Методы диагностики и лечения ранних стадий рака желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) постоянно совершенствуются и быстро развиваются. Благодаря значительному технологическому скачку и появлению новой медицинской аппаратуры возникли новые малоинвазивные и высокоточные эндоскопические методики: хромоэндоскопия, эндоскопия высокой четкости (HRE), узкоспектральная эндоскопия (NBI - Narrow Band Imaging, FICE - Flexibl spectral Imaging Color Enhancement, IScan), авто­флюоресценцентная эндоскопия (AFI) и увеличительная эндоскопия (магнификационная Zoom-эндоскопия). Это позволяет значительно улучшить диагностику неоплазий слизистой ЖКТ и выполнить биопсию. Одним из современных высокотехнологичных методов диагностики является конфокальная лазерная эндомикроскопия (КЛЭМ).

Методика КЛЭМ появилась в середине прошлого столетия и была разработана M. Minsky [12] для изучения нейронной сети головного мозга. Однако тогда она не нашла широкого применения из-за несовершенства вычислительной техники и отсутствия мощных источников освещения. С начала 90-х годов началось бурное развитие компьютерной техники, минимизация ее размеров, повышение вычислительной мощности. Все это привело к появлению систем для КЛЭМ нового поколения. В 2000 г. была опубликована статья о применении метода КЛЭМ для изучения опухолей желудочно-кишечного тракта в лабораторных условиях [9]. В 2003 г. вышла публикация об исследованиях полипов и опухолей толстой кишки [17]. В 2009 г. на первой интернациональной конференции, посвященной КЛЭМ, обобщили имеющиеся клинические данные и создали первую классификацию для разных отделов ЖКТ и желчных протоков [20]. На сегодняшний день доступны две системы КЛЭМ: с помощью специальных зондов («Mauna Kea Technologies», Франция) и интегрированная в эндоскоп («Pentax», Япония). Обе системы имеют ряд преимуществ и недостатков.

Метод КЛЭМ основан на принципе конфокальной флуоресцентной микроскопии. В данной методике микроскоп использует сфокусированный лазерный луч света с длиной волны 488 нм, который фокусируется на исследуемый участок слизистой с помощью системы селективных зеркал и линз, встроенных в сканирующий блок, и линзы на дистальном конце мини-зонда. Специальное многослойное напыление из диэлектрических материалов обеспечивает высокоэффективное отражение света на длине волны генерации лазера и почти 100% пропускание света в остальном спектральном диапазоне. На исследуемом участке лазер фокусируется в точку. Флюоресцентное излучение, возбуждаемое лазером, собирается той же линзой. Затем селективное зеркало отражает рассеянный лазерный свет, пропуская через себя к системе детекции флюоресцентное излучение. Лазерный луч возбуждает флюо­ресценцию во всех слоях слизистой, через которые он проходит. Флюоресценция, излучаемая слоями, расположенными выше и ниже фокальной плоскости, если она попадает на систему детекции, регистрируется вместе с основным сигналом и ухудшает разрешение оптической системы. Чтобы улучшить разрешение, используется конфокальная диафрагма, которая помещается в сопряженной фокальной плоскости объектива, точнее, в той плоскости, где микроскоп фокусирует флюоресценцию, собранную из фокуса объектива. Через диафрагму проходит только та флюоресценция, которая излучается из небольшого объема вблизи фокуса лазерного луча под объективом (линза на дистальном конце зонда). Флюоресценция, испускаемая слоями выше и ниже фокуса лазерного луча, оказывается дефокусированной на конфокальной диафрагме и через нее к системе детекции не проникает [5-8, 12, 14, 15, 21].

В наших клиниках исследование проводилось с помощью системы Cellvizio («Mauna Kea Technologies», Франция) (рис. 1).

Для получения изображений мы использовали контрастное вещество - 10% раствор флюоресцеина натрия в дозе от 1 до 5 мл. Через 30 с после внутривенного введения препарата получали конфокальные изображения. Флюоресцеин не окрашивает клеточные ядра и цитоплазму, накапливаясь в межклеточном пространстве (матриксе) и собственной мышечной пластинке слизистой, а также циркулирует в сосудистом русле [9]. Препарат метаболизируется в печени и начинает выводиться из организма уже через 20 мин после введения. Однако получение качественных конфокальных изображений возможно в течение 60 мин. Побочными явлениями от введения препарата практически всегда бывают транзиторное незначительное пожелтение кожных покровов и изменение цвета мочи в течение 6 ч [8, 11, 13, 19].

С июня 2011 г. по октябрь 2013 г. КЛЭМ выполнена 103 больным в возрасте от 33 до 90 лет с изменениями СОЖ и подозрением на неопластический процесс. Всем больным перед КЛЭМ выполняли эзофагогастродуоденоскопию (ЭГДС) с осмотром аппаратами в режимах высокой четкости в белом свете, узкоспектральном (NBI) и оптического увеличения (Zoom).

Эндоскопическое исследование проводили с использованием внутривенной седации раствором пропофола или интубационного наркоза в зависимости от планируемого нами объема обследования и лечения. ЭГДС выполняли с использованием эндоскопической аппаратуры компании «Olympus» (Япония). Применяли видеопроцессоры серий CV180 Evis Exera 2 и CV260 Evis Lucera, эндоскопы с функцией узкого спектра света и оптического увеличения GIF Q160Z и GIF FQ260Z. Для стабилизации изображения и создания фокусного расстояния применяли специальный колпачок производства компании Olympus (Япония). Для уточнения глубины выявленных изменений выполняли эндоскопическую ультрасонографию с использованием процессора EU ME 1 «Olympus» (Япония) и мини-зондов UM 3R с частотой 20 МГц или эндоскопа GF-UE 160-AL5.

В режимах узкого спектра (NBI) и оптического увеличения (Zoom) оценивали архитектонику ямочного микрорельефа слизистой, а также рисунок поверхностной капиллярной сети. При этом были выявлены стертость или разрушение рельефа слизистой, различные изменения капиллярного рисунка, такие как расширение капилляров, нерегулярность, извитость, штопорообразность или полный обрыв рисунка. Мы выделяли область слизистой желудка, содержащую данные изменения, как потенциально являющуюся неопластическим очагом. При использовании указанных эндоскопических методик у 103 больных заподозрено 185 очаговых изменений СОЖ неопластического характера. Вид изменений в этой области уточняли с помощью зондовой КЛЭМ. В режиме оптического увеличения с усилением узким спектром света эндоскоп подводили к зоне с изменениями в СОЖ. Далее мини-зонд GastroFlex с глубиной сканирования 70-130 мкм или GastroFlex UHD с глубиной сканирования 55-65 мкм проводили через рабочий канал гастроскопа до легкого контакта с СОЖ под углом 90°. Через 30 с после введения флюоресцеина натрия оценивали состояние микрососудов и рельеф поверхностных слоев слизистой.

Получаемые во время исследования на экране монитора Cellvizio видеозаписи и отдельные изображения микрососудистого русла и рельефа СОЖ сохраняли в цифровом виде с последующим проведением ретроспективного анализа полученных данных. Лазерный сканирующий конфокальный эндомикроскоп выполняет сканирование в горизонтальной по отношению к поверхности слизистой плоскости. При использовании раствора флюоресцеина натрия на конфокальных изображениях видны клетки железистого эпителия, которые выглядят как маленькие серые точки, так как цитоплазма и клеточная мембрана не окрашиваются. Эти точки расположены близко друг к другу. Между клетками визуализируется флюоресцирующий межклеточный матрикс в виде тонких белых линий. Все это создает картину, похожую на «булыжную мостовую». Определить точный размер клеток затруднительно, так как невозможно ориентировать конфокальный зонд под углом 90° во всех отделах желудка, а также из-за пульсации сосудов. В тех случаях, когда этот угол был меньше, получались изображения в продольной плоскости сканирования. Для оценки этих изображений мы ориентировались на нормальное гистологическое строение СОЖ, а также учитывали механизмы канцерогенеза железистого рака желудка, описанные Л.И. Аруином [2]. Из них следует, что атипичные клетки, образовавшиеся в обычных "стартовых" зонах (в области шеек) мигрируют и накапливаются в верхней части желудочных ямок с образованием «аберрантного очага пролиферации». В этих очагах могут отмечаться явления ложной многослойности - признак тяжелой дисплазии и рака in situ.

Учитывая разнообразие рельефа слизистой желудка, выделяют несколько зон. Эти зоны не всегда совпадают с анатомическим делением желудка на отделы. Выделяют антральную (пилорическую), фундальную (тело), кардиальную и интермедиарную (переходную) зоны. Рельеф тела желудка об­условлен большим количеством желез, которые открываются в столбчатого вида ямки. Каждая ямка самостоятельно открывается на поверхности слизистой, образуя округлой формы углубления, располагающиеся примерно на одинаковом расстоянии, их глубина составляет ¼ СОЖ. В антральной и кардиальной зонах рельеф слизистой представлен ямками в виде борозд и извилин, на дне которых открываются выводные протоки желез. Глубина ямок в этих отделах может достигать ½ СОЖ. Интермедиарная зона представлена переходом рельефа слизистой от ямок округлой формы с ровными контурами к извилистым бороздам. Толщина слизистой варьирует в пределах 0,3-1,5 мм (300-1500 мкм) [2-4, 10, 16].

Исходя из описанных выше данных, можно увидеть только самые поверхностные слои слизистой. В норме на конфокальных изображениях, получаемых при изучении фундального отдела, поверхность слизистой выглядит как «медовые соты», состоящие из желудочных ямок округлой формы, темного цвета и валиков с флюоресцирующими сосудами. В антральной и кардиальной зонах желудка рельеф слизистой выглядит иначе: ямки в виде длинных извилистых борозд, а валики выглядят аналогично структурам в теле желудка (рис. 2).

С помощью этого метода появляется возможность обнаружить следующие патологические изменения СОЖ: кишечную метаплазию по толстокишечному типу, дисплазию желез поверхност­ного эпителия и фокусы раннего рака желудка (см. таб­лицу).

В нашем исследовании с помощью КЛЭМ у 103 больных выявлено 185 случаев очаговых изменений слизистой желудка неопластического характера. В большинстве случаев мы выявляли сочетание нескольких очагов с изменениями в СОЖ: диффузная кишечная метаплазия по толстокишечному типу и дисплазия, диффузная кишечная метаплазия по толстокишечному типу и ранний рак. В 94 (50,8%) случаях с помощью КЛЭМ были заподозрены очаги кишечной метаплазии, в 52 (28,1%) случаях - дисплазия и в 39 (21,1%) - ранняя форма рака желудка. Для подтверждения и уточнения результатов, полученных при КЛЭМ, всем больным выполнена прицельная биопсия. По результатам биопсии кишечная метаплазия подтверждена в 92 (49,7%) случаях, дисплазия разной степени выраженности - в 35 (18,9%), ранний рак - в 30 (16,2%) случаях. Информативным материал признавали при наличии в биоптатах мета-, дис- и/или неопластических изменений или при наличии этих изменений в удаленных участках СОЖ и резецированных частях желудка. Материал расценивали как неинформативный при заключениях типа «гастрит», «слизистая пищевода» и т.п. Неинформативным материал оказался в 28 (15,1%) случаях. При наличии кишечной метаплазии по толстокишечному типу преобладают бокаловидные клетки. На конфокальных изображениях бокаловидные клетки (за счет скопления в цитоплазме сиалокислых муцинов) имеют вид темных округлых пятен визуально большего размера, чем нормальные клетки (рис. 3).

При морфологическом исследовании бокаловидные клетки окрашиваются альциановым синим в голубой цвет. Значимость выявления кишечной метаплазии по толстокишечному типу велика, так как диффузная (распространенная) кишечная метаплазия, по мнению большинства авторов, является предраком СОЖ [1, 18].

Вторым признаком, свидетельствующим о предраковом состоянии СОЖ, является дисплазия железистого эпителия. Эксперты ВОЗ определяют дисплазию в классическом понимании (для многослойного плоского эпителия) как изменения, при которых часть толщи эпителия замещена клетками с различной степенью атипии, утратой полярности и слоистости; такие же изменения характерны и для железистого эпителия СОЖ. Главными критериями степени выраженности атипии являются нарастание клеточного полиморфизма и увеличение тканевой дезорганизации [2]. Особенно значима тяжелая степень дисплазии. Дисплазия железистого эпителия различной степени выраженности заподозрена нами в 52 (28,1%) случаях неоплазий. На конфокальных изображениях дисплазия выглядит следующим образом: структурность рельефа слизистой сохранена, но изменены его качественные характеристики. Желудочные ямки на поверхности слизистой располагаются нерегулярно, расстояние между ними сокращено, форма их неправильная, контуры неровные, в виде зубьев пилы. На валиках визуализируются атипичные клетки разного размера и формы. Эти клетки визуально больших размеров, чем нормальные клетки железистого эпителия, и окраска их более темная. Наличие перечисленных критериев прямо пропорционально нарастанию степени тяжести дисплазии (рис. 4).

Дисплазия различной степени выраженности подтверждена в 35 (18,9%) случаях очаговых изменений СОЖ при проведении морфологического исследования. При изучении биоптатов СОЖ дисплазию определяют по наличию атипичных клеток, характеризующихся анизокариозом, гиперхроматозом ядер, резким увеличением ядерно-цитоплазматического соотношения в пользу ядра и псевдостратификацией. Различают дисплазию желез покровно-ямочного эпителия, дисплазию шеечных желез и дисплазию функционального слоя (пилорических) для антрального отдела и фундальных желез для тела желудка. Для дисплазии тяжелой степени характерно образование участков псевдомногорядности железистого эпителия, повышение митотической активности ядер, среди них много патологических митозов [2].

При КЛЭМ можно выявить фокусы раннего рака желудка. В нашем исследовании ранний рак желудка заподозрен в 39 (21,1%) случаях неоплазий. Исходя из нашего исследования, можно идентифицировать железистый рак (аденокарциному) и низкодифференцированный поверхностный рак по типу перстневидно-клеточного.

Для фокусов железистого рака на КЛЭМ-изображениях характерно разрушение рельефа слизистой разной степени выраженности вплоть до полной утраты признака «булыжной мостовой» за счет множественных атипичных клеток разного размера черного цвета. Желудочные ямки приобретают неправильную форму, становятся более вытянутыми или в виде многоугольника, контуры напоминают зубья пилы. На валиках определяются атипичные клетки черного цвета большего размера, чем нормальные клетки. Расстояние между желудочными ямками уменьшается, расположение их становится нерегулярным, характерный рисунок «медовых сот» на изображениях угадывается с трудом (рис. 5).

Выраженность разрушений рельефа и изменений желудочных ямок и валиков тем больше, чем ниже степень дифференцировки рака, однако вы­явить специфические признаки, характерные для разных степеней дифференцировки рака, на данный момент не удалось. При проведении морфологического исследования критериями постановки диагноза железистого рака СОЖ является наличие комплексов с признаками резко выраженной клеточной атипии и тканевой дезорганизации. В зависимости от степени дифференциации рака идет нарастание клеточной атипии пропорционально изменению ядерно-цитоплазматического соотношения (увеличение ядер и повышение их митотической активности), а также нарастание тканевой дез­организации.

В 2 случаях нами выявлен перстневидно-клеточный рак. При КЛЭМ для перстневидно-клеточного рака характерны полное разрушение рельефа (невозможно дифференцировать ямки и валики), наличие увеличенных в размере округлых клеток черного цвета (типичные клетки перстневидно-клеточного рака), визуально большего размера, чем нормальные клетки и бокаловидные клетки с сиалокислыми муцинами (рис. 6).

Фокусы рака СОЖ морфологически подтверждены в 30 (16,2%) случаях неоплазий. Морфологически в зависимости от клеточного состава выделяют 3 типа перстневидных клеток. В выявленных нами 2 случаях перстневидно-клеточного рака перстневидные клетки были «классическими, ШИК-пози­тивными, т.е. окрашивались реактивом в ярко-красный цвет.

Таким образом, для диагностики неоплазий желудка необходим комплексный подход с применением всех существующих ныне эндоскопических методик: эндоскопии высокой четкости с осмотром в белом свете, хромоскопии, узкоспектральной эндоскопии (NBI, AFI), эндоскопии с оптическим увеличением, конфокальной лазерной эндомикроскопии. Конфокальная лазерная эндомикроскопия позволяет выявить кишечную метаплазию по толстокишечному типу, фокусы дисплазии и раннего рака слизистой желудка. На сегодняшний момент конфокальная лазерная эндомикроскопия не может полностью заменить морфологическое исследование ввиду ограничения технических возможностей аппаратуры, не позволяющей выполнять сканирование на всю глубину слизистой желудка, однако методика дает возможность довольно четко дифференцировать доброкачественные и злокачественные неопластические состояния. К существенным недостаткам конфокальной лазерной эндомикроскопии можно отнести высокую стоимость расходных материалов и необходимость внутривенного введения контрастных веществ.