Введение

Более половины зарегистрированных и вновь выявляемых патогенов человека имеют зоонозное происхождение [1]. К их числу относятся хантавирусы, принадлежащие к роду Orthohantavirus семейства Hantaviridae, ежегодно вызывающие 5—6 тыс. случаев геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) в РФ [2—3]. Возбудителями ГЛПС на территории страны являются 5 хантавирусов: Пуумала (PUUV), Добрава/Белград (DOBV), Сеул (SEOV), Хантаан (HTNV) и его генетический вариант Амур (AMRV). Недавние исследования в европейских странах показали, что, в дополнение к ним, вирус Тула (TULV) также является возбудителем ГЛПС, однако на территории РФ случаев инфицирования вирусом TULV не зарегистрировано [3—4]. Показано, что наиболее активные очаги ГЛПС в европейской части страны располагаются на территории ПФО, в ареале распространения рыжей полевки (Clethrionomys glareolus) — природного носителя вируса PUUV [3]. В ЦФО дополнительно регистрируют вспышки ГЛПС, ассоциированные с заражением вирусом DOBV, вариантом DOBV-Aa, циркулирующим среди полевых мышей (Apodemus agrarius agrarius). Очаги циркуляции этого вируса в полевых мышах выявлены также в Астраханской и Омской областях [5]. На территории Краснодарского края регистрируют тяжелые клинические формы ГЛПС, обусловленные инфицированием вирусом DOBV, вариант DOBV-Ap, носителем которого является кавказская мышь Sylvaemus ponticus [6].

В Республике Крым антиген хантавирусов регистрируют у 5 видов мелких млекопитающих: обыкновенной полевки (Microtus arvalis); общественной полевки (Microtus socialis); малой белозубки (Crocidura suaveolens); степной мыши (Sylvaemus witherbyi); домовой мыши (Mus musculus) [7]. До настоящего времени генетически идентифицирован лишь один вид хантавирусов, TULV, циркулирующий среди обыкновенных полевок формы obscurus [8].

Серомониторинг здорового населения показал, что 0,4—0,8% исследуемых лиц имеют специфические антитела к хантавирусу, а единичные случаи заболевания ГЛПС у жителей Крыма регистрировали начиная с 2017 г. [9]. Поскольку вид возбудителя ГЛПС у больных из Крыма не был определен, так же, как и виды хантавирусов, ассоциированных с четырьмя из пяти видов природных носителей, проблема идентификации хантавирусов, циркулирующих на территории Крыма, остается актуальной для общественного здравоохранения региона.

Для грызунов подсемейств Arvicolinae и Murinae и насекомоядных подсемейства Crocidurae установлена ко-эволюция хантавирусов и их природных носителей [10], поэтому можно предполагать циркуляцию отличающихся вариантов вируса Тула среди полевок M. arvalis и M. socialis, нового варианта вируса Добрава/Белград среди мышей S. witherbyi и нового хантавируса среди ранее неисследованного вида белозубок C. suaveolens.

Целью исследования является выявление и генетическая идентификация хантавирусов, циркулирующих среди природных носителей в различных районах Республики Крым.

Материал и методы

Экспедиции по сбору биоматериала были проведены в июне — сентябре 2021 г., в феврале — июне 2022 г., в апреле — июле 2023 г. на территории Республики Крым. При исследовании соблюдали институциональные и национальные стандарты по отлову животных в соответствии с протоколом и рекомендациями по безопасной работе МУ 3.1.0211-20 (утв. 03.09.2020). Протокол исследования был одобрен этическим комитетом ФГКУЗ «Противочумная станция Республики Крым» Роспотребнадзора (Протокол №1 от 25.08.2023).

Отобранные образцы легких помещали в жидкий азот либо в стабилизирующий раствор RNAlater (QIAGEN GmbH, Германия) для последующего выделения РНК и ее анализа методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ–ПЦР). Образцы от полевок рода Microtus, собранные в 2023 г., предварительно тестировали на присутствие антигена вируса методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора «Хантагност» (ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова», Россия). Подтверждение таксономической принадлежности животных, определенной на основе морфологических признаков, было проведено путем анализа фрагмента гена цитохрома B (cytB) митохондриальной ДНК.

Выделение РНК проводили с использованием набора «РИБО-преп» (ЦНИИ Эпидемиологии, Россия). Скрининг положительных в ИФА образцов от Microtus spp. и образцов от других видов проводили методом ОТ–ПЦР с использованием обратной транскриптазы М-MuLV-RH («Диа-М», Россия), Taq ДНК-полимеразы Hot Start («Диа-М», Россия) по протоколу и с праймерами на консервативную область гена РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp), кодируемую L-сегментом генома [11]. На основе вновь сконструированного набора праймеров получали частичный или полноразмерный S-сегмент генома, кодирующий нуклеокапсидный белок N. Определение нуклеотидных последовательностей каждой из цепей ампликонов выполняли на автоматическом анализаторе ABI Prism 310, используя набор BigDye Terminator Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, США). Для построения филогенетических деревьев использовали метод Maximum Likelihood (ML) с моделью эволюции GTR+I+Г в программе MEGA V [12]. Вычисления проводили для 1000 итераций.

Результаты и обсуждение

Образцы тканей легких 119 полевок рода Microtus, отловленных в 2023 г., предварительно тестировали методом ИФА на присутствие антигена вируса (табл.). Положительными оказались 4 образца: 1/51 M. arvalis и 3/68 M. socialis. Дальнейший скрининг образцов от мышей рода Sylvaemus (66), насекомоядных рода Crocidura (10), отловленных на территории Республики Крым в 2021—2023 гг., и положительных в ИФА образцов от полевок рода Microtus (4) был проведен методом ОТ—ПЦР с использованием праймеров к L-сегменту генома. Вирусная РНК обнаружена в трех образцах: 1/10 малых белозубок (C. suaveolens), 1/1 обыкновенных полевок (M. arvalis) и 1/3 общественных полевок (M. socialis) (см. таблицу). Вирусная РНК не выявлена в образцах от мышей рода Sylvaemus. Три РНК-положительных образца дополнительно анализировали с использованием набора праймеров к S-сегменту генома. Для образца от M. arvalis был получен S-сегмент генома (1782 п.н.), для образца от M. socialis был также получен фрагмент S-сегмента (883 п.н.), для образца от C. suaveolens последовательностей S-сегмента получить не удалось. Видовую принадлежность природных носителей вируса подтверждали анализом фрагмента гена cyt B. Проведенный анализ позволил уточнить вид одного из носителей вируса — полевок рода Microtus: обыкновенная полевка по уточненным данным отнесена к виду M. arvalis формы obscurus. Новые нуклеотидные последовательности депонированы в банке данных GenBank под номерами PP716119–PP716121, PQ117996-PQ117999.

Выявление инфицированных хантавирусами мелких млекопитающих методом ИФА и ОТ-ПЦР в Республике Крым

Филогенетический анализ, основанный на фрагментах L-сегмента генома, выявил среди новых РНК-изолятов 2 вида хантавирусов (рис. 1, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_04_039_add.zip). Сравнение полученных последовательностей с опубликованными в банке данных GenBank показало, что два новых РНК-изолята от полевок рода Microtus являются различающимися между собой вариантами вируса TULV, их отличие от ранее известных вариантов вируса составило более 11,9%. Уровень различий между новыми изолятами составил 15,6% для нуклеотидных и 4,4% для аминокислотных последовательностей. Для сравнительного анализа использованы ранее опубликованные последовательности геномов хантавирусов от полевок, отловленных в 2015 г. в Крыму [8, 13] и других регионах мира. Показано, что различие между последовательностями TULV, выявленными в одном и том же виде носителей, M. arvalis формы obscurus, из двух районов Крыма, Бахчисарайского (Crimea/Ma8 и Crimea/Ma18, вариант Russia IV, отловы 2015 г.) и Симферопольского (Crimea/Ma772, отлов 2023 г.), оказалось выше (17,4—17,7%) по сравнению с различием между новыми изолятами, обнаруженными от разных видов носителей. Филогенетический анализ показал группирование нового изолята (Crimea/Ma772) от M. arvalis формы obscurus с вирусом от M. arvalis (изолят Ma/5990-09), обнаруженным на территории Краснодарского края, образуя вариант Russia VI [14]. Второй новый РНК-изолят TULV (Crimea/Ms2099) от M. socialis на филогенетическом дереве формирует отдельную ветвь (вариант Russia VII). Его нуклеотидная последовательность наиболее близка варианту вируса, обнаруженному в Литве от Microtus arvalis (LT18/KAL13 Lithuania), уровень различия составил 12,5%.

Филогенетический анализ на основе S-сегмента показал аналогичный результат: новые и ранее выявленные РНК-изоляты из Крыма формировали три отдельные ветви Russia IV, Russia VI и Russia VII (рис. 2, см. https://mediasphera.ru/upload/medialibrary/files/Mol_genetika_2024_04_040_add.zip). Уровень отличия двух новых последовательностей из Крыма составил 15,3% для нуклеотидных и 1,0% для аминокислотных последовательностей, а уровень отличий с наиболее близкими ранее опубликованными штаммами TULV для пар изолятов Crimea/Ma772 от и Tula/175Ma/87 от M. arvalis из Центральной России — 10, 7% и 0,2%, Crimea/Ms2099 и LT18_KAL 13 от M. arvalis из Литвы — 11,7% и 0,3% соответственно.

Анализ вирусной последовательности, выявленной в образце от малой белозубки, показал, что новый РНК-изолят значительно отличается от всех ранее известных хантавирусов и, вероятно, принадлежит к ранее неизвестному виду хантавирусов, так как отличие от наиболее близких хантавирусов составляло 24,2% для нуклеотидных и 14% для аминокислотных последовательностей. Причем наиболее близкими (различие 24,2—26,9%) были хантавирусы Tangania (TGNV), Bowe (BOWV), Azagny (AZGV) и Jeju (JJUV), обнаруженные ранее среди других видов подсемейства Crocidurinae в Африке и Азии [15—18]. Для доказательства того, что выявлен новый вид, необходимо в дальнейшем получить и проанализировать полноразмерные последовательности всех трех сегментов генома. Поскольку вирус был обнаружен у малой белозубки, отловленной в Ленинском районе рядом с урочищем Артезиан, предполагаемый новый вид хантавируса назван нами вирусом Artesian (ATSV), согласно традиции присвоения наименования по месту географического выявления.

Полученные данные показали, что эволюционная история хантавирусов, ассоциированных с белозубками рода Crocidura, соответствует гипотезе ко-эволюции вируса и его природного хозяина. Разные виды белозубок из удаленных регионов мира являются носителями разных видов хантавирусов, формирующих на филогенетическом дереве общую кладу. На африканском континенте белозубка Терезы (C. theresae) является природным хозяином вируса TGNV, белозубка Дуцета (C. douceti) — вируса BOWV, скрытная белозубка (C. obscurior) — вируса AZGV, на евроазиатском континенте, в Корее, у азиатской малой белозубки (C. shantungensis) обнаружен вирус JJUV. Ранее неисследованный в отношении хантавирусов вид, C. suaveolens, является носителем предполагаемого нового вида хантавирусов, ATSV, и на филогенетическом дереве группируется совместно с вирусами из Африки. Малая белозубка является одним из доминирующих видов степной зоны Крыма, занимающей 70% его территории [7]. В этой зоне антиген хантавируса ранее регистрировали среди малых белозубок, общественных полевок, домовых и степных мышей. Новый РНК-изолят ATSV обнаружен в Ленинском районе, относящемся к степной зоне.

В этом же районе выявлен новый РНК-изолят TULV от еще одного из доминантных видов степной зоны, общественной полевки. Ранее показано, что эволюционная история TULV, ассоциированного с полевками рода Microtus, является более сложной и различные генетические варианты в кладе TULV могут группироваться по географическому принципу, а совместно обитающие виды полевок рода Microtus могут быть инфицированы одним вариантом вируса [19]. Выявленные в Крыму РНК-изоляты TULV представляют три различных генетических варианта. Можно предполагать, что современная фауна Крыма сформирована в результате заселения территории несколькими миграционными потоками полевок, а выявленные варианты TULV ассоциированы с отдельными потоками животных. Филогенетические взаимосвязи хантавируса, выявленного у общественных полевок, можно изучать только в сравнении с вариантами TULV, обнаруженными у других видов Microtus, так как ранее хантавирусы в этом виде не исследованы. Как показали наши данные, TULV от M. socialis генетически наиболее близок хантавирусам от других видов полевок из географически близких регионов: Крыма, Литвы и Центральной России. Для двух других вариантов вируса TULV от M. arvalis формы obscurus из Крыма для сравнения доступны последовательности генома изолятов именно от этого вида полевок из географически удаленных Казахстана, Турции и Китая [20—22]. На филогенетических деревьях варианты вируса от M. arvalis формы obscurus из Крыма и этих регионов формируют отдельные ветви, подтверждая как географический принцип формирования вариантов вируса, так и связь с потоками колонизации территории Евразии полевками рода Microtus.

Заключение

Значение выявленных хантавирусов в патологии человека не исследовано, однако их патогенный потенциал можно прогнозировать на основе имеющихся в литературе данных. Так, для одного из вирусов, вируса BOWV, ассоциированного с близкородственным видом белозубок (C. douceti), получено серологическое доказательство инфицирования этим вирусом людей в Габоне и Коте-де-Авуар [23]. Поэтому мы можем предполагать, что филогенетически родственный вирус ATSV, выявленный у другого вида белозубки (C. suaveolens), также может инфицировать человека. Для второго выявленного вируса, TULV, в ряде европейских стран получено как серологическое, так и генетическое подтверждение патогенности для человека вируса от полевок M. arvalis [23]. Поэтому выявленные варианты TULV от других видов полевок, M. arvalis формы obscurus и M. socialis, потенциально также могут инфицировать людей. Нельзя исключить, что возбудителем ГЛПС в Республике Крым является пока неидентифицированный вирус от степных мышей, либо все три вируса, что требует дальнейших исследований.

Финансирование. Исследование выполнено за счет Государственного бюджета.

Funding. The research was funded by the state budget.

Соблюдение этических стандартов. Исследование выполнено в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ Министерства высшего и среднего образования №742 от 13.11.1984), а также Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS №123, 18 марта 1986 г.). В исследовании не использовались исчезающие или охраняемые виды.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.