Генетическое разнообразие ВИЧ-1 на территории Иркутской области

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) отличается значительной генетической вариабельностью, что связано с высокой скоростью размножения, большим размером вирусной популяции в организме инфицированного человека, особенностями работы ферментов, отвечающих за репликацию генома ВИЧ и рекомбинациями. В связи с этим ВИЧ представляет собой гетерогенную группу, в которой выделяют два типа вируса (эпидемически значимый ВИЧ-1 и относительно редкий ВИЧ-2), каждый из которых в свою очередь делится на группы и целый ряд субтипов, циркулирующих (CRF) и уникальных (URF) рекомбинантных форм [1, 2].

Распределение различных субтипов и вариантов в мире неоднородно. В Российской Федерации наибольшее распространение (до 85%) получил ВИЧ-1, генетический вариант IDU-А субтипа А1, в меньшей степени — субтип В, рекомбинант CRF03-АВ и некоторые другие [3].

Вопрос генетической вариабельности ВИЧ в последнее время приобретает все большее значение для практической медицины. С внедрением в арсенал диагностических средств новых молекулярно-генетических методов появилась возможность решения ряда прикладных задач. Клиницисты получили инструмент для научно обоснованного назначения и замены схем терапии ВИЧ-инфекции путем выявления мутаций лекарственной устойчивости в геноме вируса [3—5]. Дополнительные горизонты открылись перед эпидемиологами: данные филогенетического анализа первичной структуры геномов применяются при эпидемиологических расследованиях случаев передачи ВИЧ [6, 7]. Анализ циркуляции на определенной территории различных генетических вариантов ВИЧ позволяет устанавливать пути передачи вируса и идентифицировать группы риска, а также прогнозировать динамику эпидемии [8].

На сегодняшний день на территории Иркутской области зарегистрированы более 44 000 человек, инфицированных ВИЧ. Тем временем данные о генетическом разнообразии ВИЧ остаются довольно скудными. В источниках литературы имеются сведения о доминирующем положении в нашем регионе варианта IDU-А подтипа А1 ВИЧ-1, другие субтипы выявлены не были [9]. С 2006 г. началось применение высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ), которая как мощный эволюционный фактор должна была привести к появлению в популяции штаммов ВИЧ с мутациями лекарственной устойчивости. Однако долгое время данный вопрос оставался без должного внимания.

Цель исследования — оценить генетическое разнообразие ВИЧ на территории Иркутской области, провести анализ спектра мутаций лекарственной устойчивости.

В работе использована плазма крови от 65 ВИЧ-инфицированных лиц, находящихся на диспансерном наблюдении в Иркутском областном Центре СПИД, получавших лечение антиретровирусными препаратами на момент исследования, проживающих в различных населенных пунктах на территории Иркутской области. Причинами направления пациентов на определение молекулярно-генетического профиля вируса были признаки вирусологической неэффективности ВААРТ (отсутствие недетектируемой вирусной нагрузки после 6 мес ВААРТ, «всплески» вирусной нагрузки ВИЧ в процессе терапии после первичного подавления репликации вируса). Полученный клинический материал использовали с информированного согласия пациентов. Вирусная нагрузка в образцах составляла от 1000 до 150 000 копий РНК/мл, по данным определения с применением коммерческих тест-систем Real Time HIV-1 фирмы «Abbott», Cobas AmpliPrep/TaqMan HIV-1Test фирмы «Хоффман-ЛяРош», РеалБест РНК ВИЧ фирмы «Вектор-Бест» либо набора реагентов ВИЧ-Монитор-FRT фирмы «АмплиСенс».

Определение молекулярно-генетического профиля ВИЧ выполняли с помощью коммерческих тест-систем HIV-Resist-Seq фирмы «АмплиСенс» и ViroSeq HIV-1 («Abbott», США), предназначенных для анализа гена pol, кодирующего ферменты протеазу, обратную транскриптазу и интегразу. На первом этапе выполняли лизис вируса и очистку препарата с целью получения РНК ВИЧ. Далее проводили реакцию обратной транскрипции для получения комплементарной ДНК, а затем полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для накопления изучаемого фрагмента гена pol ВИЧ. Выполняли очистку ПЦР-продукта и реакцию циклического секвенирования с использованием меченых флюоресцентными красителями дидезоксинуклеотидов (ddNTP). После очистки продуктов секвенирования и денатурации их в формамиде проводили процедуру капиллярного электрофореза в полимере POP-7 для детекции нуклеотидной последовательности с помощью автоматического анализатора молекул ДНК ABI PRISM 3500.

Для определения субтипов ВИЧ-1 была выбрана референс-программа COMET HIV-½ (version 1.0, 26.03.2014) (http://comet.retrovirology.lu) [10, 11]. Для анализа мутаций и определения профиля резистентности использовали программу интерпретации мутаций лекарственной устойчивости HIVdb Program: Sequence Analysis (version 7.0, 27.02.2014), представленную на сайте Стэндфордского университета (http://hivdb.stanford.edu).

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета прикладных программ StatSoft Statistica (version 6.0) для персонального компьютера. Статистическую значимость различий данных оценивали по критерию χ2. Статистически значимыми принимали различия при p<0,05.

Анализ распространенности различных субтипов ВИЧ-1 на территории Иркутской области показал, что доминирующее положение занимает субтип А1 — 95,38%. Зарегистрированы также субтип B и рекомбинантная форма CRF02-AG, 1,54 и 3,08% соответственно (рис. 1), ранее не отмечавшиеся в нашем регионе [9]. По-видимому, они представляют собой заносы из других регионов РФ и мира, так как субтип B регулярно выявляется в западных регионах нашей страны, а CRF02-AG преимущественно распространен в странах Западной Африки и Центральной Азии [3, 4].

Анализ фармакорезистентности проводили у пациентов, принимавших антиретровирусные препараты (АРВП). Мутации лекарственной устойчивости были выявлены в образцах от 41 (63%) пациента. Из них в подавляющем большинстве (58,46%) случаев обнаружены мутации лекарственной устойчивости к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (НИОТ), в 35,38% — к ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (ННИОТ), в 10,77% — к ингибиторам протеазы (ИП) и в 3,08% случаев — к ингибиторам интегразы (ИИ) (рис. 2).

Такое распределение частот встречаемости мутаций лекарственной устойчивости, по всей видимости, связано с основными схемами терапии, применяемыми на территории Иркутской области. Относительная редкость встречаемости мутаций устойчивости к ИП связана с высоким генетическим барьером данных препаратов, а к ИИ — с крайней редкостью применения данной группы препаратов в схемах терапии. Высокая распространенность мутаций устойчивости к ННИОТ и частое сочетание фармакорезистентности одновременно к НИОТ и ННИОТ связаны с тем, что наиболее активно применялась схема терапии, содержащая два НИОТ и один ННИОТ, как правило, включающая ламивудин, азидотимидин и эфавиренз. Из этих трех препаратов два обладают низким генетическим барьером к формированию лекарственной устойчивости (ламивудин, эфавиренз) [12—14].

В исследованных образцах выявлено 7 различных профилей фармакорезистентности ВИЧ-1 (рис. 3). Мутации лекарственной устойчивости лишь к одной группе препаратов встречались достаточно редко (34,15%). Среди полирезистентных штаммов доминирует комбинация НИОТ + ННИОТ (48,78%), фармакорезистентность сразу к трем группам препаратов (ИП + НИОТ + ННИОТ) выявлена в 4,88% случаев.

Спектр и частота встречаемости различных мутаций лекарственной устойчивости в исследованных образцах представлены на рис. 4. Лидирующую позицию (63,79%) занимает мутация устойчивости к НИОТ M184V/I в гене обратной транскриптазы ВИЧ-1, значительно снижающая чувствительность к ламивудину и эмтрицитабину. Затем следуют три мутации резистентности к ННИОТ (эфавирензу и невирапину) — G190S/A/C (24,14%), K103N/S (15,52%), K101E (15,52%) — и одна мутация к НИОТ — L74V/I (18,97%), снижающая чувствительность к нетимидиновым аналогам нуклеозидов диданозину и, в меньшей степени, абакавиру. В двух образцах выявлены инсерции в позициях: E35 в гене протеазы (не является мутацией резистентности) и T69 в гене обратной транскриптазы (редкая мутация, обусловливающая высокий уровень устойчивости вируса к зидовудину, ставудину, диданозину, абакавиру и тенофовиру).

Полученные данные были сопоставлены с аналогичным исследованием, проведенным в Санкт-Петербургском центре по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями [4]. В результате статистического анализа были выявлены достоверные различия в распределении частоты встречаемости различных субтипов ВИЧ-1: χ2=34,12346; р<0,001 (табл. 1). Данный факт, скорее всего, связан с более высокой миграционной активностью и высокой плотностью населения в Западной части РФ, где в отличие от нашего региона постоянно регистрируется порядка восьми субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1.

В то же самое время не выявлено достоверных различий в характере распределения частоты встречаемости разных фармакорезистентных форм (χ2=0,229863; p=0,999), что свидетельствует о сходных схемах ВААРТ, применяемых в сравниваемых регионах (табл. 2).

На территории Иркутской области по-прежнему доминирует субтип А1 ВИЧ-1. В то же время в единичных случаях стали выявляться новые субтипы и циркулирующие рекомбинантные формы — субтип В и CRF02-AG, ранее не отмечавшиеся в нашем регионе, что, скорее всего, связано с повышением миграционной активности населения.

Среди пациентов, принимающих АРВП, мутации лекарственной устойчивости выявлены в 63% случаев, причем преобладают мутации к наиболее часто назначавшимся препаратам из групп НИОТ и ННИОТ. Устойчивость к ИП и ИИ отмечается достаточно редко, что свидетельствует об ограниченном применении данных групп препаратов в схемах терапии. Среди исследованных образцов преобладают полирезистентные штаммы с мутациями лекарственной устойчивости как минимум к двум группам препаратов.

Конфликт интересов отсутствует.

Источник финансирования проведения исследования: средства ГБУЗ ИОЦ СПИД.