Болезни, вызванные вирусом папилломы человека (ВПЧ), являются проблемой мирового масштаба, и, по мнению многих специалистов, негласно называются «бесшумной эпидемией» XXI века [1]. ВПЧ получает все большее распространение в мире: по данным ВОЗ, ежегодно диагностируют около 2,5—3 млн случаев [2—4]. Во многих индустриально развитых странах распространенность ВПЧ-инфекции среди населения составляет 40—80%, а вероятность персистенции ВПЧ — 80—90% [5]. На сегодняшний день медицине известно более 600 видов ВПЧ. Различные виды папилломавирусной инфекции (ПВИ) могут вызывать как доброкачественные опухоли кожи и слизистых оболочек, так и злокачественные новообразования (ЗНО) при дальнейшем развитии заболевания [5, 6]. Доброкачественные новообразования зачастую трудно поддаются лечению. Они постоянно рецидивируют в очаге первичного поражения, либо распространяются на незараженные участки кожи и слизистых даже при грамотно подобранной терапии [5]. Существенное влияние на разработку методов и способов лечения доброкачественных образований кожи и слизистых оболочек, вызванных ВПЧ, может оказать понимание эпигенетических механизмов формирования и развития болезни.

Эпигенетика — наука о наследуемых свойствах организма, которые опосредованно закодированы в геноме и не связаны с изменением собственно нуклеотидной последовательности ДНК. К значимым механизмам эпигенетики относят: метилирование ДНК, геномные перестройки, модификации гистонов, малые некодирующие РНК и т. д. [7]. К настоящему времени исследовано множество генов в опухолевых тканях, эпигенетические повреждения которых приводят к их инактивации [8—11].

Одним из важнейших механизмов эпигенетической регуляции является метилирование промоторов генов. Данный процесс сопровождается ковалентным переносом метильной группы (CH3-) с S-аденозилметионина (SAM) на остаток цитозина, стоящий перед гуанином, в последовательности CpG-динуклеотида, и катализируется ферментом ДНК-метилтрансферазой. Метилированию подвергается только одно основание ДНК — цитозин в позиции N5 пиримидинового кольца [7].

В геноме CpG-динуклеотиды находятся в виде одиночных динуклеотидов или CpG-островков. CpG-островки — это участки высокой плотности CpG. Они обнаруживаются в промоторе 60% генов и в нормальных тканях обычно не метилированы, за небольшим исключением. Присоединение метильной группы к цитозину (с образованием метилцитозина) приводит к невозможности узнавания факторами транскрипции метилированной последовательности регуляторного участка, что сопровождается значительным снижением уровня, вплоть до полного отсутствия, транскрипции гена [7, 14].

Характер метилирования, устанавливающийся в ходе эмбрионального развития, оказывает влияние на регуляцию экспрессии тканеспецифичных генов, клеточной дифференцировки, инактивации Х-хро-мосомы, репликации ДНК, регуляции структуры хроматина, канцерогенеза и старения.

На данный момент во всем мире активно изучается роль уровня метилирования гена WIF1 (WNT-inhibitory factor-1) и его экспрессии в развитии опухолевых процессов. Выявлено, что гиперметилирование в промоторной части гена WIF1 является одним из важнейших механизмов образования, малигнизации и метастазирования многих опухолей. Фактор WIF1 — это белок, который блокирует активность Wnt-сигнального пути, непосредственно связываясь с главным участником этого пути — с Wnt-лигандом. У человека Wnt-лиганды представлены 19 белками. В норме Wnt-сигнальный путь регулирует пролиферацию и дифференцировку клеток, поддержание популяции стволовых клеток, а также участвует в организации цитоскелета и клеточной подвижности. Гиперметилирование в промоторной части гена приводит к снижению уровня экспрессии гена WIF1 и дефициту фактора WIF1. Таким образом, Wnt-сигнальный путь становится неконтролируемым, что ведет к нарушению процесса клеточного деления и созревания и приводит к образованию опухоли [6—14].

Известно, что в ткани здоровой кожи Wnt-сигнальный путь активируется при повреждении кожного покрова и является необходимым для заживления ран, восстановления целостности кожи, а также для поддержания гомеостаза организма в целом. В ходе исследования экспрессии генов Wnt-лигандов в различные промежутки времени после нанесения раны было показано, что одним из первых начинает экспрессироваться Wnt4, в то время как максимум активности транскрипции генов Wnt5a и Wnt11 приходится на период ремоделирования раны [15, 16]. В экспериментах на трансгенных мышах показано, что активность канонического Wnt-сигнального пути увеличена в волосяных фолликулах, примыкающих к месту повреждения, но не в самой ране. Обработка повреждения ретровирусным вектором, содержащим ген лиганда Wnt5a, приводит даже к более эффективному образованию кожных придатков в пределах раны [15].

Цель настоящего исследования — изучение статуса метилирования гена WIF1 в тканях доброкачественных образований кожи и слизистых, вызванных вирусом папилломы человека, в сравнении со здоровой кожей. В группу исследования вошли такие образования кожи, как себорейные кератомы, актинические кератомы, вульгарные бородавки, подошвенные бородавки, акрохордоны, остороконечные кондиломы, фибропапилломы.

Образцы ткани. В проспективном исследовании были проанализированы 32 образца биоптатов доброкачественных кожных опухолей, полученные в результате бритвенной биопсии у пациентов в возрасте от 16 до 67 лет. В группу исследования вошли больные с доброкачественными образованиями кожи, вызванными ВПЧ, такими как себорейные кератомы, актинические кератомы, вульгарные бородавки, подошвенные бородавки, акрохордоны, остроконечные кондиломы, фибропапилломы. Диагноз устанавливали на основании данных анамнеза, клинической картины, результатов дерматоскопии и гистологических исследований.

Основные характеристики исследуемых образцов ткани представлены в табл. 1.

Выделение ДНК. Полученные образцы тканей были измельчены на кусочки по 2 мг, которые затем подвергались лизису с целью выделения ДНК и переводу неметилированных остатков цитозина в тимин при сохранении неизменными метилированных остатков цитозина (бисульфитной конверсии). Для достижения данной цели был использован набор innuCONVERT Bisulfite All-In-One Kit («Analytik Jena», Германия). Все действия выполнялись согласно протоколу производителя.

Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР). 50 нг бисульфит-конвертированной ДНК отбирали для последующей «тачдаун» ПЦР-амплификации с использованием полимеразной смеси GoTaq HotStartGreenMasterMix («Promega», США) и праймеров для амплификации участков промоторов гена WIF1 от –554 до –140 нуклеотидов до старт-кодона, содержащих, помимо комплементарной последовательности, универсальную последовательность M13 на 5’-конце.

WIF1-M13F

5’-gttttcccagtcacgacGAGTGATGTTTTAGGGGTTT -3’

WIF1-M13R

5’-ggaacagctatgaccatgCCTAAATACCAAAAAACCTAC-3’

Секвенирование проводили в центре коллективного пользования ГЕНОМ на базе института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по стандартному протоколу с использованием прямых праймеров и набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1.

Статистический анализ результатов секвенирования проводили с использованием программного обеспечения DNA Sequencing Analysis Software версии 5.1 и ресурса QUMA: quantification tool for methylation analysis. Уровень ДНК-метилирования оценивали качественно (наличие/отсутствие). Положение сайтов метилирования отмечено числами, которые соответствуют положению цитозина в паре CpG, считая от начала синтезированного участка ДНК.

Результаты исследования образцов тканей на определение статуса метилирования приведены в табл. 2.

Как видно из представленных данных, в 32 исследуемых образцах доброкачественных образований кожи, вызванных ВПЧ, установлено гиперметилирование промотора гена WIF1. При этом количество сайтов, содержащих метилирование, находится в диапазоне от 7 до 20.

Многие исследователи высказали предположение, что гиперметилирование гена WIF1 приводит к образованию опухоли за счет снижения уровня экспрессии гена WIF1 и синтеза белка с последующей неконтролируемой активацией WNT-сигнального пути [15—19]. Данное предположение также подтверждается результатами работ, где было показано, что восстановление уровня экспрессии за счет деметилирования гена WIF1 приводит к выраженной опухолевой супрессии, уменьшению подвижности опухолевых клеток и снижению их инвазивного и метастатического потенциала [17—19].

Существует группа препаратов, способных деметилировать ген WIF1, такие как: флавоноид эпигаллокахетин-3-галлат (EGCG); индол-3-карбинол (I3C); 3,3’-дииндолилметан (DIM). Учитывая высокую вероятность влияния метилирования гена WIF1 на образование кожных опухолей, в том числе и ВПЧ-индуцированных, необходимо провести дальнейшие исследования, основанные на применении деметилирующих препаратов.

Назарова М.Н. — 0000−0002−2873−6496

Бабкина И.О. — 0000−0001−7695−5565

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.