRF01_1b2k в группу риска, например в среду потребителей внутривенных наркотиков, где скорость распространения вируса существенно выше, чем в остальной популяции. Такое предположение подтверждается фактом, что больше всего CRF01_1b2k выявляют среди лиц, употребляющих наркотики внутривенно [8]. Однако было бы ошибочным считать, что CRF01_1b2k распространяется только среди наркоманов. Зачастую и сам дизайн исследования предполагает работу в основном с этой социальной группой, не затрагивая основную популяцию. Так, были выявлены рекомбинантные изоляты в Азербайджане [32], Узбекистане [25] и России [14]. В нашем исследовании, направленном на изучение эпидемиологической обстановки с ВГС среди так называемой «основной популяции», только 1 из 8 носителей CRF01_1b2k признал употребление наркотиков [7]. В других случаях наиболее вероятной причиной инфицирования являлись: половой путь, перенесенные множественные гемотрансфузии и хирургические операции, контакт с инфицированной кровью на рабочем месте. В трех случаях не удалось установить предполагаемый путь заражения. Таким образом, нельзя однозначно связывать распространение CRF01_1b2k только с употреблением внутривенных наркотиков.

Встречаемость рекомбинантов ВГС типа 2k/1b на уровне 3% в Санкт-Петербурге [4], достаточно удаленном от места нашего исследования, позволяет предположить распространение CRF01_1b2k по всей территории России. А недавнее обнаружение аналогичных форм ВГС в других странах позволяет существенно расширить возможный ареал циркуляции таких изолятов. В нашей работе при исследовании групп пациентов с острым и хроническим вирусным гепатитом С из двух cибирских регионов, Алтайского края и Новосибирской области, в обеих группах были выявлены рекомбинантные изоляты ВГС [7, 10, 44]. Среди жителей Алтайского края, у которых проявлялись симптомы острого гепатита, рекомбинанты выявляли с частотой 1,3%, аналогичный уровень (1,0%) был продемонстрирован среди пациентов с вирусным гепатитом С, проживающих в Новосибирской области. Учитывая данные первой работы [4], мы можем оценить встречаемость рекомбинантных изолятов 2k/1b на уровне не менее 1% на всей территории России.

Заключение

Сравнение нуклеотидных последовательностей 4 районов генома ВГС выявило высокую степень гомологии среди всех известных в настоящее время изолятов CRF01_1b2k. Филогенетический анализ последовательностей подтвердил общность их происхождения. Изоляты CRF01_1b2k, выявленные нами в Сибири, и изоляты, описанные другими авторами, образовывали близкородственные кладистические группы, не включающие нерекомбинантные прототипные изоляты любого другого типа. Такие группы наблюдались как при использовании для анализа фрагментов генов Core/E1, расположенных на 5’-конце генома и относящихся к субтипу 2k, так и фрагментов гена NS5b на 3’-конце генома, принадлежащих субтипу 1b. Подобная филогенетическая близость делает наиболее вероятной гипотезу о едином происхождении изолятов CRF01_1b2k. Нами также предполагается, что местом происхождения CRF01_1b2k является территория бывшего Советского Союза. В пользу данного предположения говорят следующие факты:

— выделенные в разных странах изоляты CRF01_1b2k прямо или косвенно были связаны со странами бывшего Советского Союза;

— наиболее филогенетически близкие (по результатам анализа области Core-E1) к CRF01_1b2k изоляты родительского субтипа 2k из числа присутствующих в GenBank были выделены в Молдове, Узбекистане, на территории Алтайского края и Новосибирской области.

Расчеты, произведенные с помощью метода молекулярных часов, показали, что рекомбинация произошла в интервале 1957—1970 гг. В этот период времени в СССР началось внутривенное распространение наркотиков, среда потребителей которых является превалирующей для смешанных инфекций и реинфекций разными генетическими вариантами ВГС. Встречаемость изолятов CRF01_1b2k на территории России в настоящее время мы оцениваем на уровне не менее 1%.

Работа выполнена в рамках государственного задания ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» ГЗ-5/16 (номер государственного учета НИР АААА-А16−116040810102−6).

The work was supported by the State Contract 5/16 of the FBRI SRC VB «Vector» (state registration number AAAA-A16−116040810102−6).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Чуб Е.В. — https://orcid.org/0000-0003-1521-897X

Сиволобова Г.Ф. — https://orcid.org/0000-0002-8362-0314

Нетесов С.В. — https://orcid.org/0000-0002-7786-2464

Кочнева Г.В. — https://orcid.org/0000-0002-2420-0483

Как цитировать:

Чуб Е.В., Сиволобова Г.Ф., Нетесов С.В., Кочнева Г.В. Рекомбинантные варианты вируса гепатита С в Сибири. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(2):64-75.

Для корреспонденции: Кочнева Галина Вадимовна — д.биол.н., заведующая лабораторией вирусных гепатитов ФБУН Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора; e-mail: kochneva@vector.nsc.ru; e-mail: g.v.kochneva@yandex.ru; https://orcid.org/0000-0002-2420-0483

Список литературы:

  1. Smith DB, Bukh J, Kuiken C, Muerhoff AS, Rice CM, Stapleton JT, et al. Expanded classification of hepatitis C virus into 7 genotypes and 67 subtypes: updated criteria and genotype assignment web resource. Hepatology. 2014;59(1):318-327.
  2. Yun Z, Lara C, Johansson B, Lorenzana de Rivera I, Sönnerborg AJ. Discrepancy of hepatitis C virus genotypes as determined by phylogenetic analysis of partial NS5 and core sequences. Med Virol. 1996;49(3):155-160.
  3. Viazov S, Widell A, Nordenfelt E. Mixed infection with two types of hepatitis C virus is probably a rare event. Infection. 2000;28(1):21-25.
  4. Kalinina O, Norder H, Mukomolov S, Magnius LO. A natural intergenotypic recombinant of hepatitis C virus identified in St. Petersburg. J Virol. 2002;4(76):4034-4043.
  5. Tscherne DM, Evans MJ, von Hahn T, Jones CT, Stamataki Z, McKeating JA, et al. Superinfection exclusion in cells infected with hepatitis C virus. J Virol. 2007;81(8):3693-3703.
  6. González-Candelas F, López-Labrador FX, Bracho MA. Recombination in hepatitis C virus. Viruses. 2011;3(10):2006-2024.
  7. Чуб Е.В., Кочнева Г.В., Гранитов В.М., Нетесов С.В. Рекомбинанты вируса гепатита С типа 2k/1b у населения Алтайского края. Инфекционные болезни. 2007;5(4):5-11.
  8. Raghwani J, Thomas XV, Koekkoek SM, Schinkel J, Molenkamp R, van de Laar TJ, et al. Origin and evolution of the unique hepatitis C virus circulating recombinant form 2k/1b. J Virol. 2012;86(4):2212-2220.
  9. Demetriou VL, de Vijver D, Kostrikis LG, Network C. Molecular epidemiology of hepatitis C infection in Cyprus: evidence of polyphyletic infection. J Med Virol. 2009;81(2):238-248.
  10. Kurbanov F, Tanaka Y, Chub E, Maruyama I, Azlarova A, Kamitsukasa H, et al. Molecular epidemiology and interferon susceptibility of the natural recombinant hepatitis C virus strain RF1_2k/1b. J Infect Dis. 2008;198(10):1448-1456.
  11. Moreau I, Hegarty S, Levis J, Sheehy P, Crosbie O, Kenny-Walsh E, et al. Serendipitous identification of natural intergenotypic recombinants of hepatitis C in Ireland. Virol J. 2006;3:95. doi: 10.1186/1743-422X-3-95
  12. Tallo T, Norder H, Tefanova V, Krispin T, Schmidt J, Ilmoja M, et al. Genetic characterization of hepatitis C virus strains in Estonia: fluctuations in the predominating subtype with time. J Med Virol. 2007;79(4):374-382.
  13. Karchava M, Waldenstrom J, Parker M, Hallack R, Sharvadze L, Gatserelia L, et al. High incidence of the hepatitis C virus recombinant 2k/1b in Georgia: Recommendations for testing and treatment. Hepatol Res. 2015;45(13):1292-1298.
  14. Viazov S, Ross SS, Kyuregyan KK, Timm J, Neumann-Haefelin C, Isaeva OV, et al. Hepatitis C virus recombinants are rare even among intravenous drug users. J Med Virol. 2010;82(2):232-238.
  15. Morel V, Descamps V, François C, Fournier C, Brochot E, Capron D, et al. Emergence of a genomic variant of the recombinant 2k/1b strain during a mixed hepatitis C infection: a case report. J Clin Virol. 2010;47(4):382-386.
  16. Susser S, Dietz J, Schlevogt B, Zuckerman E, Barak M, Piazzolla V, et al. Origin, prevalence and response to therapy of hepatitis C virus genotype 2k/1b chimeras. Journal of Hepatology. 2017;67(4):680-686.
  17. Noppornpanth S, Lien TX, Poovorawan Y, Smits SL, Osterhaus AD, Haagmans BL. Identification of a naturally occurring recombinant genotype 2/6 hepatitis C virus. J Virol. 2006;80(15):7569-7577.
  18. Kageyama S, Agdamag DM, Alesna ET, Leaño PS, Heredia AML, Abellanosa-Tac-An IP, et al. A natural inter-genotypic (2b/1b) recombinant of hepatitis C virus in the Philippines. J Med Virol. 2006;78(11):1423-1428.
  19. Legrand-Abravanel F, Claudinon J, Nicot F, Dubois M, Chapuy-Regaud S, Sandres-Saune K, et al. New natural intergenotypic (2/5) recombinant of hepatitis C virus. J Virol. 2007;81(8):4357-4362.
  20. Lee Y-M, Lin H-J, Chen Y-J, Lee C-M, Wang S-F, Chang K-Y, et al. Molecular epidemiology of HCV genotypes among injection drug users in Taiwan: full-length sequences of two new subtype 6w strains and a recombinant form 2b6w. J Med Virol. 2010;82(1):57-68.
  21. Bhattacharya D, Accola MA, Ansari IH, Striker R, Rehrauer WM. Naturally occurring genotype 2b/1a hepatitis C virus in the United States. Virol J. 2011;8:458-469.
  22. Hedskog C, Doehle B, Chodavarapu K, Gontcharova V, Crespo Garcia J, De Knegt R, et al. Characterization of hepatitis C virus intergenotypic recombinant strains and associated virological response to sofosbuvir/ribavirin. Hepatology. 2015;61(2):471-480.
  23. Yokoyama K, Takahashi M, Nishizawa T, Nagashima S, Jirintai S, Yotsumoto S, et al. Identification and characterization of a natural inter-genotypic (2b/1b) recombinant hepatitis C virus in Japan. Arch Virol. 2011;156(9):1591-1601.
  24. Iles JC, Njouom R, Foupouapouognigni Y, Bonsall D, Bowden R, Trebes A, et al. Characterization of hepatitis C virus recombination in Cameroon by use of nonspecific next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 2015;53(10):3155-3164.
  25. Kurbanov F, Tanaka Y, Avazova D, Khan A, Sugauchi F, Kan N, et al. Detection of hepatitis C virus natural recombinant RF1_2k/1b strain among intravenous drug users in Uzbekistan. Hepatology Research. 2007;38(5):457-464.
  26. Калинина О.В., Дудина К.Р., Козина А.Н., Дмитриев А.В., Исагулянц М.Г., Знойко О.О. Межгенотипные рекомбинанты вируса гепатита С — природные модели для изучения молекулярно-генетических детерминант резистентности вируса к действию противовирусных препаратов. Трансляционная медицина. 2014;3(26):29-38.
  27. Calado RA, Rocha MR, Parreira R, Piedade J, Venenno MT, Esteves A. Hepatitis C virus subtypes circulating among intravenous drug users in Lisbon, Portugal. J Med Virol. 2011;83(4):608-615.
  28. Okuda M, Hino K, Korenaga M, Yamaguchi Y, Katoh Y, Okita K. Differences in hypervariable region 1 quasispecies of hepatitis C virus in human serum, peripheral blood mononuclear cells, and liver. Hepatology. 1999;29(1):217-222.
  29. Roque-Afonso AM, Ducoulombier D, Di Liberto G, Kara R, Gigou M, Dussaix E, et al. Compartmentalization of hepatitis C virus genotypes between plasma and peripheral blood mononuclear cells. J Virol. 2005;79(10):6349-6357.
  30. Laskus T, Wang LF, Radkowski M, Vargas H, Nowicki M, Wilkinson J, et al. Exposure of Hepatitis C Virus (HCV) RNA-Positive Recipients to HCV RNA-Positive Blood Donors Results in Rapid Predominance of a Single Donor Strain and Exclusion and/or Suppression of the Recipient Strain. J Virol. 2001;75(5):2059-2066.
  31. Gao F, Nainan OV, Khudyakov Y, Li J, Hong Y, Gonzales AC, et al. Recombinant hepatitis C virus in experimentally infected chimpanzees. J Gen Virol. 2007;88(Pt1):143-147.
  32. Scheel TKH, Galli A, Li Y-P, Mikkelsen LS, Gottwein JM, Bukh J. PLoS Pathog. 2013;9(3):e1003228.
  33. Worobey M, Holmes EC. Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses. J Gen Virol. 1999;80(Pt10):2535-2543.
  34. Galli A, Bukh J. Comparative analysis of the molecular mechanisms of recombination in hepatitis C virus. Trends in Microbiology. 2014;22(6):354-364.
  35. Kalinina O, Norder H, Magnius LO. Full-length open reading frame of a recombinant hepatitis C virus strain from St. Petersburg: proposed mechanism for its formation. J Gen Virol. 2004;85:1853-1857.
  36. Morel V, Fournier C, François C, Brochot E, Helle F, Duverlie G, et al. J. Genetic recombination of the hepatitis C virus: clinical implications. Viral Hepat. 2011;18(2):77-83.
  37. Austermann-Busch S, Becher P. RNA structural elements determine frequency and sites of nonhomologous recombination in an animal plus-strand RNA virus. J Virol. 2012;86(13):7393-7402.
  38. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 1989;244:359-362.
  39. Viazov S, Kuzin S, Paladi N, Tchernovetsky M, Isaeva E, Mazhul L, et al. Hepatitis C virus genotypes in different regions of the former Soviet Union (Russia, Belarus, Moldova, and Uzbekistan). J Med Virol. 1997;53(1):36-40.
  40. Львов Д.К., Самохвалов Е.И., Mishiro S., Tsuda F., Селиванов Н.А., Okamoto H. и др. Закономерности распространения вируса гепатита С и его генотипов в России и странах СНГ. Вопр вирусол. 1997;42(4):157-161.
  41. Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Гаврилова И.В., Нестеров А.Е. и др. Частота встречаемости маркеров гепатита С и факторы риска у персонала больниц Новосибирской области. Журн микробиол. 2002;2:26-32.
  42. Шустов А.В., Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Гражданцева А.А., Гаврилова И.В., Акинфеева Л.А. и др. Встречаемость маркеров, распределение генотипов и факторы риска вирусного гепатита С среди некоторых групп населения Новосибирской области. Журн микробиол. 2004;5:20-25.
  43. Shustov AV, Kochneva GV, Sivolobova GF, Grazhdantseva AA, Gavrilova IV, Akinfeeva LA, Rakova IG, et al. Molecular epidemiology of the hepatitis C virus in Western Siberia. J Med Virol. 2005;77(3):382-389.
  44. Кочнева Г.В., Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Шустов А.В., Гаврилова И.В., Чуб Е.В. и др. Этиология острых гепатитов и генотипическое разнообразие вирусов гепатитов А, В, С и Е в трех регионах Сибири. Инфекционные болезни. 2005;3(1):26-31.
  45. Mukomolov S, Trifonova G, Levakova I, Bolsun D, Krivanogova E. Hepatitis C in the Russian Federation: challenges and future directions. Hepatic Medicine: Evidence and Research. 2016;8:51-60.
  46. Simmonds P. Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus — 15 years on. J Gen Virol. 2004;85(Pt11):3173-3188.
  47. Samokhvalov EI, Hijikata M, Gylka RI, Lvov DK, Mishiro S. Full-genome nucleotide sequence of a hepatitis C virus variant (isolate name VAT96) representing a new subtype within the genotype 2 (arbitrarily 2k). Virus Genes. 2000;20(2):183-187.
  48. Kurbanov F, Tanaka Y, Sugauchi F, Kato H, Ruzibakiev R, Zalyalieva M, et al. Hepatitis C virus molecular epidemiology in Uzbekistan. J Med Virol. 2003;69(3):367-375.
  49. Thomas F, Nicot F, Sandres-Saune K, Dubois M, Legrand-Abravanel F, Alric L, et al. Genetic diversity of HCV genotype 2 strains in south western France. J Med Virol. 2006;79(1):26-34.