Нарушения сигнального пути трансформирующего ростового фактора β (TGF-β) принято считать ключевыми молекулярными механизмами развития фиброза при склеродермии [1]. Известно, что TGF-β₁ повышает экспрессию генов, отвечающих за синтез коллагена I, III, VI, VII, X типов, фибронектина и протеогликанов и играет ключевую роль в активации фибробластов и повышенном отложении экстрацеллюлярного матрикса [2, 3]. В биоптатах кожи пациентов с очаговой склеродермией была выявлена повышенная реактивность TGF-β, а также отмечается повышенный синтез рецепторов к данному фактору [4, 5]. Транскрипционные факторы семейства AP-1 (activating protein 1) являются ключевыми сигнальными молекулами пути TGF-β и вовлечены в транскрипционную регуляцию большого количества генов клеточной пролиферации и синтеза компонентов внеклеточного матрикса, управляемых данным сигнальным каскадом [6].

Транскрипционный фактор (ATF) является одним из образующих компонентов транскрипционного комплекса AP-1, который вовлечен в регуляцию ряда важнейших процессов, таких как морфогенетическая клеточная пролиферация, дифференцировка, трансформация, апоптоз, в ответ на действие ряда внеклеточных факторов и разных сигнальных молекул, включая ростовые и паракринные факторы, цитокины, онкогены, опухолевые промоторы, химические канцерогены, пептидные гормоны, нейротрансмиттеры [7]. Ранее на биоинформационном уровне было показано участие генов семейства ATF, как компонентов транскрипционного комплекса АР-1 в патогенезе таких социально значимых заболеваний, как болезнь Крона и псориаз [8, 9]. Экспериментально показано участие данных генов в развитии псориатического и атеросклеротического процессов [10].

Установлено, что ATF-2 участвует в регуляции TGF-β-зависимой экспрессии генов синтеза компонентов межклеточного матрикса, при этом активация ATF-2 осуществляется двумя путями: прямым путем непосредственного связывания SMAD3 (mothers against decapentaplegic homolog 3) и путем фосфорилирования TGF-β-активированной киназой-1 (ТАК-1-киназой) [11]. Также в исследованиях на клетках карциномы молочной железы продемонстрировано, что экспрессия гена ATF-3 повышается под действием TGF-β₁. Данный транскрипционный фактор играет интегрирующую роль для TGF-β₁, усиливая экспрессию его таргетных генов. Кроме того, ATF-3 усиливает экспрессию самого TGF-β₁ по принципу положительной обратной связи для сигнального пути TGF-β₁. ATF-3 усиливает экспрессию гена TGF-β₁ напрямую, а также через усиление экспрессии генов интегринов αv и β6 — двух генов, вовлеченных в активацию TGF-β₁ [12].

Таким образом, представляется актуальным изучение экспрессии генов ATF, компонентов AP-1 транскрипционного комплекса при выраженном развитии склеродермических изменений. Данное исследование посвящено изучению роли генов семейства ATF в развитии склеродермии.

Забор биопсий осуществлялся у пациентов, проходивших лечение в консультативно-поликлиническом отделении Московского научно-практического центра дерматовенерологии и косметологии с установленным диагнозом «очаговая склеродермия». Возраст пациентов варьировал от 25 лет до 71 года. Диагноз «очаговая склеродермия» в каждом случае устанавливался клинически и был подтвержден результатами патоморфологического изучения биоптатов кожи. Согласно клинической классификации Tuffanelli и Winkelmann, у больных наблюдались следующие формы заболевания: бляшечная (7 человек: пациенты 1, 3—6, 8, 10) и генерализованная (3 человека). Диагностическими критериями генерализованной формы были бляшки, в диаметре превышающие 3 см, в количестве более 4 на 1 анатомическую область (3 человека: пациенты 2, 7 и 9) и/или вовлечение 2 и более анатомических областей (пациент 9). Диаметр очагов варьировал от 2 см до 40 см, занимая обширные участки тела (табл. 1).

Образцы кожи больных склеродермией из пораженного и непораженного участков кожи получали под местной анестезией с помощью дерматологического пробойника (4 мм). Биопсии из непораженных участков кожи брали на расстоянии около 3 см от пораженной кожи [13, 14]. Исследование одобрено локальным комитетом по этике при Институте общей генетики РАН и соответствовало принципам, изложенным в Декларации Хельсинкского соглашения.

РНК из биопсий выделяли на колонках Qiagen по стандартному протоколу RNeasy Mini Kit для кожи. Для освобождения препаратов РНК от примесей ДНК проводили обработку ДНКазой Qiagen. Концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 1000 («Thermo Scientific», США) после чего образцы выравнивали по концентрации в ddH₂O.

Обратную транскрипцию проводили следующим образом. В пробирки для полимеразной цепной реакции (ПЦР) объемом 200 мкл вносили: буфер, dNTP, 100 ед обратной транскриптазы M_MLV («Promega»), 20 ед ингибитора РНКаз RNasin («Promega»), 500 нг oligo(dT)-праймеров (ДНК-Синтез) и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл. Смесь термостатировали 1 ч при 37 °С.

ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) проводили в 96-луночных оптических плашках с использованием меченных флюоресцентными агентами олигонуклеотидных проб. Реакцию проводили с использованием 2,5-кратной реакционной смеси с референсным красителем ROX («Синтол»). Праймеры и пробы были синтезированы фирмой «ДНК-Синтез» (табл. 2).

Амплификацию проводили в ПЦР-амплификаторе (Bio-Rad, iQ4), используя следующую программу: 1) денатурация при 95 °С в течение 4 мин, 2) денатурация при 94 °С в течение 15 с, 3) отжиг при 55 °С в течение 15 с, 4) элонгация при 72 °С в течение 15 с, 5) этапы 2—4 повторяли 50 раз. Экспрессию генов-мишеней нормализовали на ген домашнего хозяйства GAPDH. Амплификация гена GAPDH и исследуемых генов проводилась в разных пробирках.

Для обсчета результатов использовались данные реакции ПЦР-РВ со следующими параметрами: эффективность праймеров в реакции ПЦР-РВ не менее 95%.

Результаты ПЦР обрабатывали методом 2-ΔΔCT, который показывает, во сколько раз изменяется экспрессия гена в пораженном образце по сравнению с непораженным [15]. ΔΔCt рассчитывали как ΔΔCt=ΔCt (пораженной кожи) — ΔCt (непораженной кожи) и каждое значение ΔCt=Ct (исследуемый ген) — Ct(GAPDH). Эксперименты проводили в 3 повторах для каждого образца [15].

На основании анализа литературы и баз данных нами идентифицирован ряд генов, которые представляются важными для экспериментального исследования. В их число входят гены, кодирующие транскрипционный фактор AP-1 (ATF-1, ATF-3 и ATF-4). Большой интерес для нас представляло сравнение уровней экспрессии этих генов в пораженной части кожи больных склеродермией и визуально непораженной части кожи, находящейся на расстоянии около 3 см от пораженной склеродермией кожи одного и того же больного. Такое сравнение позволяет максимально исключить влияние побочных факторов на чистоту эксперимента [13, 16]. С использованием метода ПЦР-РВ проведен анализ уровня экспрессии генов АР-1 комплекса в пораженной склеродермией коже по сравнению с непораженной у 10 больных.

При индивидуальном анализе каждого больного показано, что уровень экспрессии гена ATF-1 в пораженной склеродермией коже повышен относительно визуально непораженной кожи (контроль) в интервале от 1,1 (больной 8) до 4,8 (больной 2) раза. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена оказалось повышенным в 3±0,8 раза (рис. 1).

У пациентов 8 и 9 изменение экспрессии в пораженной коже достоверно не отличается от экспрессии в непораженной коже.

Уровень экспрессии гена ATF-3 в пораженной склеродермией коже был повышен относительно визуально непораженной кожи (контроль) от 2 раз (больной 9) до 8 (больной 2) раз. Среднее значение изменения уровня экспрессии гена оказалось повышенным в 4,5±1,3 раза (рис. 2).

При измерении уровня экспрессии гена ATF-4 в пораженной склеродермией коже относительно визуально непораженной показано повышение от 1,2 (больной 8) до 9,3 раза (больной 6). Среднее значение изменения уровня экспрессии гена оказалось повышенным в 4,7±2 раза (рис. 3).

Результаты, полученные с помощью метода ПЦР-РВ, свидетельствуют об увеличении экспрессии генов ATF-1, ATF-3 и ATF-4 у всех пациентов в пораженной склеродермией коже. Патологическая активация экспрессии данных генов, как компонентов транскрипционного комплекса АР-1, может быть обусловлена их участием в TGF-β опосредованном пути развития фиброза и патологического воспаления [17].

ATF-3 играет интегрирующую роль для сигнального пути TGF-β, не только усиливая экспресссию его таргетных генов, но и регулируя экспрессию самого TGF-β по принципу положительной обратной связи. Транскрипционный фактор ATF-3 индуцируется большим количеством стрессовых сигналов и может служить связующим звеном для разных сигналов, направляя их эффекты в сигнальный путь TGF-β₁ [12]. Учитывая ключевую роль TGF-β₁ в патогенезе склеродермического процесса, повышенная экспрессия ATF-3 в очагах склеродермии у пациентов может свидетельствовать о важной роли данного фактора в регуляции функций TGF-β₁.

Усиление экспрессии гена ATF-4 у пациентов с очаговой склеродермией было наибольшим, среднее значение изменения уровня экспрессии гена оказалось повышенным в 4,7±2 раза. Фактор ATF-4 усиливает экспрессию генов стресса эндоплазматического ретикулума [18]. Предполагается, что данный процесс способствует формированию фиброза в ткани за счет активации проапоптотических патологических путей, индукции эпителиально-мезенхимальной транзиции и усилению воспалительного ответа [19]. Кроме того, фактор ATF-4 принято считать одним из ключевых транскрипционных, участвующих в клеточном ответе на оксидативный стресс путем усиления биосинтеза глутатиона. Продемонстрировано, что фибробласты с дефицитом ATF-4 имели склонность к гибели на фоне искусственного оксидантного стресса и депривации аминокислот [18]. Оксидантный стресс является одним из звеньев патогенеза склеродермии, в связи с чем высокие уровни экспрессии ATF-4 в патологических очагах могут свидетельствовать об адаптации ткани к его условиям и косвенно подтверждать его роль в патогенезе заболевания.

Таким образом, можно сделать вывод о возможной ключевой роли генов ATF-1, ATF-3 и ATF-4 в развитии склеродермии.