Динамика и тип мутаций устойчивости Mycoplasma genitalium среди пациентов дерматовенерологического профиля Московского региона

Mycoplasma genitalium впервые выделена из уретры мужчин с негонококковым уретритом (НГУ) в начале 1980-х годов [1] и впоследствии была признана инфекцией, передаваемой половым путем (ИППП). M. Genitalium — чрезвычайно требовательный к культивированию микроорганизм, поэтому получение данных о его связи с генитальными синдромами стало возможным после разработки первого теста полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 1990-х гг. [2]. M. genitalium в настоящее время является общепризнанной причиной острого и хронического НГУ у мужчин [1]. Цервицит и воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ) являются клиническими проявлениями M. genitalium у женщин [3, 4]. Клиническое значение M. genitalium в развитии патологических процессов других локализаций, включая прямую кишку, остается предметом изучения. Частота выявления M. genitalium среди пациентов с ВИЧ-инфекцией выше, чем в общей популяции [5–7], однако особенности M. Genitalium-инфекции, сочетанной с ВИЧ, недостаточно изучены. Резистентность к противомикробным препаратам, включая формирование штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, делает лечение M. Genitalium-инфекции сложной проблемой. К настоящему времени установлена необходимость определения мутаций резистентности к антибактериальным препаратам у выявленных изолятов M. genitalium.

M. genitalium изначально обладает ограниченной чувствительностью к антимикробным препаратам из-за отсутствия клеточной стенки, содержащей пептидогликан [8]. Широко распространенные β-лактамные антибиотики (пенициллины, цефалоспорины, атипичные β-лактамы, ванкомицин и бацитрацин) относятся к ингибиторам клеточной стенки и оказывают бактерицидное действие на рост и размножение бактерий. Таким образом, варианты лечения M. genitalium в значительной степени ограничены группами антибиотиков, направленных на ингибирование синтеза белка или репликации ДНК, таких как макролиды, тетрациклины, кетолиды, стрептограмин и фторхинолоны расширенного спектра действия. Однако M. genitalium обладает способностью к быстрому формированию устойчивости к препаратам, применяемым для ее элиминации. Устойчивость M. genitalium к макролидам, наиболее часто применяемой группе противомикробных препаратов, происходит из-за мутаций в V домене 23S рибосомальной ДНК. Чаще всего мутации встречаются в позициях 2058 и 2059 (нумерация Escherichia coli). После однократного применения 1 г азитромицина резистентность к макролидам развивается в 12% случаев [9, 10]. В то же время расширенные схемы применения азитромицина реже приводят к формированию резистентности [9, 10]. Широкое использование азитромицина для лечения C. trachomatis, особенно в виде разовой дозы 1 г, привело к резкому росту устойчивости M. genitalium к макролидам и заметному снижению эффективности терапии [10]. Недавний метаанализ показал быстрый рост распространенности мутаций резистентности M. genitalium в мире к макролидам с 10 до 51% за период с 2010 по 2017 г. [11]. Частота детекции устойчивых штаммов M. genitalium среди мужчин, предпочитающих секс с мужчинами (МСМ), выше (69%), чем у гетеросексуальных мужчин (40%) [12], что, вероятно, отражает более широкое использование азитромицина в этой популяции для лечения ИППП.

Антибактериальная активность фторхинолонов связана с их ингибирующим воздействием на ДНК-гиразу (состоящую из двух GyrA- и двух GyrB-субъединиц), и топоизомеразу IV (состоящую из двух ParC- и двух ParE-субъединиц). Установлено, что мутации в определенном участке генов gyrA, gyrB, parC и parE QRDR (анг. Quinolone Resistance Determining Region) обусловливают формирование устойчивости возбудителя к действию антибактериальных препаратов группы фторхинолонов [4, 13, 14]. Моксифлоксацин зарекомендовал себя как высокоэффективный препарат в отношении макролидорезистентных штаммов M. genitalium, при этом его эффективность на первых этапах применения с 2003 г. достигала 100% [15]. Сведения о неудачах лечения моксифлоксацином стали появляться в 2008 г. [16], данные метаанализа продемонстрировали снижение эффективности терапии со 100 до 89% [17]. Появление изолятов, устойчивых одновременно к макролидам и фторхинолонам, создает серьезные проблемы в лечении M. genitalium-инфекции, по данным исследований [13], на их долю приходится 3% в мире и 7% в странах Тихоокеанского региона.

В России исследования, посвященные оценке распространенности мутантных штаммов M. genitalium, немногочисленны, что, возможно, связано с отсутствием методов определения устойчивости M. genitalium к макролидам и фторхинолонам. В отечественной литературе публикации, посвященные изучению частоты обнаружения резистентных штаммов M. genitalium, единичны [4, 18]. Так, при изучении распространенности мутантных штаммов M. genitalium в 4 городах России и в Эстонии в 2013–2016 гг. мутации резистентности к макролидам обнаружены в 4,6% образцов из России (0,7–6,8% в разных городах) и в 10% образцов из Эстонии. Частота мутаций M. genitalium, связанных с резистентностью к фторхинолонам, составила 6,2% в России (2,5–7,6% в разных городах) и 5% в Эстонии. Около 1% образцов в обеих странах содержали мутации как к макролидам, так и к фторхинолонам [4, 19].

Цель исследования — изучить динамику и тип мутаций устойчивости Mycoplasma genitalium среди пациентов дерматовенерологического профиля Московского региона.

Объектом проведенного исследования явились 645 изолятов M. genitalium-инфекции, полученных от пациентов (86,6% мужчин, 13,4% женщин, возраст пациентов от 18 до 75 лет), обратившихся за медицинской помощью в филиалы МНПЦДК. Сбор материала проводили в течение 2014–2018 гг. Критерием включения больных в исследование являлся положительный результат ПЦР на M. genitalium. В дальнейшем проведен ретроспективный анализ амбулаторных карт 454 пациентов с M. genitalium-инфекцией для оценки клинического значения феномена резистентности к макролидам и фторхинолонам.

Рутинное лабораторное исследование для выявления ДНК M. genitalium проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием набора реагентов АмплиСенс Mycoplasmagenitalium-FL производства ФБУН Эпидемиологии Роспотребнадзора по ТУ 9398-042-01897593–2009 №ФСР 2007/00580 согласно инструкции производителя [20]. Биологический материал для исследований получали у женщин из цервикального канала и/или, влагалища, у мужчин — из уретры или исследовали первую порцию мочи.

Для выявления мутаций устойчивости к фторхинолонам проводили амплификацию QRDR гена parC M. genitalium с 164 по 483 нуклеотид с использованием прямого праймера MG-PARC-A и обратного праймера MG-PARC-B [21]. Для выявления мутаций устойчивости к макролидам проводили амплификацию участка V домена гена 23S рДНК, ограниченного прямым праймером 23S-1992F и обратным праймером 23S-2138R [22, 23].

Определение и анализ первичной нуклеотидной последовательности полученных продуктов амплификации на предмет мутаций устойчивости к антибиотикам проводили с использованием набора реагентов BigDye Terminator v3.1 Cycle sequence Kit («Applied Biosystem», США) на анализаторе ABI 3030 («Applied Biosystem», США) в соответствии с прилагаемой инструкцией к набору реагентов и оборудованию. Статистическая обработка полученных данных выполнена с использованием программ Statistica 8.0. и MS OfficeExcel 2010.

В процессе научной работы исследованы образцы биологического материала из органов мочеполовой системы 645 пациентов с M. genitalium-инфекцией. За весь период наблюдения (2014–2018 гг.) количество мутантных штаммов, определяющих резистентность к макролидам, составило 48 (48/645=7,4%), к фторхинолонам — 63 (63/645=9,8%).

Распространенность и характер мутаций M. genitalium к макролидам и фторхинолонам в Московском регионе за период 2014–2018 гг. представлены в таблице [4, 20].

Тип мутаций M.genitalium и распространенность в московском регионе в 2014–2018 гг.

Как видно из таблицы, с 2014 по 2018 г. число штаммов M. genitalium, содержащих мутации к макролидам, возросло с 6,02 до 15,69%, к фторхинолонам — с 7,14 до 13,73%. Преобладающим типом мутации M. genitalium к макролидам является A2059G, зарегистрированный в 24 (50%) из 48 случаев, на остальные 50% приходятся мутации А2058G, А2062G и А2062Т. Мутация D87N гена parC, определяющая устойчивость M. genitalium к фторхинолонам, выявлена в 21 (33,3%) из 63 случаев и является превалирующей.

Известно, что мутации M. genitalium могут развиваться вследствие ранее полученного или проводимого при выявлении M. genitalium лечения антибактериальными препаратами [24]. Для изучения точки зрения практикующих клиницистов по поводу терапии M. Genitalium-инфекции проведено анкетирование 69 врачей (67 дерматовенерологов и 2 уролога). Результаты анкетирования сопоставлены с реальной практикой лечения 454 пациентов с M. Genitalium-инфекцией, наблюдавшихся в филиалах МНПЦДК в период 2014–2018 гг.

По результатам анкетирования в качестве препарата первой линии для лечения M. genitalium-инфекции 52% специалистов указали доксициклин по 100 мг 2 раза в день 10 дней, 38% — джозамицин по 500 мг 3 раза в день 10 дней [40]. В качестве препарата второй линии — джозамицин (46%) или доксициклин (33%), третьей — азитромицин 1,0 г однократно (17,5%). В 9% случаев резервным лекарственным средством, по мнению анкетируемых, является моксифлоксацин. Подробный анализ результатов анкетирования врачей амбулаторного приема представлен в публикации 2018 г. [25].

Результаты изучения реальной практики лечения M. genitalium-инфекции получены при аудите амбулаторных карт 454 пациентов с M. genitalium-инфекцией, наблюдавшихся в филиалах МНПЦДК (см. рисунок).

Результаты анализа схем лечения пациентов с M.genitalium-инфекцией в Московском регионе.

Как видно из рисунка, в 37,7% случаев пациентам с M. genitalium-инфекцией назначали доксициклин и в 35,2% — джозамицин, что согласуется с Клиническими рекомендациями РОДВК [26], в которых данные препараты относятся к первой линии терапии M. genitalium-инфекции. Кроме указанных лекарственных средств, врачи-специалисты при первичной детекции M. genitalium-инфекции назначали комбинации различных антибиотиков, не имеющих доказательств, полученных в клинических исследованиях высокого уровня и не соответствующих международным и отечественным рекомендациям.

Устойчивость M. genitalium к макролидам и фторхинолонам стремительно увеличивается в мире, что подтверждено результатами многочисленных научных исследований. Показатели резистентности к макролидам значительно варьируют в зависимости от региона. В странах Европы и США, где макролиды, а именно азитромицин, широко используют для терапии НГУ и других инфекционных заболеваний, резистентность M. genitalium стремительно увеличивается [27].

В Дании доля мутантных штаммов M. genitalium достигает 38% [28], в Нидерландах за 2014–2017 гг. зарегистрирован рост мутаций устойчивости к макролидам с 22,7 до 39,7% [29]. Доля мутантных штаммов в Австралии составляет 31% [30], по другим данным [31] — 63,6%, во Франции — 13,2% с ежегодным приростом на 10–15,4% [32], в Сингапуре — 25% [33]. В Бельгии оценили долю мутантных штаммов M. genitalium, устойчивых к макролидам среди женщин, занимающихся коммерческим сексом, и она составила 6,2% [4, 34].

В Дании, Швеции и Норвегии в 2016 г. в результате изучения устойчивости M. genitalium к моксифлоксацину и азитромицину установлено, что частота мутаций для азитромицина и моксифлоксацина составила 41,4% (17,7–56,6%) и 6,6% (4,1–10,2%) соответственно [4]. В этих странах также обнаружены мультирезистентные штаммы M. genitalium (2,7%, 1,1–4,2%) [4, 35].

Устойчивость к макролидам и фторхинолонам в Канаде составляет 58 и 20% соответственно [4, 36]. В Англии резистентность M. genitalium к макролидам достигает 82,4%, к фторхинолонам — 4,9% [4, 37]. В Испании выявлена устойчивость в 35% случаев к макролидам и 8% случаев к препаратам из группы фторхинолонов [38]. В США среди M. genitalium-положительных образцов в 64,4% случаев выявлены мутации устойчивости к макролидам, в 11,5% случаев — мутации в гене parC, связанные с резистентностью к фторхинолонам [39]. В Гуанчжоу (Китай) в 66,4, 0,7 и 77,7% M. genitalium-положительных образцов обнаружены мутации в генах 23S рРНК, gyrA и parC соответственно [40].

В Московском регионе, исходя из результатов проведенного нами исследования, резистентность M. genitalium к макролидам и фторхинолонам за период 2014–2018 гг. составила 6,02–15,69 и 7,14–13,73% соответственно, т.е. частота выявления штаммов M. genitalium, содержащих мутации устойчивости к антибиотикам, в Москве значительно ниже по сравнению с общемировыми показателями.

Более низкая по сравнению с другими странами частота выявления мутаций M. genitalium к макролидам и фторхинолонам в Московском регионе, возможно, связана с практикой назначения в нашей стране преимущественно джозамицина, а не азитромицина в однократной дозе, как в странах Европы и США, а также с использованием фторхинолонов в качестве препаратов резерва. В то же время, исходя из полученных данных, в Московском регионе мутации устойчивости к фторхинолонам превалируют над таковыми к макролидам. Возможно, это связано с тем, что в данном научном исследовании соотношение мужчины:женщины составляло 6,4:1, т.е. превалировали мужчины, среди которых у 59% в анамнезе отмечены указания на лечение различными фторхинолонами урологических заболеваний (в частности, простатита), при этом ни в одном случае (как следует из анамнеза) не проводились исследования на M. genitalium (впервые M. genitalium выявлены в настоящем исследовании).

Наиболее часто встречаемыми типами мутации M. genitalium к макролидам в Европе являются A2058G и A2059G [41]. Так, исследование M. Unemo и соавт. (2018) показывает, что мутация гена 23S рДНК A2059G была преобладающей в Дании (53,5%) и Норвегии (59,6%), тогда как A2058G чаще встречалась в Швеции (50,0%) [35]. В нашем исследовании также превалирует мутация M. genitalium в позиции A2059G (50%). Помимо этого, в Московском регионе выявлена мутация A2062G, впервые описанная A. Guschin и соавт. в 2015 г. [42] и не зарегистрированная в странах Европы. По данным литературы, мутация S83I гена parC M. genitalium, определяющая устойчивость к фторхинолонам, преобладает во многих странах [43, 44]. В настоящем исследовании превалирующей мутация D87N (33,3%).

Дальнейшая часть исследования посвящена сопоставлению практики лечения M. genitalium-инфекции в Московском регионе по сравнению с международными руководствами по ведению пациентов.

Так, джозамицин врачи Московского региона назначали для лечения M. genitalium-инфекции в 35,2% случаях, при этом эффективность терапии составила 74,7%. В отечественном исследовании 2016 г. эффективность джозамицина (500 мг 3 раза в сутки в течение 10 дней) при лечении M. genitalium-инфекции у мужчин с уретритом составила 93,5% [4, 42]. Как указано выше, частота штаммов M. genitalium, содержащих мутации устойчивости к макролидам (A2058G, A2059G, A2062G и A2062T), по нашим данным, возросла за 2014–2018 гг. с 6,02 до 15,69%, чем отчасти возможно объяснить снижение эффективности лечения M. genitalium-инфекции джозамицином.

Азитромицин 1 г однократно и в курсовой схеме (500 мг первый день, далее 250 мг 4 дня) специалисты Московского региона назначали в единичных случаях, что не позволяет достоверно оценить эффективность данного препарата. В ранних зарубежных публикациях сообщалось о частоте излечения M. genitalium-инфекции при назначении азитромицина в однократной дозе 1 г, которая составила 85%, но дальнейшие исследования продемонстрировали снижение показателя эффективности терапии данного подхода в различных регионах мира [45–47]. В исследовании L.E. Manhart и соавт. (2013) достигнуто излечение однократной дозой азитромицина лишь у 40% пациентов по сравнению с 30% в группе больных, получавших доксициклин [47, 48]. По результатам исследования J. Twin и соавт. (2012 г.) установлено снижение эффективности лечения M. genitalium при приеме 1 г азитромицина однократно с 84% (2005–2007 гг.) до 69% (2007–2009 гг.) [47, 49]. В Гренландии, где распространена хламидийная инфекция, для лечения которой используется 1 г азитромицина однократно, зарегистрировано 100% изолятов M. genitalium, устойчивых к макролидам [27, 47]. В исследовании P. Horner и соавт. (2014 г.) сделан вывод о том, что однократный режим приема азитромицина индуцирует устойчивость M. genitalium к препаратам из группы макролидов [47, 50].

Доксициклин по назначению врачей Московского региона получили 37,7% пациентов с M. genitalium-инфекцией, при этом элиминация M. genitalium достигнута лишь у 42% пациентов, что согласуется с общемировыми данными.

В мире первые многочисленные сообщения о снижении эффективности доксициклина в отношении M. genitalium-инфекции стали появляться начиная с 2003 г., при этом вопрос о механизмах устойчивости M. genitalium к доксициклину остается предметом изучения до настоящего времени.

В Европейском руководстве по ведению пациентов с M. genitalium-инфекцией (2016 г.) указано, что уровень эффективности доксициклина не превышает 30% [4, 51]. В данном руководстве доксициклину в лечении M. genitalium-инфекции отводится место лишь среди препаратов третьей линии и только в тех клинических ситуациях, когда оказались неэффективны препараты первой и второй линий (макролиды и фторхинолоны).

Моксифлоксацин, который, согласно Европейским рекомендациям, относится к препаратам второй линии для лечения M. genitalium-инфекции, врачи Московского региона назначали в 1,3% случаев для лечения M. genitalium-инфекции (излечение достигнуто у 87% пациентов).

В отношении моксифлоксацина следует отметить, что препарат был высокоэффективен в отношении макролидорезистентных штаммов M. genitalium при первом применении в 2003 г. [15]. Метаанализ показал снижение эффективности лечения со 100% в исследованиях, проведенных до 2010 г., до 89% в более поздних исследованиях [17]. В Японии моксифлоксацин не рекомендован для лечения генитальных инфекций, поэтому в терапии M. genitalium-инфекции используется ситафлоксацин, продемонстрировавший высокую эффективность в элиминации резистентных штаммов M. genitalium, несущих мономутации parC [20]. Однако лечение на основе ситафлоксацина может быть не столь эффективным при выявлении штаммов, совместно содержащих мутации в генах parC и gyrA M. genitalium [43].

В отношении других фторхинолонов (левофлоксацин, офлоксацин), которые врачи Московского региона назначали в 1,7% случаях, современная научная литература отмечает их низкую эффективность при лечении M. genitalium-инфекции [24]. Кроме того, в инструкции по применению этих препаратов отсутствуют указания о возможности применения их при M. genitalium-инфекции.

Полученные данные свидетельствует о необходимости мониторинга практики оказания медицинской помощи пациентам с M. genitalium-инфекциям в Московском регионе и проведения организационно-методических мероприятий по стандартизации методов ведения больных в соответствии с качественными клиническими исследованиями, проведенными на базе доказательной медицины.

Таким образом, при анализе результатов мониторинга резистентности M. genitalium в Московском регионе в 2014-2018 гг. констатирован рост частоты выявления мутантных штаммов M. genitalium к макролидам в 2,6 раза, к фторхинолонам в 1,9 раза [20]. Изложенное свидетельствует о необходимости внедрения в России подходов детекции M. genitalium с одновременным определением мутаций устойчивости к макролидам и фторхинолонам, что позволит выбрать оптимальную схему лечения и повысить эффективность лечения M. genitalium-инфекции.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Гущин А.Е., Кисина В.И.

Сбор и обработка материала: Романова И.В., Гущин А.Е.

Статистическая обработка данных: Романова И.В.

Написание текста: Романова И.В., Кисина В.И., Гущин А.Е.

Редактирование: Кисина В.И., Гущин А.Е.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors’ contributions:

The concept and design of the study: Kisina V.I., Guschin A.E.

Collecting and interpreting the data: Romanova I.V., Guschin A.E.

Statistical analysis: Romanova I.V., Guschin A.E.

Drafting the manuscript: Kisina V.I., Romanova I.V., Guschin A.E.

Revising the manuscript: Kisina V.I., Guschin A.E.