Статины являются самой назначаемой группой гиполипидемических препаратов. Однако около 75% пациентов прекращают прием статинов уже в течение первого года лечения несмотря на то, что многим из них терапия этими лекарственными препаратами показана пожизненно. В первую очередь, это связано с появлением симптомов миалгии и мышечной слабости, частота возникновения которых составляет 7—29%. При этом симптомы мышечной слабости субъективны и неспецифичны и не всегда требуют отмены препарата [1].

В отечественной и зарубежной литературе накоплен большой экспериментальный и клинический материал, посвященный изучению механизмов развития статиновой миопатии. Однако сведения об изменении антиоксидантной системы органов-мишеней при приеме статинов весьма противоречивы. Преобладающим является мнение, что статины оказывают антиоксидантный эффект, повышая активность ферментов антиоксидантной защиты, снижая концентрацию продуктов свободно-радикального окисления. Но в ряде работ убедительно показано прооксидантное влияние аторвастатина в эксперименте [2—4].

Наиболее широко изучены патобиохимические изменения в мышцах и печени при приеме статинов. Миокард является особой разновидностью мышечной ткани и при длительной терапии статинами могут формироваться биохимические изменения, приводящие к ранним нарушениям сократительной функции сердца. Учитывая, что внутриклеточный антиоксидантный статус лежит в основе защитных реакций, целесообразно проанализировать состояние основных звеньев антиоксидантной защиты миокарда в условиях моделирования статиновой миопатии.

Цель исследования — изучение динамики активности ферментов антиоксидантной защиты в миокарде при моделировании лекарственной миопатии, вызванной длительным применением симвастатина.

Материал и методы

Для исследования были взяты беспородные крысы-самцы в возрасте 12—14 мес, массой 300—350 г. Содержание животных осуществлялось в соответствии с Приказом Минздрава РФ №708Н от 23.08.10 «Об утверждении правил лабораторной практики» и санитарными правилами СП 2.2.1.3218—14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) от 29.08.2014». Животные были разделены на 3 группы:

— контрольная группа — 35 крыс в течение 3 мес содержались на стандартном рационе вивария и один раз в день получали 0,5 мл дистиллированной воды через пищеводный зонд;

— группа сравнения — 35 животных, получавших в течение 2 мес симвастатин по 0,0012 г/100 г массы тела один раз в сутки в виде водной суспензии через пищеводный зонд;

— экспериментальные группы — 70 крыс. У животных данных групп индуцировали алиментарную гиперхолестеринемию, путем содержания в течение 3 мес на рационе, обогащенном животными жирами (топленое сливочное масло) и легко усваиваемыми углеводами (тростниковый сахар, манная крупа).

Диагностику гиперхолестеринемии по истечении указанного срока проводили путем определения уровня общего холестерина на анализаторе Bayer (Германия). После чего животные снова были разделены на две равные группы. Животные 1-й группы в течение 2 мес получали рацион без добавления лекарственных препаратов, при этом один раз в день им давали 0,5 мл дистиллированной воды через пищеводный зонд. Животные 2-й группы, в отличие от 1-й группы, в течение 2 мес получали один раз в день симвастатин (Zocor, 20 мг) по 0,0012 г/100 г массы в виде водной суспензии через пищеводный зонд.

Данная работа является частью исследования, одной из целей которого была разработка модели лекарственной миопатии. Поэтому выбрано наиболее гидрофобное лекарственное вещество симвастатин (Zocor, Merck SHARP & Dohme, B.V.).

Расчет дозировки лекарственного вещества производили, ориентируясь на требования Государственной Фармакопеи РФ XVI издания. При выборе доз для исследования безопасности лекарственного вещества на животных рекомендуется брать дозу, которая в 10 раз превышает максимальную терапевтическую дозу (максимальная терапевтическая доза симвастатина у человека составляет 80 мг в сутки). Средний вес взрослого мужчины составляет примерно 80 кг, что соответствует примерно 1 мг/кг массы тела. Исходя из этого, за основу была взята дозировка 10 мг/кг массы тела крыс — «агрессивная доза». При проведении исследования на животных опытным путем была установлена дозировка 0,0012 г/100 г массы тела крысы, которая обеспечила адекватное воспроизведение лекарственной миопатии. На основании полученных результатов был разработан «Способ моделирования миопатии» (патент на изобретение №2632624) [5].

Из эксперимента животных выводили декапитацией. Проведенная работа выполнена в строгом соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.86 и подтвержденной в Страсбурге 15.06.06), и одобрена локальным этическим комитетом ФГБОУ ВПО «Ростовского государственного медицинского университета» МЗ РФ (протокол №21/15 от 10.12.15).

Для исследования использовали миокард животного. Гомогенат миокарда готовили в соотношении 1 г ткани: 9 мл охлажденного физиологического раствора, центрифугирование проводили при 3000 об/мин, для определения активности антиоксидантных ферментов использовали надосадочную жидкость.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) вычисляли с помощью метода, основанного на способности фермента тормозить автоокисление адреналина в щелочной среде при pH=10,2 [6]. Активность каталазы соизмеряли по убыли субстрата — пероксида водорода в единицу времени по реакции с молибденовокислым аммонием [7]. Активность глутатионредуктазы (ГР) определяли по скорости окисления НАДФН₂ [8]. Активность глутатионпероксидазы (ГПО) определяли по изменению содержания восстановленного глутатиона в пробах до и после инкубации с помощью цветной реакции с 5,5-дитиобис(2-нитробензойной) кислотой (5,5-ДТНБК) [8]. Концентрацию восстановленного глутатиона (GSH) определяли методом, в основе которого лежит реакция 5,5-ДТНБК с восстановленным глутатионом [9].

Статистическую обработку полученного материала проводили с использованием программы Statistica 10.0 и Excel Microsoft. О достоверности различий учитываемых показателей сравниваемых групп судили по величине t-критерия Стьюдента после проверки распределения на нормальность критерием Шапиро—Уилка. Различия считались статистически значимыми при p≤0,05. Данные представлены в виде средней и стандартной ошибки средней (M±m).

Результаты и обсуждение

Антиоксидантная система считается одной из важнейших защитных систем организма, предохраняющая от токсического действия активных метаболитов кислорода [10, 11]. Основными ферментами антиоксидантной защиты клетки являются СОД и каталаза, восстановленный глутатион (GSH), ГПО, ГР.

СОД и каталаза образуют антиоксидантную пару, которая превращает супероксидные радикалы в «безвредный» кислород, обеспечивая тем самым первую линию антиоксидантной защиты [12].

Система глутатиона играет ключевую роль в защите клеток и внутриклеточной среды от активных форм кислорода (АФК) [13, 14]. Система глутатиона включает в себя три глутатионзависимых фермента: ГПО, ГР, глутатионтрансферазу (ГТ) [15]. ГПО восстанавливает перекись водорода и органические гидроперекиси жирных кислот соответственно до воды и спирта. Совокупность ферментативных антиоксидантных реакций осуществляется на 4 линиях защиты: 1) восстановление супероксидного анион-радикала до перекиси водорода, катализируемое СОД; 2) восстановление перекиси водорода ГПО и каталазой; 3) органических перекисей жирных кислот ГПО и ГТ; обезвреживание ГТ токсических альдегидов путем конъюгации с GSH [14]. Основная роль GSH заключается в обеспечении функционирования ГПО и ГТ. При этом сам GSH считается эффективным ингибитором АФК, стабилизирует клеточные мембраны, является одним из основных антиоксидантов в митохондриях и обеспечивает защиту клеток с высоким уровнем окислительного фосфорилирования (кардиомиоциты, гепатоциты, нейроны) [12].

Применение симвастатина у животных группы сравнения (интактные животные) привело к снижению активности СОД в сердечной мышце на 77,06% (p<0,0001), в то время как активность каталазы увеличилась на 37,97% (p<0,0001) относительно контрольной группы (табл. 1).

Таблица 1. Активность ферментов супероксиддисмутаза, каталаза в сердечной мышце животных исследуемых групп (M±m)

Примечание. ГХ — гиперхолестеринемия; p — уровень значимости различий относительно показателей контрольной группы; p₁ — уровень значимости различий относительно показателей 1-й группы.

Такие разнонаправленные изменения активности ферментов антиоксидантной защиты свидетельствуют о нарушении сбалансированной работы антиоксидантной пары — СОД и каталаза. Снижение активности СОД является неблагоприятным прогностическим фактором, поскольку супероксидный анион-радикал относится к слабым окислителям и сам по себе опасности не представляет, но в определенных условиях способен превращаться в агрессивный гидроксильный радикал, относящийся к активным окислителям и самым мощным инициаторам перекисного окисления липидов (ПОЛ). При этом повышенная активность каталазы отражает высокую устойчивость этого фермента к внутриклеточным изменениям и может свидетельствовать о сохранении высокой скорости утилизации эндогенной H₂O₂ в реакциях окислительного метаболизма.

Определение активности глутатион-зависимых ферментов в сердечной мышце интактных животных на фоне применения симвастатина выявило статистически значимое повышение концентрации GSH на 60,75% (p<0,0001), а также тенденцию к увеличению активности ГР на 7,5% (p>0,05) и снижение активности ГПО на 3,66% (p>0,05) (табл. 2).

Таблица 2. Активность ферментов системы глутатиона в сердечной мышце животных исследуемых групп (M±m)

Примечание. p — уровень значимости различий относительно показателей контрольной группы; p₁ — уровень значимости различий относительно показателей 1-й группы.

Изменение активности глутатион-зависимых ферментов в миокарде животных данной группы указывает на то, что основную роль в обезвреживании внутриклеточного H₂O₂ берет на себя каталаза, обладающая более высоким сродством к субстрату реакции. При этом повышенное содержание GSH также может быть связано с увеличением генерации H₂O₂, который является аллостерическим индуктором γ-глутамилцистеин-синтетазы [12].

Рассматривая динамику активности ферментов антиоксидантной защиты в миокарде интактных животных можно полагать, что в выбранной дозировке симвастатин проявляет прооксидантные свойства, способствует снижению активности СОД и ГПО, которые считаются основными внутриклеточными антиоксидантами: стабилизируют клеточные мембраны, эффективно обрывают ПОЛ, препятствуют выходу цитохрома C из митохондрий, тем самым предотвращают действие факторов, инициирующих апоптоз клеток при развитии окислительного стресса. При этом сохранение высокой концентрации GSH можно рассматривать как положительный фактор, поскольку восстановленный глутатион относится к эффективным неферментативным антиоксидантам, повышает резистентность клеток к окислению [16].

В группе животных с эссенциальной гиперхолестеринемией (1-я группа) было отмечено значительное увеличение активности каталазы на 79,30% (p<0,0001) и статистически значимое снижение активности СОД на 19,92% (p<0,0001) (табл. 1), резкое увеличение концентрации GSH на 268,07% (p<0,0001), а также статистически значимое увеличение активности ГР на 37,5% (p<0,0001) и снижение активности ГПО на 42,07% (p<0,0001) (табл. 2) относительно контрольной группы.

Алиментарное ожирение характеризуется снижением толерантности к экзогенным липидам, что приводит к длительной гиперлипимической реакции в ответ на прием жирной пищи. Есть мнение, что высокое содержание липидов в крови стимулирует ПОЛ [17]. Полученные данные убедительно доказывают, что алиментарная гиперхолестеринемия способствует снижению эффективности внутриклеточной антиоксидантной защиты. Нарушение внутриклеточных антиоксидантных процессов рассматривается как типовой патофизиологический механизм, запускающий свободно-радикальное повреждение мембранных фосфолипидов и ферментативных транспортных систем, нарушение межклеточных взаимодействий [18].

В миокарде животных с моделируемой гиперхолестеринемией после длительного введения симвастатина (2-я группа) было выявлено дальнейшее снижение активности СОД на 56,28% (p₁<0,0001) и снижение активности каталазы на 38,31% (p₁<0,0001) относительно животных группы 1, которые лекарственный препарат не получали. Относительно контрольной группы активность СОД была снижена на 64,99% (p<0,0001), активность каталазы, напротив, увеличена на 11% (p₁<0,0001) (табл. 1). Полученные данные сигнализируют об усугублении дисбаланса в антиоксидантной паре СОД/каталаза.

Длительное применение симвастатина у животных с гиперхолестеринемией привело к синхронному снижению активности глутатион-зависимых ферментов в миокарде: ГПО на 27,42% (p₁<0,0001), ГР на 50,91% (p₁<0,0001), концентрации GSH на 77,11% (p₁<0,0001) относительно животных 1-й группы, которые лекарственный препарат не получали. Относительно контрольной группы было выявлено снижение активности ГПО на 57,95% (p₁<0,0001), ГР на 32,5% (p₁<0,0001) и концентрации GSH на 15,76% (p₁<0,0001) (табл. 2).

В условиях моделирования алиментарной гиперхолестеринемии симвастатин в выбранной дозировке способствовал усилению дисбаланса ферментативной антиоксидантной защиты кардиомиоцитов. Снижение активности СОД, ГПО, каталазы и концентрации GSH отражает уменьшение резистентности кардиомиоцитов к окислительному повреждению, обусловленному гиперхолестеринемией. Снижение резистентности к окислительному стрессу и сократимости миокарда у крыс под влиянием аторвастатина в дозировке 10 мг/кг [4]. В исследовании T. Nikolic и соавт. показано, что введение экспериментальным животным симвастатина в дозе 5мг/кг/сут в течение 4 недель также проводило к снижению активности ферментов антиоксидантной защиты СОД, каталазы и концентрации GSH [3].

Анализируя результаты, можно сделать вывод, что введение выбранной дозы симвастатина животным с физиологическим течением обменных процессов, а также в условиях моделируемой гиперхолестеринемии, вызывает в миокарде сходные изменения. Общей чертой изменения активности антиоксидантных ферментов является выраженное снижение активности СОД, ГПО и концентрации GSH. Согласно современным представлениям СОД, ГПО и каталаза образуют единую ферментную систему, обеспечивающую устойчивость клеток к окислительному повреждению [14]. Прогрессирующее нарушение основных механизмов антиоксидантной защиты миокарда способствует истощению адаптивного потенциала клеток, постепенной деградации важнейших макромолекул и внутриклеточных структур, нарушению гомеостаза кардиомиоцитов.

Следует отметить, что статиновая миопатия представляется достаточно редким явлением, характеризуется в основном развитием миалгии, которая не требует отмены препарата [19]. При этом прооксидантное действие характерно не для всего класса статинов. В сравнительном исследовании нами установлено, что розувастатин в условиях моделируемой алиментарной гиперхолестеринемии способствует стабилизации внутриклеточной антиоксидантной защиты за счет увеличения активности СОД и ГПО [20].

Заключение

Принимая во внимание полученные нами данные и результаты более ранних исследований, стоит предположить, что при развитии статиновой миопатии миокард, наряду со скелетной мускулатурой, может являться органом-мишенью неблагоприятного побочного действия статинов. Полученные экспериментальные данные могут быть использованы как теоретическая основа для разработки схем метаболической коррекции патобиохимических изменений в миокарде при терапии высокими дозами статинов и появлении признаков статиновой миопатии.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.