На сегодняшний день одним из наиболее актуальных вопросов практической кардиологии является проблема прогнозирования фатальных и нефатальных осложнений различных сердечно-сосудистых заболеваний. В рамках оценки риска сердечно-сосудистых событий у пациентов с ИБС интересны многочисленные работы о состоянии «нуклеотидного ключа» — микроРНК, регулирующих экспрессию генов. Важно такое направление исследований, как возможность неинвазивной ранней диагностики ИБС с использованием циркулирующих биомаркеров, отражающих стадии патогенеза заболевания и стабильно обнаруживающихся в кровотоке. Согласно большому количеству проведенных исследований, на сегодняшний момент в качестве перспективного биомаркера, отвечающего указанным критериям, можно рассматривать циркулирующие микроРНК (ц-микроРНК).

МикроРНК представляют класс наиболее изученных малых некодирующих РНК, характеризуются длиной от 18 до 24 нуклеотидов и рассматриваются как одни из ключевых регуляторов экспрессии большинства генов на пост-транскрипционном уровне. Связывание микроРНК с соответствующими комплементарными участками в 3′- или 5′-нетранслируемых регионах мРНК-мишеней инициирует дестабилизацию мРНК и угнетение ее трансляции. Вследствие возможности регуляции трансляции даже при частичной комплементарности микроРНК к ее мишени каждая микроРНК способна оказывать влияние на экспрессию множества генов одновременно, что способствует микроРНК-регуляции подавляющего большинства процессов, происходящих в клетке, включая пролиферацию, апоптоз, клеточный цикл и сигналинг. В соответствии с базой данных miRBase, к настоящему моменту для человека известно около 2000 видов микроРНК. Многие из них являются ключевыми регуляторами биологических процессов, лежащих в основе пренатального формирования сердечно-сосудистой системы и патогенеза различных сердечно-сосудистых заболеваний, включая ИБС, сердечную недостаточность, гипертрофию левого желудочка, аритмии и артериальную гипертензию.

Несмотря на то что биогенез микроРНК и их взаимодействие с мРНК происходят внутри клетки, ряд микроРНК обнаруживается во внеклеточном пространстве, включая различные биологические жидкости и питательную среду культивируемых клеток. МикроРНК могут появляться в кровотоке в результате трех основных механизмов: активная секреция, апоптоз и некроз. Кроме того, циркулирующие внеклеточные микроРНК обнаруживаются в слюне, слезах, моче, грудном молоке, перитонеальной жидкости, спинномозговой жидкости, бронхиальной слизи и семенной жидкости [1]. Специфическое изменение профилей ц-микроРНК биологических жидкостей при различных патофизиологических состояниях могут быть свидетельством того, что внеклеточные микроРНК появляются в результате выхода из некротизированных или поврежденных клеток, а также целенаправленно секретируются клетками во внешнюю среду [2]. Присутствие микроРНК в циркуляции в связанном состоянии обеспечивает их высокую стабильность: ц-микроРНК в плазме или сыворотке устойчивы к рибонуклеазной активности, экстремальным изменениям pH, циклам заморозки—разморозки образца и его длительному хранению при комнатной температуре.

Согласно многим имеющимся в настоящее время исследованиям, экспрессия ц-микроРНК четко ассоциирована с наличием ИБС. Первые статистически достоверные различия были получены для miR-133a [3, 4], miR-134, miR-145 [5], miR-122 и miR-370 [6] независимо от имеющихся факторов риска. Их уровень имел положительную корреляцию с тяжестью ИБС, что позволило рассматривать эти микроРНК как биомаркеры для выявления значимого атеросклероза коронарных артерий.

Возможная обратная связь miR-155 со сложными проатерогенными метаболическими факторами также была продемонстрирована в результатах еще одного исследования [7]. В отдельных исследованиях показано, что уровни miR-126 [8], miR-33a/b [6], как и уровни miR-1, miR-16, miR-122, miR-208b, miR-375 и miR-499 [3] достоверно не различались у пациентов с и без ИБС, в соответствии с чем эти микроРНК были признаны авторами диагностически незначимыми.

Однако по результатам других исследований, некоторые микроРНК, включая miR-133a/b [3, 4, 9—11], miR-208a/b [3, 9—13] и miR-499 [3, 9—14], имели самостоятельную диагностическую и прогностическую ценность, превосходя по своей значимости высокочувствительный тропонин Т (hs-cTnT).

В настоящее время стоит делать осторожные выводы о диагностической ценности miR-21 [13, 15], miR-126 [8, 15], miR-134 [3, 16], miR-146a/b [13, 15], miR-150 [15, 17, 18] и miR-486 [18], поскольку имеющиеся исследования немногочисленны, а полученные результаты также неоднозначны.

В отличие от представленных выше микроРНК, которые ассоциированы с различными стадиями ИБС, ряд исследований показал, что для miR-122 не обнаруживается достоверных различий у пациентов с ИБС и лиц контрольной группы без ИБС [3, 6, 15]. Также не было получено достоверных различий относительно miR-16 [3, 10], miR-223 [9, 15] и miR-320a [9, 15].

Таким образом, miR-1, miR-133a/b, miR-145, miR-208a/b, и miR-499 (a) являются одними из наиболее перспективных прогностических маркеров прогрессирующего течения ИБС.

На сегодняшний день существует необходимость в новых биомаркерах ОКС, поскольку тропонины не позволяют исключить острый инфаркт миокарда (ОИМ) в первые 4—6 ч с момента его начала. Другим ограничивающим моментом является недостаточная диагностическая специфичность сердечных тропонинов: неспецифичный подъем уровня тропонина, как известно, возможен при повреждении миокарда неишемического генеза, а также при декомпенсированной сердечной и почечной недостаточности.

Экспрессия специфичной для миокарда miR-208a значимо меняется в ходе развития повреждения сердечной мышцы [19]. Исходя из этого, чрезвычайно интересной представляется возможность дифференциального диагноза двух форм ОКС: с подъемом cегмента ST (ST Elevation Myocardial Infarction, STEMI) и без подъема сегмента ST (Non ST Elevation Myocardial Infarction, NSTEMI). К 2016 г. имелись результаты 5 исследований, в которых продемонстрированы различия уровней ц-микроРНК у пациентов с NSTEMI и STEMI [3, 5, 9, 11, 18]. В работах исследовались уровни miR-133а, miR-208b [9, 11], miR-499, miR-451 [9] и miR-134 [3] как потенциальных биомаркеров ОИМ. Согласно представленным результатам, пациенты со STEMI имели более высокий уровень этих микроРНК по сравнению с пациентами с NSTEMI. Однако относительно miR-499 результаты были неоднозначными: в 2 представленных работах [3, 11] значимых различий экспрессии микроРНК получено не было.

Комбинация miR-486 и miR-150 продемонстрировала высокие чувствительность и специфичность обоих биомаркеров для идентификации NSTEMI, однако значимых различий экспрессии в группах NSTEMI и STEMI получено не было [18].

По результатам других исследователей была выявлена сниженная экспрессия miR-145 в плазме крови у пациентов со STEMI по сравнению с двумя другими группами (NSTEMI, лица контрольной группы) [5]. При этом miR-223 и miR-320a [9], mir-1 [3, 11], а также 7 других микроРНК [3] не продемонстрировали диагностической значимости для выявления STEMI и NSTEMI в сопоставлении с тропонинами (cTnT и hs-cTnT).

В 3 исследованиях [5, 13, 17] была показана высокая диагностическая ценность ц-микроРНК при сравнении пациентов со стабильным течением ИБС и больных с ОКС. MiR-1, miR-21 и miR-499 [13] достоверно повышали диагностическую ценность высокочувствительного тропонина (hs-Tp), доказанного маркера повреждения миокарда, а в некоторых случаях даже превзошли его по диагностической ценности. Циркулирующие микроРНК miR-1, miR-499 и miR-21значительно увеличивали диагностическую значимость во всех предполагаемых случаях ОКС вне зависимости от факторов риска, особенностей анамнеза, течения и вариантов клинического статуса. Все исследуемые микроРНК были ассоциированы с тяжестью ИБС, при этом сходные результаты были получены в другом исследовании [20], где маркером-кандидатом была miR-145. По результатам одной из работ [17], наибольшую прогностическую и диагностическую ценность имела комбинация miR-132, miR-150 и miR-186. При сравнении этих микроРНК с 4 классическими биомаркерами (hs-TnI, BNP, С-реактивный белок и цистатин С) комбинация вышеперечисленных вариантов микроРНК превосходила их по диагностической значимости.

Также в 3 исследованиях [9, 10, 11] было продемонстрировано, что наибольшей точностью в диагностике ОИМ обладает пара miR-208a/b, оказавшаяся более ранним специфическим маркером ОИМ в сравнении с тропонинами (cTnI и hs-cTnT). При этом другие микроРНК — miR-133a [10, 11], miR-320a [9] и miR-499 [9, 10, 14] также оказались высокочувствительными и специфичными маркерами ОИМ.

Тем не менее два других исследования [9, 10] продемонстрировали несостоятельность miR-451 при сравнении пациентов с нестабильной стенокардией и ОИМ. Еще 3 исследования не показали достоверных диагностических возможностей для маркеров miR-499 [11], miR-320 [15] и miR-16 [10].

Таким образом, по результатам всех публикаций за период 2015—2018 гг. можно сказать, что имеется наиболее изученная группа микроРНК, идентифицированных как диагностически значимые циркулирующие биомаркеры у пациентов с ОИМ: miR-208a [21—32], miR-499 [10, 29—33], miR-133 [10, 22—32] и miR-1 [10, 22—32, 34]. В плазме крови пациентов со STEMI эти ц-микроРНК были диагностически значимо повышены.

Также перспективным в настоящее время направлением является использование микроРНК в дифференциальной диагностике кардиомиопатии Такоцубо, поскольку динамика ЭКГ и сердечные тропонины не являются специфичными в дифференциальной диагностике этой кардиомиопатии и STEMI. В 2 исследованиях [35, 36] уровень mir-133a был достоверно выше у пациентов со STEMI и NSTEMI. Кроме того, этот биомаркер проявил себя еще и как диагностически значимый маркер в дифференциальной диагностике нестабильной стенокардии (НС) и кардиомиопатии Такоцубо.

Также, по данным других исследователей [37, 38], было показано, что miR-499 значимо повышается у пациентов, перенесших интраоперационный ОИМ во время аортокоронарного шунтирования.

Безусловного внимания заслуживают результаты исследования уровней ц-микроРНК (miR-30a и miR-195) при ОИМ. Было показано, что концентрация этих ц-микроРНК значительно возрастала в течение первых 8 ч после ОИМ и затем быстро возвращалась к норме [39]. Циркулирующая miR-122−5p также показала похожую кинетику с максимальной концентрацией через 8 ч после ОИМ [40, 41].

Анализ кинетики ц-микроРНК miR-1291 показал двукратное повышение ее уровня у пациентов с NSTEMI при сравнении с пациентами с STEMI [42]. Сходная кинетика обнаружена при анализе уровней miR-486 и miR-150 в дифференциальном диагнозе пациентов с STEMI и NSTEMI [43].

Также циркулирующие miR-125b-5p и miR-30d-5pо позволили четко дифференцировать ОИМ и НС [44], а ц-микроРНК miR-19a была значимо повышена в плазме крови у пациентов с ОИМ [45]. При этом уровень miR-22, которая участвует в гипертрофии миокарда [46], тоже был увеличен в крови у пациентов с ОИМ [47].

На сегодняшний день также имеются публикации о диагностических возможностях снижения уровней биомаркеров-кандидатов у пациентов с ОИМ. К таким маркерам можно отнести циркулирующие miR-320b и miR-125b [58], miR-26a и miR-191 [49, 59], miR-519e-5p и miR-99a [4, 55]. Плазменная концентрация miR-145 также оказалась значимо сниженной как у пациентов с NSTEMI и STEMI, так и у больных с сердечной недостаточностью [56]. Менее изученными на сегодняшний день являются биомаркеры-кандидаты let-7b и miR-126 [39, 48—54], miR-519e-5p и miR-99a [4, 55], miR-145 [56], диагностическая ценность которых окончательно не ясна.

Поскольку ц-микроРНК относительно стабильны в плазме и сыворотке крови благодаря различным регуляторным механизмам [60, 61], большинство исследователей не исчерпывают потенциал микроРНК только в качестве диагностических биомаркеров ОИМ. С тех пор, как микроРНК были идентифицированы, неоднократно предпринимались попытки их использования в качестве прогностических биомаркеров в постинфарктном периоде.

Среди основной группы ц-микроРНК, идентифицированных у пациентов с ОИМ, miR-133a и miR-208b были первыми, которые ассоциировались со смертностью [11]. Высокий уровень miR-133a и miR-208b был ассоциирован со всеми случаями смертности в течение 6 мес в когорте из 444 человек [11]. Связь повышенного уровня miR-208b и смертности была также показана последующими исследованиями [12, 62]. Более того, высокий уровень miR-499 в плазме крови также был ассоциирован с 30-дневной, 4-месячной, годовой, 2-летней и 6-летней смертностью [12, 62, 63]. Повышение уровня ц-микроРНК miR-155 и miR-380 оказалось ассоциировано с сердечной смертностью [64], а уровни miR-192, miR-194 и miR-34 были значимо повышены в сыворотке крови пациентов, у которых развилась застойная сердечная недостаточность после ОИМ [65]. Высокий уровень miR-145 также был ассоциирован с сердечной смертностью и сердечной недостаточностью у пациентов после ОИМ [66]. Имеются также данные [67] о том, что уровень сывороточной miR-122−5p/133b, определенный во время катетеризации сердца, ассоциирован с высоким риском сердечной смерти.

Несмотря на ощутимые достижения терапии раннего постинфарктного периода и дальнейшую вторичную профилактику, дисфункция левого желудочка (ЛЖ) развивается у таких пациентов довольно часто. Именно поэтому представляется важным поиск биомаркеров, которые позволили бы произвести раннюю стратификацию риска развития сердечной недостаточности и подобрать оптимальную вторичную профилактику.

Было показано, что высокий уровень miR-133a ассоциирован с более низкой выживаемостью пациентов с постинфарктным кардиосклерозом, большим размером инфаркта и более тяжелым повреждением миокарда [68]. Относительно ц-микроРНК miR-1, miR-208b и miR-499 отмечалась обратная зависимость между их концентрацией и фракцией выброса ЛЖ у пациентов, перенесших чрескожное коронарное вмешательство [62, 69].

При масштабном скрининге нескольких ц-микроРНК плазмы крови выявлена ассоциация сниженной концентрации miR-150 с ремоделированием ЛЖ [70]. Кроме того, в дальнейших исследованиях было показано, что панель из четырех ц-микроРНК (miR-16/miR-27a/miR-101/miR-150) обладала прогностической ценностью 66% для ремоделирования ЛЖ после ОИМ [71], что согласуется с повышенными значениями циркулирующих miR-208b, miR-34a, miR-21 и miR-155 у других исследователей [72—74].

На сегодняшний день имеются интересные результаты исследований предиктивных возможностей микроРНК в оценке риска ОИМ у условно здоровых лиц [15, 75]. Результаты статистического анализа 19 микроРНК при когортном исследовании 820 условно здоровых лиц, не предъявляющих каких-либо жалоб, показали, что повышенный уровень ц-miR-126 и сниженные уровни miR-223 и miR-197 в плазме крови были ассоциированы со случаями ОИМ у участников, не имевших ранее диагноза ИБС [15]. В докладе HUNT (The Nord-Trоndelag Health Study) было показано, что комбинация 5 микроРНК (miR-106−5p/miR-424−5p/let-7g-5p/miR-144−3p/miR-660−5p) обладала высокой (77,6%) прогностической ценностью в отношении ОИМ, развившегося у условно здоровых участников, не предъявлявших каких-либо жалоб до развития ОИМ. Используя эту комбинацию микроРНК и показатели Framingham Risk Score, можно значимо (с 0.72 до 0.91) улучшить прогностическую ценность факторов риска [75]. Оба исследования продемонстрировали очевидную перспективность дальнейшего исследования возможностей биомаркеров для прогноза ОКС у условно здоровых лиц.

Необходимо также остановиться на методологических подходах к детекции ц-микроРНК в плазме и сыворотке крови, поскольку некорректные и нестандартизированные методики анализа могут приводить к различиям в полученных результатах у разных исследователей.

Начальным этапом для детекции внеклеточных ц-микроРНК в плазме или сыворотке крови является получение биологического материала для последующего выделения фракции микроРНК. Так как стартовым материалом для получения плазмы и сыворотки является цельная кровь, необходимо организовать забор, процессинг и хранение биоматериала таким образом, чтобы максимально исключить влияние преаналитических процедур. Ключевым критерием при получении плазмы или сыворотки крови для анализа является сведение к минимуму фракции микроРНК, содержащейся в клетках крови и попавшей в плазму или сыворотку вместе с ними или при их разрушении после забора образца крови. МикроРНК в большом количестве содержатся как в ядерных клетках крови, так и тромбоцитах и эритроцитах.

Тип фракционирования плазмы определяет степень эффективности удаления гемопоэтических клеток и, как следствие, может влиять на спектр определяемых ц-микроРНК. C помощью последовательных этапов центрифугирования цельной крови было обнаружено, что супернатант, полученный после первого центрифугирования (1700×G, 10 мин), все еще обогащен клеточными микроРНК по сравнению с супернатантами последующих этапов центрифугирования. После второго этапа (2000×G, 10 мин) и далее не происходит существенного смещения в составе микроРНК [76]. Таким образом, для анализа внеклеточных ц-микроРНК наиболее целесообразным является получение плазмы крови с помощью двухэтапного центрифугирования, при этом второй этап желательно проводить при повышенной скорости центрифугирования (4000—16 000×G) для гарантированного удаления тромбоцитов.

Так как микроРНК содержатся в эритроцитах, степень гемолиза образца плазмы или сыворотки крови может быть ключевым источником вариабельности спектра ц-микроРНК, вызванной условиями получения образца и не связанной с биологическими различиями в составе ц-микроРНК. Коэффициент, количественно отражающий степень гемолиза и не зависящий от содержания липидов в образце, рассчитывается исходя из значений высоты пика оксигемоглобина при длине волны 414 нм и фонового значения при длине 385 нм [77]. Многие из ц-микроРНК, являющиеся биомаркерами заболеваний, содержатся также и в клетках крови, и даже незначительный гемолиз (начиная от 0,008% эритроцитов в объеме плазмы) может увеличивать их содержание до 50 раз.

Выделение микроРНК из плазмы или сыворотки крови производится, как правило, с помощью специализированных наборов, использующих спин-колонки с мембраной из диоксида кремния, способные связывать фракцию мелких РНК в определенных условиях. В выделенную РНК попадают как микроРНК в составе мембранных везикул или связанные с белками или липопротеинами, так и рибосомальная РНК, мРНК, длинные некодирующие РНК, piwi-РНК, т-РНК, мяк-РНК и некоторые другие малые РНК [78]. Для избавления от примесей циркулирующей ДНК используется обработка образца ДНКазой. При выделении РНК из плазмы или сыворотки крови оценка количества микроРНК, попавших в образец, является затруднительной по двум причинам: во-первых, из-за крайне малого общего количества РНК (2—8 нг на 1 мл плазмы); во-вторых, из-за различного соотношения фракции микроРНК к остальным РНК в разных образцах. Для увеличения эффективности выделения фракции малых РНК может быть использовано добавление экзогенного РНК-носителя. Для количественного контроля выделения микроРНК в образец плазмы или сыворотки крови может быть добавлена экзогенная синтетическая микроРНК, не встречающаяся у человека (например, cel-miR-39−3p, аналогичная последовательности микроРНК плоского червя Caenorhabditis elegans). Добавление одинакового заведомо известного количества такой микроРНК на единицу объема плазмы в каждый образец позволяет с некоторым допущением оценивать эффективность выделения микроРНК.

Количественное определение ц-микроРНК может быть произведено с использованием различных методик: ПЦР-детекция отдельных микроРНК или таргетных панелей микроРНК; использование специализированных микрочипов для одновременного определения до нескольких тысяч микроРНК; высокопроизводительное секвенирование фракции малых циркулирующих РНК. ПЦР-детекция отдельных микроРНК является наиболее дешевым и доступным способом в том случае, если количество необходимых для детекции мишеней исчисляется десятками, и применяется в основном в ситуациях, когда ключевые кандидатные микроРНК уже известны и требуют валидации на обширных выборках. Использование микрочиповых технологий оправдано в случае поиска новых биомаркеров микроРНК среди всего спектра микроРНК человека.

Секвенирование фракции малых ц-РНК способно дать наиболее полную информацию о составе микроРНК в исследуемом биологическом объекте, позволяя детектировать новые неизвестные виды и изоформы как микроРНК, так и других РНК. Однако для эффективной и информативной детекции циркулирующей микроРНК методом секвенирования должен быть строго соблюден ряд условий в подготовке образца: недопустимо использование РНК-носителя при выделении малых РНК; из образца РНК необходимо удалять примесь рибосомальной РНК, так как ее наличие сильно уменьшает количество эффективных прочтений микроРНК. Особенностью состава микроРНК плазмы крови является наличие мажорных высокопредставленных микроРНК, в частности hsa-miR-486−5p, составляющих около 60% от общего количества. Поэтому при постановке задачи количественного определения микроРНК в плазме крови с помощью секвенирования крайне важным фактором является обеспечение высокого покрытия для того, чтобы детектировать низкопредставленные кандидатные микроРНК, содержание которых может быть до десятков тысяч раз ниже по сравнению с мажорными видами.

В представленном обзоре показаны результаты исследований диагностических и прогностических возможностей биомаркеров-кандидатов ц-микроРНК, ассоциированных с особенностями течения ИБС. С учетом достоверных различий ц-микроРНК у пациентов с различными формами ИБС и лиц без значимого коронарного атеросклероза можно думать о новых возможностях в первичной и вторичной профилактике сердечно-сосудистых осложнений и оценке риска внезапной сердечной смерти у этих больных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Стоногина Д.А. — Медицинская школа «Медицина будущего», ФГАОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0002–1508-4257;

Аксельрод А.С. — д.м.н., проф., Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0003-3417-794X;

Сыркин А.Л. — д.м.н., проф., Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0002-6452-1222;

Васильев С.В. — аспирант, Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0003-4845-5402;

Желанкин А.В. — к.б.н., Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0002-3014-2005;

Генерозов Э.В. — к.б.н., доц., Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0002–6314-4883

Щекочихин Д.Ю. — к.м.н., доц., Москва, Россия; https://orcid.org/0000-0002-8209-2791.

Стоногина Д.А., Желанкин А.В., Аксельрод А.С., Генерозов Э.В., Щекочихин Д.Ю., Васильев С.В., Сыркин А.Л. Циркулирующие микроРНК как биомаркеры риска сердечно-сосудистых осложнений у больных с ИБС: достижения и трудности последних лет. Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. 2019;12(1):17-24. https://doi.org/10.17116/kardio20191201117