Введение

Туберкулез легких — инфекционное заболевание, вызываемое Mycobacterium tuberculosis complex и передающееся в основном воздушно-капельным путем, развитие которого у инфицированных людей ассоциировано с наличием неблагоприятных факторов риска [1, 2]. Известно, что заболеваемость туберкулезом повышается в периоды военных действий, за счет возрастания неблагоприятных условий окружающей среды, психоэмоциональной стрессовой нагрузки, скученности коллективов [3]. В настоящее время с учетом проведения Российской Федерацией специальной военной операции, в число участников которой входят лица, вышедшие из мест лишения свободы с высоким риском по латентной туберкулезной инфекции, а также большого числа гражданского населения новых регионов, проживающих в неблагоприятных социально-экономических условиях, актуальным является развитие методов экспресс-диагностики туберкулеза, доступных для применения в полевых условиях. Существуют экспериментальные свидетельства значительного влияния туберкулеза на метаболизм и газообмен в легких больного человека [4, 5]. Многие продукты метаболизма представляют собой небольшие молекулы, поэтому анализ содержания летучих органических соединений (ЛОС) в выдыхаемом воздухе имеет высокий потенциал для экспресс-диагностики туберкулеза легких [6]. Анализ выдыхаемого воздуха — это безболезненный и неинвазивный тест, идеальный для диагностики детей и пациентов в критическом состоянии [7, 8], а также за пределами специализированных лабораторий. Простота сбора и анализа позволяют проводить не только первичную экспресс-диагностику, но и периодический контроль, направленный на определение клинического прогрессирования болезни или ответа на лечение [9, 10]. Возможны два подхода к анализу ЛОС для диагностических или прогностических целей. С одной стороны, можно идентифицировать и количественно оценивать содержание конкретных ЛОС, вырабатываемых больным человеком и/или Mycobacterium tuberculosis (M.tb) в его организме [11, 12], используя комбинацию методов газовой хроматографии и масс-спектроскопии (ГХ-МС). На сегодняшний день большинство исследований по установлению связи между ЛОС и различными инфекциями, включая туберкулез, проводят с помощью ГХ-МС [13, 14, 15]. Методы ГХ-МС сверхчувствительны, воспроизводимы и признаны «золотым стандартом» тестов на содержание ЛОС в выдыхаемом воздухе, однако их применение ограничено технической сложностью, требующей высококвалифицированного персонала, высокой стоимостью и необходимостью предварительной подготовки образцов. Кроме того, технология ГХ-МС все еще не является мобильной и не позволяет выполнять анализ в реальном времени, поэтому неприменима в полевых условиях [16]. Альтернативно анализ ЛОС может быть направлен на идентификацию и классификацию уникального сигнала, полученного при воздействии сложной смеси ЛОС на массивы полуселективных датчиков, называемых «электронными носами» [17, 18, 19]. Массив откликов такого набора датчиков представляет собой уникальный «отпечаток дыхания», чья классификация не требует идентификации отдельных соединений в его составе. Применение алгоритмов распознавания образов, машинного обучения на основе различных алгоритмов, в т.ч. нейросетей, позволяет сформировать классификатор и сортировать данные по классам, отличая относящиеся к конкретным заболеваниям [20, 21]. Представлен ряд публикаций о применениях «электронного носа» для диагностики туберкулеза или оценки эффективности его лечения. Так, показано, что проводящий полимерный массив может быть использован для обнаружения M.tb в образцах мокроты [22]. Успешно использованы датчики из золотых наночастиц, покрытых органическим материалом, для диагностики Mycobacterium bovis у крупного рогатого скота [23]. «Электронный нос» на основе металлопорфириновых сенсоров был применен для диагностики легочного туберкулеза у людей и оценки ответа на лечение [10]. Предпринята попытка дифференциальной диагностики туберкулеза / внебольничной пневмонии по спектрам поглощения лазерного оптико-акустического газоанализатора [24]. Основным недостатком большинства описанных «электронных носов» является невозможность их промышленного производства, связанная с трудностями масштабирования используемых в их составе газовых сенсоров.

Целью нашей работы являлась оценка возможности дифференциальной экспресс-диагностики туберкулеза легких по составу выдыхаемого воздуха с использованием портативного устройства класса «электронный нос» на основе массива коммерческих металлооксидных сенсоров, дополненных датчиками температуры и влажности, у взрослых и детей, в т.ч. с отягощенным анамнезом.

Материал и методы

Исследование проводили на базе БУЗ ВО «Вологодский областной противотуберкулезный диспансер» с июня по сентябрь 2023 г., включив в него участников, различных по полу, возрасту (в т.ч. детей), привычке к курению, наличию хронических заболеваний, способных влиять на состав выдыхаемого воздуха (табл. 1). В число участников с установленным диагнозом туберкулеза вошли 55 человек, в т.ч. 37 человек МБТ+ (с выделением M.tb) и 18 человек МБТ– (без выделения M.tb), а также 6 человек с излеченным туберкулезом более 3 лет назад (3 человека) или менее 3 лет назад (3 человека). В число здоровых участников вошли 43 человека, в т.ч. 22 человека без подтвержденного контакта с больными туберкулезом и 6 человек, работающие в контакте с больными (сотрудники БУЗ ВО «ВОПД»), а также 10 человек без контакта с больными, но с сопутствующими заболеваниями дыхательной системы: астмой (2 человека), ХОБЛ, саркоидозом (по 1 человеку), нетуберкулезным микобактериозом (НТМБ) (5 человек), раком легких (1 человек). В исследовании участвовали 45 некурящих людей (из них 35 здоровых и 10 больных туберкулезом), а также 53 курящих с различной интенсивностью (из них 9 здоровых и 44 больных). Помимо вышеперечисленных признаков регистрировали наличие сопутствующих хронических заболеваний, не связанных с дыхательной системой: это артериальная гипертензия, атеросклероз сосудов, ВИЧ-инфекция, рак пищевода, эпилепсия, вирусный гепатит С, железодефицитная анемия, гипертоническая болезнь, хронический гастрит и др. (всего 27 человек). Всего было собрано 392 набора данных (98 человек в возрасте 11—92 лет, по 4 выдоха каждый), представляющих отклики массива сенсоров на образцы выдыхаемого воздуха участников исследования, которые в итоге были разделены на непересекающиеся обучающую и тестовую выборки.

Таблица 1. Состав участников исследования

Сбор образцов выдыхаемого воздуха осуществляли при помощи разработанного нами портативного устройства «электронный нос» на основе массива из 8 металлооксидных сенсоров и датчиков температуры и влажности (рис. 1а). Принцип работы «электронного носа» заключается в сборе выдыхаемого воздуха в газовую сенсорную ячейку, измерении откликов массива сенсоров с последующим автоматическим определением вероятности заболевания туберкулезом у человека путем анализа величины функции дискриминации согласно классификатору, предварительно полученному в результате машинного обучения системы на выборке заведомо здоровых и больных туберкулезом людей, с последующей очисткой системы путем ее продувки перед следующим тестом. Пневматическая часть устройства представлена на рис. 1б и состоит из разработанной сенсорной ячейки, трех электромагнитных клапанов, двух мембранных насосов, обратных клапанов, фторопластовых и полиэтиленовых трубок, а также быстроразъемных фитингов. Канал для прохождения воздуха на всем протяжении имеет диаметр не менее 8 мм для обеспечения малого сопротивления при выдохе. Реализованы следующие режимы работы устройства: через клапан V2 проводят продувку сенсорной ячейки после включения прибора для стабилизации базовой линии сенсоров, а также между испытаниями. Для продувки можно использовать как чистый воздух различной влажности, так и фильтрованный атмосферный воздух. Клапан V3 используется для забора анализируемой воздушной смеси: при открытом клапане V1 для анализа прямого выдоха в прибор, а при включенном мембранном насосе для анализа проб, собранных предварительно в пробоотборные мешки. Размеры всех элементов системы невелики, они помещены в корпус размером 230×300×110 мм (см. рис. 1а), индикация работы системы выведена на экран, а выбор режима работы происходит с помощью кнопок на передней панели.

Рис. 1. Внутреннее устройство прибора (а) и его пневматическая схема (б).

Для использования установки в качестве неиндивидуального оборудования медицинского назначения реализован сбор образцов выдохов через индивидуальный стерильный антибактериальный фильтр, присоединенный к прибору полиэтиленовой трубкой через специальный переходник. Использование стандартных фильтров для аппаратов ИВЛ, чья антивирусная и антибактериальная эффективность составляет более 99,999%, позволяет предотвратить контаминацию сенсорной ячейки патогенами, которые могут содержаться в составе выдыхаемого воздуха. Для сбора образца выдыхаемого воздуха пациент делает глубокий вдох и при одновременном включении кнопки «ВЫДОХ» на приборе совершает один плавный продолжительный выдох, в течение 5 с, через индивидуальный фильтр без дополнительного вдоха. Апробирование методики на большом количестве участников показало, что предложенный алгоритм оптимален и не вызывают сложностей у людей разных возрастов и состояний. После каждого пациента воздухозаборную трубку и корпус прибора обрабатывали дезинфицирующим средством, рекомендованным Роспотребнадзором («Альфадез», «Хлорми-септ»), а также заменяли фильтр для предотвращения попадания патогенов и микрочастиц слюны внутрь газоаналитической системы. Для обеспечения воспроизводимости результатов исследовали четыре последовательных выдоха, сделанных каждым пациентом напрямую в установку через индивидуальный фильтр и чередующихся с продувкой сенсорной ячейки атмосферным воздухом. Обнаружено, что первый выдох может отличаться от остальных, тогда как второй-четвертый выдохи показывали высокую сходимость значений откликов для каждого сенсора, поэтому обучение и тестирование обученной системы проводили по вторым выдохам с целью минимизации времени диагностики в дальнейшем. Один цикл измерений занимал 4 мин и состоял из выдоха (5 с), регистрации сенсорного отклика (55 с), продувки системы (1 мин) и релаксации сенсоров (2 мин). В режиме слепого тестирования сравнение машиной полученных данных с данными классификатора, сформированного в процессе обучения, занимает несколько миллисекунд, поэтому анализ второго выдоха обеспечивает диагностический результат через 5 мин после начала измерений, а общее время обследования пациента составляет 8 мин с учетом продувки системы после второго выдоха.

Для формирования классификатора полученные данные были разделены на две неперекрывающиеся выборки: обучающую и тестовую. Для обеспечения максимального разнообразия участников, не болеющих туберкулезом, необходимого для достижения высоких результатов машинного обучения, в обучающую выборку были включены четыре категории людей, обозначенных при обучении здоровыми: 1) здоровые без подтвержденного контакта с туберкулезом (9 человек); 2) здоровые в постоянном контакте с бацилловыделителями (сотрудники БУЗ ВО «ВОПД», 6 человек), 3) участники с заболеваниями дыхательной системы (10 человек), 4) участники с излеченным туберкулезом (6 человек). Всего 31 человек, в т.ч. 9 курящих. Для консервативной оценки метода в слепом тесте в обучающую выборку были включены только участники с диагностированным туберкулезом и бацилловыделением на момент исследования — 37 человек, из них 30 курящих. В выборку для слепого теста были включены 12 здоровых участников без подтвержденного контакта с туберкулезом и 18 участников с диагностированным туберкулезом без бацилловыделения на момент исследования. Такой выбор участников позволил оценить чувствительность разработанного подхода для больных без бацилловыделения как имеющих меньшие изменения метаболизма по сравнению с бацилловыделителями, однако требующих проведения лечения, а также специфичность подхода при его использовании в здоровой популяции для определения числа ложноположительных (ЛП) результатов, потенциально требующих дополнительной диагностики. В качестве математического метода дискриминации данных в обучающей выборке был использован метод линейной регрессии, рассчитанные коэффициенты для обучающей выборки представлены в табл. 2. Расчетный коэффициент дискриминации составлял 0,54, однако наилучшую дискриминацию удалось обеспечить при его снижении до 0,4.

Таблица 2. Рассчитанные коэффициенты линейной регрессии

Результаты и обсуждение

Чувствительность и специфичность разработанного подхода при кросс-валидации обучающей выборки составили 84% (95% ДИ 75—93%) (6 ложноотрицательных (ЛО) результатов) и 71% (95% ДИ 59—83%) (9 ЛП результатов) соответственно. Для здоровых людей специфичность составила 87%, а для пациентов с сопутствующими заболеваниями — 56%. Чувствительность и специфичность разработанного подхода, достигнутые в слепом тесте, составили 83% (95% ДИ 73—93%) (3 ЛО результата) и 92% (95% ДИ 85—99%) (1 ЛП результат). В качестве графического метода анализа используемого бинарного классификатора использовали ROC-кривые для обучающей и тестовой выборок (рис. 2).

Рис. 2. Распределение плотности вероятности от величины значения дискриминирующей функции (а, в) и соответствующие ROC-кривые для прогнозирования туберкулеза по анализу выдыхаемого воздуха (б, г) для обучающей выборки (а, б) и слепого теста (в, г).

Хорошо видно, что для обеих выборок кривые лежат значительно выше диагонали, соответствующей случайному разбросу данных; т.е. предложенная модель работает. Оценку производительности модели проводили по площади под кривой (AUC), составившей 0,84 (95% ДИ 0,74—0,93) и 0,93 (95% ДИ 0,84—1,00) для обучающей и для тестовой выборок соответственно. Полученные значения приемлемы для практического применения модели. На рис. 3 приведено сравнение диаграмм размаха значений функции дискриминации для разных категорий участников: здоровых, с диагнозом туберкулеза с бацилловыделением (МБТ+) и без него (МБТ-), клинически излеченных, с НТМБ, астмой, ХОБЛ, саркоидозом и раком легких. Красной пунктирной линией отмечен установленный коэффициент дискриминации (КД). Хорошо видно, что почти все выдохи здоровых участников классифицируются правильно (лежат ниже КД), а выдохи больных с диагнозом туберкулеза МБТ+ и МБТ– лежат выше КД, причем среднее и медианное значения функции дискриминации для МБТ- пациентов снижаются, но остаются в зоне установленного туберкулеза (выше КД). Для клинически излеченных людей медианное значение лежит ниже КД, однако часть пациентов все-таки попадает в область туберкулеза.

Рис. 3. Диаграмма размаха значений функции дискриминации для разных категорий участников исследования.

Горизонтальной черной пунктирной линией отмечен установленный в исследовании коэффициент дискриминации, выше которого диагностический результат сформулирован как наличие туберкулеза. Серые сплошные и серые пунктирные линии соответствуют медианным и средним значениям коэффициента дискриминации для указанной группы соответственно.

Анализ пациентов без туберкулеза, но с сопутствующими диагнозами показал, что пациенты с ХОБЛ и саркоидозом попали в область здоровых по туберкулезу, а пациенты с раком легких, НТМБ и астмой в основном определились как больные туберкулезом. Малое количество таких пациентов не позволяет достоверно утверждать о схожести метаболизма данных заболеваний с туберкулезом, но означает, что созданная модель требует дальнейшей доработки для улучшения дифференциальной диагностики туберкулеза на фоне сопутствующих патологий, например оптимизации набора используемых сенсоров, а также большего числа пациентов с различными диагнозами в составе обучающей выборки. Детальный анализ правильной и ложной классификации, полученной для каждой категории участников, позволяет сделать ряд предположений. Среди здоровых участников без хронических заболеваний ЛП были протестированы 3 из 27 человек (11%), из них две женщины, 47 лет и 54 лет, сотрудники БУЗ ВО «ВОПД», работающие с бациллярными пациентами, и 1 мужчина 27 лет без контакта с туберкулезом, но с симптомами ОРВИ (кашель). Среди участников с бронхиальной астмой ЛП протестировалась пациентка с обострением на момент исследования, а отрицательно — пациентка в состоянии ремиссии. В группе участников с излеченным туберкулезом ЛП были протестированы 2 (33%) из 6 человек, в т.ч. женщина 44 лет и мужчина 34 лет с незначительными остаточными изменениями в легких. В группе пациентов с НТМБ положительно были протестированы 4 (67%) из 6 человек, все мужчины в возрасте от 60 до 82 лет, а отрицательно были протестированы 2 (33%) из 6 человек, женщины 67 лет и 68 лет. Эти результаты можно отнести как к ЛП, так и к ЛО, поскольку больные НТМБ хоть и не представляют опасности для окружающих, однако микробы НТМБ и МБТ очень похожи — оба вида кислотоустойчивы; схожи морфологически, с одинаковым типом гранулематозного воспаления в организме человека. При этом у протестированных отрицательно пациентов не было полостей распада в легких и сопутствующей легочной патологии, а у протестированных положительно наблюдались полости распада и сопутствующие заболевания: (вторичная ХОБЛ, рак легких), т.е. результат связан с распространенностью процесса в легких. Для больных с установленным туберкулезом, как МБТ+, так и МБТ–, наблюдалась связь между ЛО результатом и заболеванием, выявленным на начальной стадии, т.е. имеющим небольшую распространенность процесса и отсутствие полостей распада в легких. Из рис. 4 видно, что причиной ЛО результатов может быть обучение, проведенное без учета фактора курения.

Рис. 4. Диаграмма размаха значений функции дискриминации для разных категорий участников исследования, разделенных по привычке к курению.

Горизонтальной черной пунктирной линией отмечен коэффициент дискриминации, установленный в исследовании без учета разделения участников на курящих и некурящих, выше которого диагностический результат сформулирован как наличие туберкулеза. Серые сплошные и серые пунктирные линии соответствуют медианным и средним значениям коэффициента дискриминации для указанной группы соответственно.

К сожалению, разделить собранные данные на равновесные группы с учетом фактора курения не представлялось возможным, т.к. среди здоровых было всего 9 курящих из 43, а среди больных — всего 10 некурящих из 55, что соответствует общей наблюдаемой тенденции: процент курящих среди больных туберкулезом существенно выше, чем в среднем по популяции. При этом даже используя коэффициенты функции дискриминации, полученные в обучении без учета фактора курения, можно увидеть, что значения функции дискриминации в каждой из групп (здоровые, МБТ+ и МБТ–) выше для курящих, а в каждом из классов (курящие и некурящие) группы здоровых, участников МБТ+ и МБТ– различаются между собой. Различие увеличится, если при обучении разделить эти группы на классы по признаку курения.

Заключение

Продемонстрирована принципиальная возможность неинвазивной экспресс-диагностики туберкулеза как с бацилловыделением, так и без него по составу выдыхаемого воздуха за время, не превышающее 5 мин, в т.ч. в полевых условиях. Применение для диагностики портативного устройства «электронный нос» на основе массива из 8 металлооксидных сенсоров, дополненных датчиками температуры и влажности, при использовании разработанного алгоритма сбора выдоха и последующего автоматического анализа данных позволило достичь в слепом тесте чувствительности и специфичности 83% и 92% соответственно. Недостатком разработанного подхода остается плохая дифференциальная диагностика туберкулеза с другими заболеваниями легких (НТМБ, раком легких, астмой), что, вероятно, связано с малыми размерами обучающей выборки и неоптимальным набором сенсоров в составе прибора и требует проведения дальнейших исследований. Также необходим целенаправленный набор в исследование представительных групп здоровых и больных туберкулезом в классы курящих и некурящих с отдельным обучением системы для каждого класса и использованием при последующей диагностике функции дискриминации, полученной для класса, в который попадает тестируемый по признаку курения.

Работа выполнена в рамках совместного проекта ФГБУ «ЦСП» ФМБА России и ИСПМ РАН в части разработки и создания прототипа портативного «электронного носа» и в рамках темы госзадания (FFSM-2022-0001) в части сбора и анализа данных выдохов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.