Ограниченность выбора лекарственных препаратов и высокий риск развития устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам придают особое значение этой инфекции [1]. В недавней публикации ВОЗ было вновь сказано, что более четверти населения мира инфицировано Mycobacterium tuberculosis [2]. Тем не менее примерно только у 10% инфицированных развивается активная форма туберкулеза, что указывает на врожденный иммунитет, который, вероятно, играет решающую роль в ограничении репликации M. tuberculosis. Чаще всего бактерии могут регулировать экспрессию специфических для хозяина молекул и ослаблять иммунитет хозяина, способствуя выживанию и уклонению от иммунитета [3]. Исследования туберкулеза на биологических моделях позволяют установить ценную и специфическую информацию о природе заболевания (патологии и иммунном ответе).
M. tuberculosis как вид имеет клональную структуру популяции, состоящую из крупных филогенетических линий, меньших генетических семейств и компактных кластеров генетически близких штаммов. Штаммы различных филогенетических линий и генотипов M. tuberculosis различаются по скорости роста in vitro, вирулентности на животных моделях, способности приобретать устойчивость к антибиотикам, трансмиссивность, что в целом определяет их клиническую и/или эпидемиологическую значимость [4]. Среди глобально распространенных генотипов, имеющих значение и для России, следует отметить восточно-азиатскую линию (генотип Beijing) и евро-американскую линию (генотипы LAM, Haarlem, Ural и др.). Последние исследования в Сибири и на Дальнем Востоке выявили два мультирезистентных VNTR-кластера, определяемых на основании международной номенклатуры MIRU-VNTRplus.org как 14717-15 бурятский и 1071-32 омский кластеры. Оба относились к древней сублинии генотипа Beijing (крайне редкой в России) и были ассоциированы с множественной лекарственной устойчивостью [5]. Анализ штаммов этих кластеров in vitro с использованием модели легочной инфекции мышей C57BL/6 показал, что бурятский субтип был гипервирулентным и высоколетальным в сравнении с другими российскими субтипами Beijing, в то время как омский — низколетальным и маловирулентным, что, вероятно, отражает разные пути адаптации микобактерий к хозяину [6].
Цель исследования — на биологической модели определить значимые молекулярные иммуногистохимические маркеры, характеризующие вирулентность бурятского и омского кластеров в легочной ткани.
Материал и методы
Материал исследования составили образцы легочной ткани мышей-самцов линии C57BL/6, полученные при экспериментальном заражении в латеральную хвостовую вену в дозе 106 КОЕ/мышь в 0,2 мл физиологического раствора следующими штаммами M. tuberculosis: референтным лабораторным штаммом H37Rv — 1-я группа, мультирезистентными клиническими штаммами 396 (генотип Beijing 14717-15) — 2-я группа и 6691 (генотип Beijing 1071-32) — 3-я группа [6].
Модельные животные были разделены на 2 серии: первая для исследования вирулентности штаммов и вторая для определения выживаемости. Всего в обеих сериях наблюдали 132 мыши: по 24 особи на каждый из 3 изучаемых штаммов M. tuberculosis с выведением по 6 особей на 14, 21, 60 и 120-й дни после заражения и по 20 особей на каждый изучаемый штамм для исследования естественной гибели после инфицирования. Смертность половины животных во второй серии в 1-й группе наступила к 135-му дню, во 2-й — к 75-му, а в 3-й — к 170-му.
Все процедуры с лабораторными животными были рассмотрены и утверждены независимым этическим комитетом ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России на предмет соответствия ГОСТу Р33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики».
Образцы ткани подвергали фиксации согласно стандартной гистологической схеме, применяли окраску по методу Циля—Нильсена, а также гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили на депарафинизированных и дегидратированных срезах с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода. Для верификации экспрессии использовали первичные антитела: Anti-iNOS antibody [RM1017] (ab283668) 1/1000 Abcam, Великобритания; Anti-TNF alpha antibody (ab34674) 1/25 Abcam, Великобритания; Anti-IL-6 antibody [EPR23819-103] (ab290735) 1/50 Abcam, Великобритания; Anti-IL-12A antibody [EP5737] (ab214433) 1/1200 Abcam, Великобритания. Полученные микропрепараты сканировали с применением сканера препаратов Leica Aperio AT2 с последующим анализом с использованием программного обеспечения Aperio ImageScope и программы ImageJ. При исследовании маркеров определяли относительную площадь экспрессии (отношение площади экспрессии маркера к площади исследуемой ткани).
Статистическую обработку результатов исследования проводили в свободной программной среде R. Проверку соответствия данных нормальному закону распределения осуществляли с помощью критерия Шапиро—Уилка (Shapiro-Wilk’s, W-test). При соответствии данных нормальному закону распределения типичное значение представляли в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±σ), а сравнение групп осуществляли с помощью критерия Стьюдента, при несоответствии — критерия Манна—Уитни. При парном сравнении нулевую гипотезу отклоняли при уровне значимости критерия менее 0,05; при множественном попарном сравнении (три группы) — при значимости критерия менее 0,01.
Результаты и обсуждение
Исследование проводили в несколько этапов. На первом были изучены степень и характер повреждения легочной ткани. Так, на 14-й день во всех группах преимущественно проявлялось экссудативное повреждение (рис. 1). Очаги некроза и нейтрофильная инфильтрация преобладали во 2-й группе (штамм 396).
Рис. 1. Характер и степень повреждения легочной ткани на 14-й день после инфицирования.
а — 1-я группа (штамм H37Rv); б — 2-я группа (штамм 396); в — 3-я группа (штамм 6691). Окраска гематоксилином и эозином, ×10.
На 21-й день исследования во всех группах наблюдались продуктивные изменения в сочетании с деструкцией легочной ткани (рис. 2). В 1-й группе (штамм H37Rv) выявлены мелкие множественные очаги, часть подвержена некротическим изменениям. Во 2-й группе (штамм 396), установлены обширные повреждения легких с развитием гнойно-некротических процессов и деструкцией легочной ткани. В 3-й группе (штамм 6691) зафиксированы гетерогенные изменения: различные по размеру очаги повреждения, степень выраженности некроза и экссудации.
Рис. 2. Характер и степень повреждения легочной ткани на 21-й день после инфицирования.
а — 1-я группа (штамм H37Rv); б — 2-я группа (штамм 396); в — 3-я группа (штамм 6691). Окраска гематоксилином и эозином, ×4.
На 60-й день исследования во всех группах наблюдались выраженные продуктивные изменения. В 1-й группе признаки склероза легочной ткани и деструктивные процессы были единичные. 2-я группа характеризовалась обширными повреждениями с сохранением некротических изменений и нейтрофильной инфильтрацией. В 3-й группе установлены различные по размеру очаги продуктивного воспаления и склероз легочной ткани.
На 120-й день исследования морфологическая картина была стереотипна: продуктивные изменения с преобладанием лимфоцитарных инфильтратов, наблюдались многоядерные клетки и склероз легочной ткани (рис. 3). Отличительной клинической особенностью 2-й группы (штамм 396) для этого периода было сохранение некротических и гнойных изменений.
Рис. 3. Характер и степень повреждения легочной ткани на 120-й день после инфицирования.
а — 1-я группа (штамм H37Rv); б — 2-я группа (штамм 396); в — 3-я группа (штамм 6691). Окраска гематоксилином и эозином, ×20.
На втором этапе исследования была проанализирована относительная площадь повреждения: отношение площади повреждения к площади легочной ткани (табл. 1).
Таблица 1. Относительная площадь повреждения легочной ткани на разных сроках исследования
| Группа (штамм) | Относительная площадь повреждения легочной ткани, % | |||
| 14-й день | 21-й день | 60-й день | 120-й день | |
| 1-я (H37Rv) | 42,2±6,0 | 65,5±8,6 | 68±7,4 | 62,2±8,8 |
| 2-я (396) | 45,2±6,8 | 76,1±8,2 | 63,2±8 | 68,1±7,3 |
| 3-я (6691) | 40,4±5,2 | 72,8±10,1 | 70,8±9 | 71,0±9,3 |
Результаты показали, что относительная площадь повреждения легочной ткани не отличалась по виду штамма. Основные морфологические отличия связаны с преобладанием экссудативного характера повреждения в сочетании с деструкцией легочной ткани (альтеративный тип) или продуктивного типа реакции. 2-я группа (штамм 396) характеризовалась более ранним развитием деструкции и гнойного воспаления легочной ткани, что прослеживается на всех сроках исследования. В 1-й (штамм H37Rv) и 3-й (штамм 6691) группах выявлены схожие морфологические изменения. Напротив, во 2-й группе изменения были более гетерогенны, с большой долей альтеративных проявлений. Применение окраски по Цилю—Нильсену во всех образцах выявило значительную обсемененность легочной ткани по периферии очагов воспаления с малым количеством возбудителей в зонах некроза. Также выявлены отличительные особенности 2-й группы (штамм 396): обилие более крупных палочек, расположенных как в макрофагах, так и свободно лежащих в легочной ткани.
Динамика заболевания во многом зависит от особенностей взаимодействия компонентов, обеспечивающих иммунный ответ. Своеобразным маркером активности распознавания возбудителя может служить индуцибельная NO-синтаза (iNOS). Известно, что высокая восприимчивость к M. tuberculosis связана с недостаточностью экспрессии iNOS и неспособностью активировать дальнейшие каскадные пути с выработкой IL-12 и TNF-α в макрофагах и дендритных клетках [7].
Полученные данные (табл. 2) свидетельствуют об активном синтезе iNOS во всех группах исследования со значимым преобладанием во 2-й группе, что может говорить о развитии активного распознавания возбудителя и гиперреактивного ответа, приводящего в дальнейшем к массивному вторичному повреждению ткани легкого (рис. 4). Уровни экспрессии iNOS оставались высокими на протяжении всего исследования (14—120-й день наблюдения). Это позволило сделать вывод, что экспрессия iNOS как проявление врожденной иммунной реакции зависит от штамма, особенностей компонентов его клеточной стенки или ферментов, изменяющих иммуногенность. Во 2-й группе выявлено значительное повышение iNOS, обладающей высокой антимикробной активностью, что характеризует низкую восприимчивость, однако за счет выработки гиперзначений цитокина происходит выраженное вторичное повреждение легочной ткани с развитием некрозов и гнойного воспаления. При этом в 3-й группе зафиксированы самые низкие показатели iNOS во все периоды наблюдений, что может быть связано с реализацией высокой восприимчивости к данному штамму.
Таблица 2. Относительная площадь экспрессии iNOS
| Группа (штамм) | Относительная площадь экспрессии, % | |||
| 14-й день | 21-й день | 60-й день | 120-й день | |
| 1-я (H37Rv) | 23,2±3,3* | 20,1±2,1* | 15,5±2,1* | 16,2±1,8* |
| 2-я (396) | 46,2±5,1** | 53,2±6,1** | 38,1±3,8** | 50,1±7,2** |
| 3-я (6691) | 20,4±2,5 | 18,3±2 | 13,4±1,6 | 15,2±2,3 |
Примечание. * — p<0,01 при сравнении 1-й и 2-й групп; ** — p<0,01 при сравнении 2-й и 3-й групп.
Рис. 4. Экспрессия iNOS в легочной ткани на 21-й день.
а — 1-я группа (штамм H37Rv); б — 2-я группа (штамм 396); в — 3-я группа (штамм 6691). Иммуногистохимическая реакция, ×400.
TNF-α является критическим провоспалительным цитокином в иммунитете против МБТ и может секретироваться рядом врожденных и адаптивных иммунных клеток. Это ярко продемонстрировано на примере увеличения частоты прогрессирования латентной туберкулезной инфекции у пациентов, получающих лечение анти-TNF-препаратами при воспалительных заболеваниях легких. Известно, что TNF-α имеет решающее значение для поддержания секвестрации инфекции в гранулеме и модуляции апоптотической или некротической гибели клеток [8]. Полученные результаты продемонстрировали наличие статистически значимых различий в уровнях экспрессии TNF-α (табл. 3). В 1-й и 3-й группах отмечалось отсутствие динамики в уровнях экспрессии с изменением клеточного пула, секретирующего данный цитокин. Во 2-й группе установлены высокие значения на 14-й день исследования с последующим дальнейшим снижением экспрессии, что соответствует распространению инфекции по легочной ткани. Окраска по Цилю—Нильсену в этой группе показала обилие кислотоустойчивых бактерий не только в макрофагах, но и располагающихся внеклеточно в легочной ткани. Неспособность локализации в клетках обусловливала быстрое прогрессирование инфекции и гибель животных в данной группе.
Таблица 3. Относительная площадь экспрессии TNF-α в группах сравнения
| Группа (штамм) | Относительная площадь экспрессии, % | |||
| 14-й день | 21-й день | 60-й день | 120-й день | |
| 1-я (H37Rv) | 23,2±2,7* | 25,1±3,7* | 26,1±3,7 | 25,1±3,5 |
| 2-я (396) | 70,5±9,9** | 54,0±7,2** | 24,2±3,6** | 23,2±3,4** |
| 3-я (6691) | 17,8±2,0*** | 20,2±2,7 | 15,4±2,1*** | 15,4±1,6*** |
Примечание. Здесь и в табл. 4, 5: * — p<0,01 при сравнении 1-й и 2-й групп; ** — p<0,01 при сравнении 2-й и 3-й групп, *** — p<0,01 при сравнении 1-й и 3-й групп.
IL-12 синтезируется антигенпредставляющими клетками, дендритными, B-клетками и является важным звеном между врожденной резистентностью и адаптивным иммунитетом. Известно, что дендритные клетки составляют основную популяцию фагоцитов, инфицированных микобактериями туберкулеза через 4 нед после заражения [9]. При заражении дендритные клетки созревают и мигрируют в регионарные лимфатические узлы, чтобы инициировать антигенспецифический T-клеточный ответ.
При оценке уровней экспрессии IL-12 в группах сравнения на 14-й день установлены статистически значимые различия в 1-й (25,1±2,8) и 2-й (30,2±4,1) группах по сравнению с 3-й (15,4±2,3). Это связано с наличием большего количества иммунных клеток, в первую очередь нейтрофилов, как реакции на некроз. С нарастанием повреждения уровень экспрессии возрастает во всех группах (в 1-й — 28,2±3, во 2-й — 40,1±6,0 и в 3-й — 30,2±3,8) с максимумом во 2-й (табл. 4).
Таблица 4. Относительная площадь экспрессии IL-12 в группах сравнения
| Группа (штамм) | Относительная площадь экспрессии, % | |||
| 14-й день | 21-й день | 60-й день | 120-й день | |
| 1-я (H37Rv) | 25,1±2,8 | 28,2±3* | 30,3±3,4 | 28,3±3,2 |
| 2-я (396) | 30,2±4,1** | 40,1±6,0** | 35,2±4,8 | 25,4±2,7 |
| 3-я (6691) | 15,4±2,3*** | 30,2±3,8 | 30,2±3,6 | 27,1±3,8 |
К 60-му дню уровень экспрессии IL-12 выровнялся для всех штаммов (в 1-й группе 30,3±3,4; во 2-й — 35,2±4,8 и в 3-й — 30,2±3,6), оставаясь стабильным и на 120-й день исследования (в 1-й группе 28,3±3,2, во 2-й — 25,4±2,7 и в 3-й — 27,1±3,8). Установленные особенности экспрессии IL-12 вероятнее всего связаны с общими механизмами влияния на адаптивный иммунитет у всех исследованных штаммов вне зависимости от начального уровня цитокина, вырабатываемого мигрирующими иммунными клетками.
Вместе с TNF-α IL-6 считается основным провоспалительным цитокином, важным для защиты от патогенов во время инфекции. Провоспалительные цитокины играют ведущую роль в прогрессировании заболевания и повреждении тканей. Исследования последних лет показали, что IL-6 является важным модулятором эффекторных функций не только B-лимфоцитов, но и CD4 T-клеток, тем самым формируя иммунный ответ и способствуя воспалению [10]. Поскольку IL-6 быстро синтезируется антигенпрезентирующими клетками в ответ на различные раздражители, в опубликованных исследованиях показано, что он может действовать аналогично IL-12 в определении дифференциации наивных CD4 T-клеток в эффекторные и модулировать баланс Th1/Th2 в сторону Th2 [11]. Подмножество Th1 связано с распространенностью инфекции за счет работы TNF-α, IL-2, ИФН-γ. Цитокины Th2 (IL-6, IL-10) в восприимчивости к туберкулезу действуют как ингибиторы аутофагического процесса, ухудшая презентацию антигена, клональную экспансию Т-клеток и, следовательно, организацию гранулем при туберкулезе.
Результаты проведенного исследования показали статистически значимое увеличение уровня экспрессии IL-6 во 2-й группе на 21-й день исследования (в 1-й группе 14,2±1,7, во 2-й — 30,3±3,8 и в 3-й — 12,1±1,6). В то же время в 1-й и 3-й группах был зафиксирован стабильный уровень экспрессии на всех сроках наблюдения (табл. 5).
Таблица 5. Относительная площадь экспрессии IL-6 в группах сравнения
| Группа (штамм) | Относительная площадь экспрессии, % | |||
| 14-й день | 21-й день | 60-й день | 120-й день | |
| 1-я (H37Rv) | 13,1±1,5 | 14,2±1,7* | 15,2±2,0 | 13,2±1,5 |
| 2-я (396) | 12,3±1,7 | 30,3±3,8** | 12,1±1,3 | 14,3±1,9 |
| 3-я (6691) | 11,2±1,4 | 12,1±1,6 | 12,2±1,8 | 12,1±1,7 |
Полученные данные указывают, что IL-6, секретируемый макрофагами, инфицированными микобактериями туберкулеза, снижает способность клеточного иммунного ответа на эрадикацию инфекта. Так, во 2-й группе сравнения выявлены высокие значения уровня экспрессии TNF-α на 14-й день наблюдения, приведшие к повышению уровня IL-6 к 21-му дню и дальнейшему подавлению его выработки микобактериями туберкулеза, что способствовало прогрессированию заболевания.
Заключение
Исследование высоколетального и гипервирулентного бурятского штамма 396 показало, что прогрессирование заболевания и повреждение легочной ткани связаны с высокой реактивностью иммунного ответа, повышенным синтезом NOS и особенностями штамма, блокирующими выработку TNF-α.
Напротив, для низколетального и маловирулентного омского штамма 6691 выявлена низкая реактивность иммунного ответа, статистически значимо меньшие значения относительной площади экспрессии NOS и TNF-α во все периоды наблюдения (14—120 дней).
У всех животных, выживших к 120-му дню, наблюдалась схожая морфологическая картина при различии в уровнях цитокинов, что свидетельствует о нелинейной связи между провоспалительными факторами и субстратом повреждения.
Таким образом, в качестве молекулярных маркеров, характеризующих вирулентность бурятского и омского кластеров М. tuberculosis в легочной ткани, могут выступать iNOS и TNF-α.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Ю.С. Крылова, М.А.Дохов, И.М. Кветной, И.В. Мокроусов
Сбор и обработка материала — Ю.С. Крылова, А.С. Панфилова, Т.И. Виноградова
Статистическая обработка данных — Ю.С. Крылова, М.А.Дохов
Написание текста — Ю.С. Крылова, М.А.Дохов
Редактирование — Ю.С. Крылова, М.А.Дохов, А.С. Панфилова, Т.И. Виноградова, И.В. Мокроусов, И.М. Кветной
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.