Введение

Глиомы составляют около 80% опухолей головного мозга и включают глиомы низкой степени злокачественности (grade I—II) и глиомы высокой степени злокачественности (grade III—IV). Глиальные опухоли также являются наиболее распространенными первичными злокачественными новообразованиями центральной нервной системы (ЦНС) и основной причиной смертности от опухолей ЦНС. Это катастрофическое заболевание приводит к большему количеству летальных исходов, чем любой другой тип опухоли нервной системы. Хотя средняя выживаемость при глиомах grade IV увеличилась с 12,1 до 15,7 мес после максимальной хирургической резекции с последующей лучевой терапией и химиотерапией, общий результат лечения пациентов остается крайне неудовлетворительным. Основной проблемой при лечении злокачественных глиом является высокая способность их опухолевых клеток к миграции и инвазии вдоль сосудистого русла [1, 2]. Большинство рецидивов возникает в пределах 2 см от полости первичной резекции, но даже выполненная ранее радикальная резекция не может остановить рост опухоли. Однако, несмотря на это, ретроспективный анализ нескольких авторов при злокачественных глиомах показал, что резекция более 98% опухоли напрямую коррелировала с выживаемостью [1—3].

На практике хирургическая дилемма состоит в том, как сбалансировать максимальную резекцию опухоли и минимизировать послеоперационные осложнения. В целом степень хирургической резекции напрямую зависит от хирургической техники и способности хирурга идентифицировать во время операции границу опухоль/мозг. Стремление к безопасной, но максимальной резекции ускорило развитие интраоперационных вспомогательных технологий. Из-за интраоперационного сдвига головного мозга возросла потребность в топографической локализации опухоли, выходящей за рамки возможностей нейронавигации и интраоперационной магнитно-резонансной томографии (МРТ), что привело к разработке дополнительных оперативных методик, распознающих опухоль в реальном режиме времени и с непрерывным обновлением картинки [4—7]. Одна из таких методик — оптическая визуализация с использованием разных индукторов флуоресценции, таких как 5-аминолевулиновая кислота (5-АЛА), хлорин Е6, гиперицин, индоцианин зеленый, флуоресцеин натрия [8—16]. Маркировка на основе флуоресценции позволяет более точно идентифицировать границы раздела опухоль/мозг и распознать остаточную часть опухоли во время операции [6, 17, 18].

Цель исследования — сравнительный анализ результатов использования флуоресцентного контроля с двумя разными флуоресцентами (5-АЛА и хлорин Е6) при интраоперационной резекции злокачественных глиом.

5-АЛА относится к контрастному веществу метаболического нацеливания, которое активируется или преобразуется из темной (например, нефлуоресцентной) конфигурации в форму, генерирующую сигнал, благодаря метаболическому процессу, который очень активен в опухолевой ткани [19, 20].

5-АЛА является предшественником протопорфирина IX в организме человека. Механизм действия основан на способности опухолевых клеток к повышенному накоплению фотоактивного протопорфирина IX в присутствии экзогенной 5-АЛА. Высокий флуоресцентный контраст опухоли и окружающей ткани регистрируется на протяжении первого часа после окончания инстилляции и достигает 3—23-кратной величины, что позволяет при проведении флуоресцентной диагностики уточнять границы опухолей и выявлять визуально не определяемые опухолевые образования для последующего органосохраняющего лечения без повреждения ткани, окружающей опухоль. Специально разработанные приставки к операционным микроскопам обеспечивают возможность интраоперационной визуализации красно-розового свечения протопорфирина IX, что позволяет определять границы злокачественной опухоли, при этом интенсивность флуоресценции зависит от энергии активирующего излучения микроскопа. Свет с длиной волны 405 нм максимально адсорбируется молекулами протопорфирина IX, а видимая флуоресценция отмечается в диапазоне 635—704 нм [4, 6, 16, 21].

Хлорин Е6 (фотодитазин) — красный флуоресцентный краситель, фотосенсибилизатор второго поколения, который может возбуждаться синим светом и имеет пик поглощения 400 нм. Его можно использовать для нацеливания на злокачественные опухоли головного мозга или для фотодинамической терапии. Хлорин Е6 в отличие от 5-АЛА относится к веществу с пассивным накоплением в опухоли [12, 13, 22].

Препарат фотодитазин нетоксичен, имеет высокую тропность (степень накопления в пораженных тканях), быстро накапливается в опухоли и выводится из организма практически полностью в течение суток. При введении фотодитазина в организм максимальное его накопление в опухолевом очаге наблюдается через 1,5—2 ч; коэффициент контрастности по отношению к окружающей нормальной ткани более 10. Практически полное выведение препарата из организма происходит через 28 ч [23].

Материал и методы

На базе РНХИ им. проф. А.Л. Поленова проведено когортное проспективное исследование, основанное на анализе эффективности использования интраоперационной флуоресцентной навигации с разными индукторами флуоресценции (хлорина Е6 и 5-АЛА) в ходе хирургического лечения 50 пациентов с глиомой высокой степени злокачественности (grade III—IV по Классификации опухолей ЦНС Всемирной организации здравоохранения 2016 г.).

Критерии включения пациентов в выборку: наличие резектабельной глиальной опухоли высокой степени злокачественности (по данным послеоперационного морфологического результата), супратенториальная локализация опухоли, возраст пациента 29—68 лет, индекс Карновского перед операцией не менее 70 баллов, отсутствие значимых сопутствующих заболеваний.

Критерии исключения: наличие значимых сопутствующих заболеваний, требующих приема более чем 2 лекарственных препаратов, тяжелое состояние больного, наличие признаков почечно-печеночной недостаточности, хронические вирусные инфекции (гепатит С, В, ВИЧ-инфекция), эндокринные заболевания, нарушение метаболического обмена.

Перед операцией всем больным выполняли МРТ головного мозга (1,5 Т) с контрастом в Т1-режиме. Оценивали размер и объем опухоли, количество опухолевых очагов, их распространение относительно функциональных зон, крупных кровеносных сосудов и долей мозга, распространение на противоположное полушарие, выраженность перифокального отека, смещение срединных структур. Все эти характеристики определяют объем планируемой операции. Степень резекции опухолевой ткани тщательно измерял опытный нейрорадиолог, сравнивая объемную послеоперационную МРТ с объемной предоперационной МРТ.

Общую физическую работоспособность оценивали с помощью шкалы Карновского. Неврологический статус рассчитывали по шкале National Institute of Health Stroke Scale (NIHSS). Предоперационную клиническую оценку выполняли за 14 дней до операции, послеоперационную — в течение 72 ч после операции.

Пациентов разделили на две равные группы (по 25 пациентов): в 1-ю группу вошли пациенты, которые в качестве индуктора флуоресценции получали перорально препарат 5-АЛА (аласенс) производства ГНЦ «НИОПИК» (Россия) в дозе 20 мг/кг за 8 ч до интраоперационного этапа дуротомии. Пациенты 2-й группы получали в качестве индуктора флуоресценции внутривенно препарат хлорин Е6 2-го поколения (фотодитазин) производства ООО «ВЕТА-ГРАНД» (Россия) в дозе 1 мг/кг, растворенный в 200 мл 0,9% раствора натрия хлорида с обернутым темной бумагой флаконом за 2 ч до предполагаемой операции — дуротомии.

В каждой группе были по 10 пациентов со степенью злокачественности глиомы grade III (анапластическая астроцитома — по 7 пациентов, анапластическая олигодендроглиома — по 2 пациента, анапластическая олигоастроцитома — по 1 пациенту) и по 15 пациентов с глиомой grade IV (глиобластома). Подробная клиническая характеристика представлена в табл. 1. Статический анализ данных обеих групп показал их сопоставимость (p>0,05).

Таблица 1. Клиническая характеристика пациентов

Интраоперационную флуоресцентную диагностику с препаратом 5-АЛА проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss OPMI Pentero с флуоресцентным модулем. Для визуальной оценки интенсивности флуоресцентного эффекта от 5-АЛА использовали 4-балльную шкалу: 0 баллов — отсутствие видимой флуоресценции, 1 балл — слабо-розовое свечение, 2 балла — розовое свечение, 3 балла — ярко-красное свечение.

Интраоперационную флуоресцентную диагностику с препаратом хлорин Е6 проводили с использованием операционного микроскопа LEICA OHS-1 с установкой D-Light AF System (Karl Storz, Германия) и флуоресцентной приставки отечественного производства «ЛОМО» (Санкт-Петербург, разработка Г.В. Папаяна). Она включает в себя специализированный осветитель синего света (387—447 нм), который на время такого исследования выполняет роль стандартного осветителя, обеспечивая высокую плотность и мощность возбуждающего излучения (около 50 мВт/см²), необходимого для наблюдения слабой флуоресцентной картины. Для визуальной оценки интенсивности флуоресцентного эффекта использовали 4-балльную шкалу: 0 баллов — отсутствие видимой флуоресценции, 1 балл — слабо-розовое свечение, 2 балла — красное свечение, 3 балла — ярко-красное свечение.

Анализ оценки интенсивности флуоресценции в выбранном месте выполняли с помощью телевизионно-компьютерной системы, включающей в себя высокочувствительную цифровую ТВ-камеру (разрешение 752×582, максимальная частота кадров 25 Гц), и специального программного обеспечения RSS Cam — Endo 1.4.313, при помощи которого производилось управление камерой, а также высококачественная фотофиксация и видеофиксация.

У всех пациентов диагноз глиальной опухоли подтвержден гистологическим исследованием интраоперационного материала в соответствии с Классификацией опухолей ЦНС Всемирной организации здравоохранения 2016 г.).

Для верификации гистологического диагноза операционный материал фиксировали в 10% забуференном формалине, обезвоживали стандартным способом и заливали в парафин. Изготавливали срезы толщиной 3—5 мкм (микротом Leica SM 2000R), окрашивали гематоксилином и эозином, при необходимости производили другие окраски: пикрофуксином по методу Ван Гизона, импрегнацию серебром. Для визуализации и выполнения микрофотографий использовали лабораторный микроскоп Leica 4000B и лабораторный микроскоп Leica DM 2500, оснащенный цифровой камерой и адаптированной программой Adobe Photoshop CS3.

Помимо этого, определяли иммуногистохимические маркеры: VEGF (вазоэндотелиальный ростовой фактор), p53, Ki-67 (MIB-1).

В рамках дополнительного исследования у пациентов выполнена биопсия по краю опухоли и в перитуморальной области для способности флуоресцентов различать опухоль и нормальную ткань мозга. У каждого пациента взято 8 биопсий: 4 в флуоресцирующей зоне и 4 в нефлуоресцирущей зоне (интактная ткань), расположенных друг от друга на расстоянии; 4 из них взяты по краю опухоли, 4 — в перитуморальной области. Анализ проводили слепым методом для расчета чувствительности и специфичности.

Статистический анализ для сравнения категориальных переменных выполняли с помощью теста в двусторонних таблицах. Если какое-либо значение было меньше 10, использовали точный критерий Фишера (двусторонний). Статистически значимыми считали результаты при p<0,05.

Результаты

Более чем у 90% пациентов при использовании обоих флуоресцентов достигнута положительная флуоресценция, наибольшее количество — при глиомах grade IV. Детальная хирургическая характеристика пациентов представлена в табл. 2.

Таблица 2. Хирургическая характеристика пациентов

Морфологическое исследования различных участков глиом grade IV в зависимости от интенсивности интраоперационной флуоресценции показало, что зоне некроза опухоли соответствуют: отсутствие флуоресценции в 13/15 (86,7%) случаях при флуоресценции с 5-АЛА и в 14 (93,3%) случаях при флуоресценции с хлорином Е6 либо очень слабая флуоресценция в 13% и 6,6% случаев соответственно. Очень яркая флуоресценция выявлена в зоне инфильтрации опухоли в 13 (86,7%) случаях в обеих группах. В солидной части опухоли видимая флуоресценция определялась у 13 (86,7%) пациентов при применении 5-АЛА и у 12 (80%) пациентов при применении хлорина Е6.

Трехслойная модель флуоресценции описана в 35/50 (70%) случаях: у 33/39 (84,6%) пациентов при первично диагностированной глиоме и у 2/11 (18,2%) пациентов при рецидивирующей глиоме, у 32/30 (93,8%) пациентов с глиомой grade IV и у 3/20 (15%) пациентов с глиомой grade III, а также у 23/32 (71,9%) пациентов с глиомой 9 см³ и более и у 12/18 (66,7%) пациентов с глиомой менее 9 см³.

Оценку степени радикальности резекции (GTR₉₅ — gross total resection) (удаление не менее 95% контрастирующейся части опухоли по данным МРТ, выполненной в течение первых 24 ч после операции) при использовании интраоперационной флуоресцентной навигации проводили на основании МРТ, выполненной в течение первых 24 ч после удаления опухоли.

В частности, GTR₉₅ достигнута у 17/19 (89,5%) пациентов с опухолью, расположенной в функциональных зонах, и у 28/31 (90,3%) пациентов с опухолью, расположенной вне функциональных зон, у 36/39 (92,3%) пациентов с впервые выявленной глиомой и 9/11 (81,8%) пациентов с рецидивирующей глиомой, у 18/20 (90%) пациентов с глиомой grade III и у 27/30 (90%) пациентов с глиомой grade IV, у 27/32 (84,4%) пациентов с более крупной (≥9 см³) опухолью и у 18/18 (100%) пациентов с меньшей (<9 см³) опухолью.

Анализ результатов иммуногистохимического исследования срезов флуоресцентно позитивных и негативных участков выявил различия в количественном содержании и распределении в ткани опухоли белковых маркеров Ki-67, P53, VEGF в обеих исследуемых группах (рис. 1 и 2). Количество белковых маркеров коррелировало с интенсивностью флуоресценции и развитостью сосудистой сети опухоли. На срезах флуоресцентно позитивных опухолей в обеих группах обнаружено больше капилляров и опухолевых сосудов с измененным эндотелием (увеличение межклеточных промежутков, фрагментированный эндотелий) (табл. 3).

Рис. 1. Интраоперационные фотографии и микрофотографии анапластической астроцитомы (grade III) с применением 5-АЛА и хлорина Е6 (окраска гематоксилином и эозином, ×200; иммуногистохимия с Ki-67, ×400; VEGF, ×200).

Рис. 2. Интраоперационные фотографии и микрофотографии глиобластомы (глиома grade IV) с применением 5-АЛА и хлорина Е6 (окраска гематоксилином и эозином, ×200; иммуногистохимия с Ki-67, ×400; VEGF, ×400).

Таблица 3. Морфологическая характеристика тканей опухоли

Морфологическое исследование 420 биоптатов флуоресцирующих и нефлуоресцирующих областей опухолевой ткани по краю опухоли и перитуморальной области показал, что чувствительность метода при сопоставлении интраоперационной флуоресценции с результатами морфологии для глиом grade III составляет 82,5% (5-АЛА) и 83,8% (хлорин Е6), для глиом grade IV — соответственно 88,3% и 87,7%, специфичность для глиом grade III — соответственно 64,1% и 66,7%, для глиом grade IV — соответственно 88,1% и 85,2% (табл. 4, рис. 3 и 4).

Таблица 4. Чувствительность и специфичность методов флуоресцентной навигации в хирургии глиом grade III—IV по данным морфологических результатов

Примечание. Чувствительность метода = число флуоресцентно положительных биоптатов с опухолевой тканью / общее число биоптатов с опухолевой тканью × 100%. Специфичность метода = число флуоресцентно положительных биоптатов с интактной тканью (без признаков опухоли) / общее число биоптатов с интактной тканью × 100%.

Рис. 3. Чувствительность и специфичность метода флуоресцентной навигации при глиомах grade III с 5-АЛА и хлорином Е6 в сопоставлении с морфологическими данными (ROC-кривые).

Рис. 4. Чувствительность и специфичность метода флуоресцентной навигации при глиомах grade IV с 5-АЛА и хлорином Е6 в сопоставлении с морфологическими данными (ROC-кривые).

Обсуждение

Резекция опухолей под контролем флуоресценции 5-АЛА практикуется в различных странах на протяжении более 20 лет и является стандартом лечения в Европе. Доказательства эффективности этой методики получены по результатам многочисленных исследований, включая данные многоцентровых проспективных рандомизированных клинических исследований, которые показали улучшение послеоперационного прогноза у пациентов, перенесших операции под флуоресцентным контролем. Этот метод обеспечивает превосходную дифференциацию, поскольку на интраоперационную навигацию с предоперационной МРТ с контрастным усилением может влиять сдвиг мозга. Метаанализ литературы по резекции злокачественных глиом с использованием флуоресценции 5-АЛА показал увеличение общей средней выживаемости на 6,2 мес [24—30].

Оценка флуоресцентных веществ сопряжена с множеством проблем. Для нашей работы мы выбрали в качестве показателей результатов гистологическую точность (чувствительность, специфичность), степень радикальности резекции, общую выживаемость — наиболее часто описываемые показатели результатов среди таких исследований; данное обстоятельство, однако, не обязательно означает, что это наиболее подходящие показатели для оценки флуоресцентов. Кроме того, частота тотальности резекции и медиана выживаемости являются показателями, используемыми в качестве показателей клинического исхода [24, 27, 31, 32].

Флуоресцентная хирургия глиом позволяет определить ткань опухоли в режиме реального времени в течение операции, включая области диффузной инфильтрации, в которых опухолевые клетки смешиваются с нормальной паренхимой, поэтому опухолевую ткань можно легко обнаружить. Исследование, проведенное W. Stummer и соавт., подтверждает, что использование флуоресценции при резекции глиом высокой степени злокачественности с помощью микроскопа увеличивает радикальность проводимого оперативного вмешательства, величину безрецидивного периода, а также общую выживаемость [33].

С точки зрения экономики здравоохранения и качества жизни показано, что пациентам, получавшим резекцию под контролем флуоресценции 5-АЛА, требовалось значительно меньше хирургических операций, курсов химиотерапии и других методик адъювантной терапии. В результате получены потенциально значительная экономия затрат на здравоохранение и повышение качества жизни пациентов. Можно дополнительно продлить продолжительность жизни с поправкой на качество и снизить затраты, если хирургическая резекция злокачественных глиом будет сопровождаться нейрофизиологическим мониторингом, хирургической стереотаксической навигацией и мультимодальной флуоресцентной визуализацией, регистрацией и объединением этих изображений. Это позволило бы хирургу оказать наилучшую помощь неизлечимо больным пациентам [4, 6, 23, 34].

В флуоресцентной хирургии глиомы флуоресцентные вещества должны быть простыми в применении, безопасными в использовании и специфичными для опухоли. Флуоресцентный сигнал должен быть сильным и легко обнаруживаемым.

По мере расширения количества флуоресцентов увеличивается гистологическая точность обнаружения опухолевой ткани, будет расти и интерес к визуализации на клеточном уровне с помощью систем визуализации, таких как конфокальная микроскопия [17, 22, 24, 28].

Заключение

Показано, что объем резекции злокачественных глиом положительно влияет на исход у пациента. Интраоперационная резекция под контролем флуоресценции — безопасный, эффективный и удобный метод, который обозначил значительные перспективы по увеличению частоты высокой тотальности резекции. Использование в нашей практике 5-АЛА и хлорина Е6 не выявило статистически значимой разницы в достижении удовлетворительных результатов лечения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.