Ограниченность выбора лекарственных препаратов и высокий риск развития устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам придают особое значение этой инфекции [1]. В недавней публикации ВОЗ было вновь сказано, что более четверти населения мира инфицировано Mycobacterium tuberculosis [2]. Тем не менее примерно только у 10% инфицированных развивается активная форма туберкулеза, что указывает на врожденный иммунитет, который, вероятно, играет решающую роль в ограничении репликации M. tuberculosis. Чаще всего бактерии могут регулировать экспрессию специфических для хозяина молекул и ослаблять иммунитет хозяина, способствуя выживанию и уклонению от иммунитета [3]. Исследования туберкулеза на биологических моделях позволяют установить ценную и специфическую информацию о природе заболевания (патологии и иммунном ответе).

M. tuberculosis как вид имеет клональную структуру популяции, состоящую из крупных филогенетических линий, меньших генетических семейств и компактных кластеров генетически близких штаммов. Штаммы различных филогенетических линий и генотипов M. tuberculosis различаются по скорости роста in vitro, вирулентности на животных моделях, способности приобретать устойчивость к антибиотикам, трансмиссивность, что в целом определяет их клиническую и/или эпидемиологическую значимость [4]. Среди глобально распространенных генотипов, имеющих значение и для России, следует отметить восточно-азиатскую линию (генотип Beijing) и евро-американскую линию (генотипы LAM, Haarlem, Ural и др.). Последние исследования в Сибири и на Дальнем Востоке выявили два мультирезистентных VNTR-кластера, определяемых на основании международной номенклатуры MIRU-VNTRplus.org как 14717-15 бурятский и 1071-32 омский кластеры. Оба относились к древней сублинии генотипа Beijing (крайне редкой в России) и были ассоциированы с множественной лекарственной устойчивостью [5]. Анализ штаммов этих кластеров in vitro с использованием модели легочной инфекции мышей C57BL/6 показал, что бурятский субтип был гипервирулентным и высоколетальным в сравнении с другими российскими субтипами Beijing, в то время как омский — низколетальным и маловирулентным, что, вероятно, отражает разные пути адаптации микобактерий к хозяину [6].

Цель исследования — на биологической модели определить значимые молекулярные иммуногистохимические маркеры, характеризующие вирулентность бурятского и омского кластеров в легочной ткани.

Материал и методы

Материал исследования составили образцы легочной ткани мышей-самцов линии C57BL/6, полученные при экспериментальном заражении в латеральную хвостовую вену в дозе 10⁶ КОЕ/мышь в 0,2 мл физиологического раствора следующими штаммами M. tuberculosis: референтным лабораторным штаммом H37Rv — 1-я группа, мультирезистентными клиническими штаммами 396 (генотип Beijing 14717-15) — 2-я группа и 6691 (генотип Beijing 1071-32) — 3-я группа [6].

Модельные животные были разделены на 2 серии: первая для исследования вирулентности штаммов и вторая для определения выживаемости. Всего в обеих сериях наблюдали 132 мыши: по 24 особи на каждый из 3 изучаемых штаммов M. tuberculosis с выведением по 6 особей на 14, 21, 60 и 120-й дни после заражения и по 20 особей на каждый изучаемый штамм для исследования естественной гибели после инфицирования. Смертность половины животных во второй серии в 1-й группе наступила к 135-му дню, во 2-й — к 75-му, а в 3-й — к 170-му.

Все процедуры с лабораторными животными были рассмотрены и утверждены независимым этическим комитетом ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии» Минздрава России на предмет соответствия ГОСТу Р33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики».

Образцы ткани подвергали фиксации согласно стандартной гистологической схеме, применяли окраску по методу Циля—Нильсена, а также гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проводили на депарафинизированных и дегидратированных срезах с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода. Для верификации экспрессии использовали первичные антитела: Anti-iNOS antibody [RM1017] (ab283668) 1/1000 Abcam, Великобритания; Anti-TNF alpha antibody (ab34674) 1/25 Abcam, Великобритания; Anti-IL-6 antibody [EPR23819-103] (ab290735) 1/50 Abcam, Великобритания; Anti-IL-12A antibody [EP5737] (ab214433) 1/1200 Abcam, Великобритания. Полученные микропрепараты сканировали с применением сканера препаратов Leica Aperio AT2 с последующим анализом с использованием программного обеспечения Aperio ImageScope и программы ImageJ. При исследовании маркеров определяли относительную площадь экспрессии (отношение площади экспрессии маркера к площади исследуемой ткани).

Статистическую обработку результатов исследования проводили в свободной программной среде R. Проверку соответствия данных нормальному закону распределения осуществляли с помощью критерия Шапиро—Уилка (Shapiro-Wilk’s, W-test). При соответствии данных нормальному закону распределения типичное значение представляли в виде среднего значения и стандартного отклонения (M±σ), а сравнение групп осуществляли с помощью критерия Стьюдента, при несоответствии — критерия Манна—Уитни. При парном сравнении нулевую гипотезу отклоняли при уровне значимости критерия менее 0,05; при множественном попарном сравнении (три группы) — при значимости критерия менее 0,01.

Результаты и обсуждение

Исследование проводили в несколько этапов. На первом были изучены степень и характер повреждения легочной ткани. Так, на 14-й день во всех группах преимущественно проявлялось экссудативное повреждение (рис. 1). Очаги некроза и нейтрофильная инфильтрация преобладали во 2-й группе (штамм 396).

Рис. 1. Характер и степень повреждения легочной ткани на 14-й день после инфицирования.

а — 1-я группа (штамм H37Rv); б — 2-я группа (штамм 396); в — 3-я группа (штамм 6691). Окраска гематоксилином и эозином, ×10.

На 21-й день исследования во всех группах наблюдались продуктивные изменения в сочетании с деструкцией легочной ткани (рис. 2). В 1-й группе (штамм H37Rv) выявлены мелкие множественные очаги, часть подвержена некротическим изменениям. Во 2-й группе (штамм 396), установлены обширные повреждения легких с развитием гнойно-некротических процессов и деструкцией легочной ткани. В 3-й группе (штамм 6691) зафиксированы гетерогенные изменения: различные по размеру очаги повреждения, степень выраженности некроза и экссудации.

Рис. 2. Характер и степень повреждения легочной ткани на 21-й день после инфицирования.

а — 1-я группа (штамм H37Rv); б — 2-я группа (штамм 396); в — 3-я группа (штамм 6691). Окраска гематоксилином и эозином, ×4.

На 60-й день исследования во всех группах наблюдались выраженные продуктивные изменения. В 1-й группе признаки склероза легочной ткани и деструктивные процессы были единичные. 2-я группа характеризовалась обширными повреждениями с сохранением некротических изменений и нейтрофильной инфильтрацией. В 3-й группе установлены различные по размеру очаги продуктивного воспаления и склероз легочной ткани.

На 120-й день исследования морфологическая картина была стереотипна: продуктивные изменения с преобладанием лимфоцитарных инфильтратов, наблюдались многоядерные клетки и склероз легочной ткани (рис. 3). Отличительной клинической особенностью 2-й группы (штамм 396) для этого периода было сохранение некротических и гнойных изменений.

Рис. 3. Характер и степень повреждения легочной ткани на 120-й день после инфицирования.

а — 1-я группа (штамм H37Rv); б — 2-я группа (штамм 396); в — 3-я группа (штамм 6691). Окраска гематоксилином и эозином, ×20.

На втором этапе исследования была проанализирована относительная площадь повреждения: отношение площади повреждения к площади легочной ткани (табл. 1).

Таблица 1. Относительная площадь повреждения легочной ткани на разных сроках исследования

Результаты показали, что относительная площадь повреждения легочной ткани не отличалась по виду штамма. Основные морфологические отличия связаны с преобладанием экссудативного характера повреждения в сочетании с деструкцией легочной ткани (альтеративный тип) или продуктивного типа реакции. 2-я группа (штамм 396) характеризовалась более ранним развитием деструкции и гнойного воспаления легочной ткани, что прослеживается на всех сроках исследования. В 1-й (штамм H37Rv) и 3-й (штамм 6691) группах выявлены схожие морфологические изменения. Напротив, во 2-й группе изменения были более гетерогенны, с большой долей альтеративных проявлений. Применение окраски по Цилю—Нильсену во всех образцах выявило значительную обсемененность легочной ткани по периферии очагов воспаления с малым количеством возбудителей в зонах некроза. Также выявлены отличительные особенности 2-й группы (штамм 396): обилие более крупных палочек, расположенных как в макрофагах, так и свободно лежащих в легочной ткани.

Динамика заболевания во многом зависит от особенностей взаимодействия компонентов, обеспечивающих иммунный ответ. Своеобразным маркером активности распознавания возбудителя может служить индуцибельная NO-синтаза (iNOS). Известно, что высокая восприимчивость к M. tuberculosis связана с недостаточностью экспрессии iNOS и неспособностью активировать дальнейшие каскадные пути с выработкой IL-12 и TNF-α в макрофагах и дендритных клетках [7].

Полученные данные (табл. 2) свидетельствуют об активном синтезе iNOS во всех группах исследования со значимым преобладанием во 2-й группе, что может говорить о развитии активного распознавания возбудителя и гиперреактивного ответа, приводящего в дальнейшем к массивному вторичному повреждению ткани легкого (рис. 4). Уровни экспрессии iNOS оставались высокими на протяжении всего исследования (14—120-й день наблюдения). Это позволило сделать вывод, что экспрессия iNOS как проявление врожденной иммунной реакции зависит от штамма, особенностей компонентов его клеточной стенки или ферментов, изменяющих иммуногенность. Во 2-й группе выявлено значительное повышение iNOS, обладающей высокой антимикробной активностью, что характеризует низкую восприимчивость, однако за счет выработки гиперзначений цитокина происходит выраженное вторичное повреждение легочной ткани с развитием некрозов и гнойного воспаления. При этом в 3-й группе зафиксированы самые низкие показатели iNOS во все периоды наблюдений, что может быть связано с реализацией высокой восприимчивости к данному штамму.

Таблица 2. Относительная площадь экспрессии iNOS

Примечание. * — p<0,01 при сравнении 1-й и 2-й групп; ** — p<0,01 при сравнении 2-й и 3-й групп.

Рис. 4. Экспрессия iNOS в легочной ткани на 21-й день.

а — 1-я группа (штамм H37Rv); б — 2-я группа (штамм 396); в — 3-я группа (штамм 6691). Иммуногистохимическая реакция, ×400.

TNF-α является критическим провоспалительным цитокином в иммунитете против МБТ и может секретироваться рядом врожденных и адаптивных иммунных клеток. Это ярко продемонстрировано на примере увеличения частоты прогрессирования латентной туберкулезной инфекции у пациентов, получающих лечение анти-TNF-препаратами при воспалительных заболеваниях легких. Известно, что TNF-α имеет решающее значение для поддержания секвестрации инфекции в гранулеме и модуляции апоптотической или некротической гибели клеток [8]. Полученные результаты продемонстрировали наличие статистически значимых различий в уровнях экспрессии TNF-α (табл. 3). В 1-й и 3-й группах отмечалось отсутствие динамики в уровнях экспрессии с изменением клеточного пула, секретирующего данный цитокин. Во 2-й группе установлены высокие значения на 14-й день исследования с последующим дальнейшим снижением экспрессии, что соответствует распространению инфекции по легочной ткани. Окраска по Цилю—Нильсену в этой группе показала обилие кислотоустойчивых бактерий не только в макрофагах, но и располагающихся внеклеточно в легочной ткани. Неспособность локализации в клетках обусловливала быстрое прогрессирование инфекции и гибель животных в данной группе.

Таблица 3. Относительная площадь экспрессии TNF-α в группах сравнения

Примечание. Здесь и в табл. 4, 5: * — p<0,01 при сравнении 1-й и 2-й групп; ** — p<0,01 при сравнении 2-й и 3-й групп, *** — p<0,01 при сравнении 1-й и 3-й групп.

IL-12 синтезируется антигенпредставляющими клетками, дендритными, B-клетками и является важным звеном между врожденной резистентностью и адаптивным иммунитетом. Известно, что дендритные клетки составляют основную популяцию фагоцитов, инфицированных микобактериями туберкулеза через 4 нед после заражения [9]. При заражении дендритные клетки созревают и мигрируют в регионарные лимфатические узлы, чтобы инициировать антигенспецифический T-клеточный ответ.

При оценке уровней экспрессии IL-12 в группах сравнения на 14-й день установлены статистически значимые различия в 1-й (25,1±2,8) и 2-й (30,2±4,1) группах по сравнению с 3-й (15,4±2,3). Это связано с наличием большего количества иммунных клеток, в первую очередь нейтрофилов, как реакции на некроз. С нарастанием повреждения уровень экспрессии возрастает во всех группах (в 1-й — 28,2±3, во 2-й — 40,1±6,0 и в 3-й — 30,2±3,8) с максимумом во 2-й (табл. 4).

Таблица 4. Относительная площадь экспрессии IL-12 в группах сравнения

К 60-му дню уровень экспрессии IL-12 выровнялся для всех штаммов (в 1-й группе 30,3±3,4; во 2-й — 35,2±4,8 и в 3-й — 30,2±3,6), оставаясь стабильным и на 120-й день исследования (в 1-й группе 28,3±3,2, во 2-й — 25,4±2,7 и в 3-й — 27,1±3,8). Установленные особенности экспрессии IL-12 вероятнее всего связаны с общими механизмами влияния на адаптивный иммунитет у всех исследованных штаммов вне зависимости от начального уровня цитокина, вырабатываемого мигрирующими иммунными клетками.

Вместе с TNF-α IL-6 считается основным провоспалительным цитокином, важным для защиты от патогенов во время инфекции. Провоспалительные цитокины играют ведущую роль в прогрессировании заболевания и повреждении тканей. Исследования последних лет показали, что IL-6 является важным модулятором эффекторных функций не только B-лимфоцитов, но и CD4 T-клеток, тем самым формируя иммунный ответ и способствуя воспалению [10]. Поскольку IL-6 быстро синтезируется антигенпрезентирующими клетками в ответ на различные раздражители, в опубликованных исследованиях показано, что он может действовать аналогично IL-12 в определении дифференциации наивных CD4 T-клеток в эффекторные и модулировать баланс Th1/Th2 в сторону Th2 [11]. Подмножество Th1 связано с распространенностью инфекции за счет работы TNF-α, IL-2, ИФН-γ. Цитокины Th2 (IL-6, IL-10) в восприимчивости к туберкулезу действуют как ингибиторы аутофагического процесса, ухудшая презентацию антигена, клональную экспансию Т-клеток и, следовательно, организацию гранулем при туберкулезе.

Результаты проведенного исследования показали статистически значимое увеличение уровня экспрессии IL-6 во 2-й группе на 21-й день исследования (в 1-й группе 14,2±1,7, во 2-й — 30,3±3,8 и в 3-й — 12,1±1,6). В то же время в 1-й и 3-й группах был зафиксирован стабильный уровень экспрессии на всех сроках наблюдения (табл. 5).

Таблица 5. Относительная площадь экспрессии IL-6 в группах сравнения

Полученные данные указывают, что IL-6, секретируемый макрофагами, инфицированными микобактериями туберкулеза, снижает способность клеточного иммунного ответа на эрадикацию инфекта. Так, во 2-й группе сравнения выявлены высокие значения уровня экспрессии TNF-α на 14-й день наблюдения, приведшие к повышению уровня IL-6 к 21-му дню и дальнейшему подавлению его выработки микобактериями туберкулеза, что способствовало прогрессированию заболевания.

Заключение

Исследование высоколетального и гипервирулентного бурятского штамма 396 показало, что прогрессирование заболевания и повреждение легочной ткани связаны с высокой реактивностью иммунного ответа, повышенным синтезом NOS и особенностями штамма, блокирующими выработку TNF-α.

Напротив, для низколетального и маловирулентного омского штамма 6691 выявлена низкая реактивность иммунного ответа, статистически значимо меньшие значения относительной площади экспрессии NOS и TNF-α во все периоды наблюдения (14—120 дней).

У всех животных, выживших к 120-му дню, наблюдалась схожая морфологическая картина при различии в уровнях цитокинов, что свидетельствует о нелинейной связи между провоспалительными факторами и субстратом повреждения.

Таким образом, в качестве молекулярных маркеров, характеризующих вирулентность бурятского и омского кластеров М. tuberculosis в легочной ткани, могут выступать iNOS и TNF-α.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Ю.С. Крылова, М.А.Дохов, И.М. Кветной, И.В. Мокроусов

Сбор и обработка материала — Ю.С. Крылова, А.С. Панфилова, Т.И. Виноградова

Статистическая обработка данных — Ю.С. Крылова, М.А.Дохов

Написание текста — Ю.С. Крылова, М.А.Дохов

Редактирование — Ю.С. Крылова, М.А.Дохов, А.С. Панфилова, Т.И. Виноградова, И.В. Мокроусов, И.М. Кветной

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.