Ивина А.А.

Кафедра патологической анатомии медицинского факультета ФГБОУ ВПО "Российский университет дружбы народов"

Семкин В.А.

Отделение хирургической стоматологии ФГБУ "Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии" Минздрава РФ, Москва

Хабадзе З.С.

ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов», Москва, Россия

Бабиченко И.И.

кафедра патологической анатомии Российского университета дружбы народов, Москва, Россия, 117198

Иммуногистохимическое исследование экспрессии белков Ki-67, PHH3 и CK15 при малигнизации эпителия слизистой оболочки рта

Журнал: Архив патологии. 2019;81(5): 30-34

Просмотров : 102

Загрузок : 5

Как цитировать

Ивина А. А., Семкин В. А., Хабадзе З. С., Бабиченко И. И. Иммуногистохимическое исследование экспрессии белков Ki-67, PHH3 и CK15 при малигнизации эпителия слизистой оболочки рта. Архив патологии. 2019;81(5):30-34. https://doi.org/10.17116/patol20198105130

Авторы:

Ивина А.А.

Кафедра патологической анатомии медицинского факультета ФГБОУ ВПО "Российский университет дружбы народов"

Все авторы (4)

В настоящее время во многих странах мира отмечается рост заболеваемости плоскоклеточным раком (ПР) слизистой оболочки рта (СОР). Развитию П.Р. предшествует возникновение потенциально злокачественного заболевания СОР [1]. Термин «потенциально злокачественные заболевания» (ПЗЗ) предложен Центром сотрудничества по изучению рака и предраковых заболеваний СОР при ВОЗ. Его используют для всех предраковых состояний и образований, однако не при всех заболеваниях, попавших в эту группу, происходит злокачественная трансформация [2]. Наиболее часто встречаемые ПЗЗ СОР это — лейкоплакия, эритроплакия и плоский лишай. При лейкоплакии гистологические изменения могут варьировать от эпителиальной гиперплазии с гиперкератозом (ЭГ), дисплазии (плоскоклеточная внутриэпителиальная неоплазия – Squamous Intraepithelial Neoplasia — SIN) и рака in situ (Carcinoma in situ — CIS) до инвазивного плоскоклеточного рака СОР [1, 3]. Злокачественная трансформация в ПР при ЭГ и SIN в среднем составляет 10—20% [1]. По данным Н. Lumerman и соавт. [4], SIN переходит в рак в 6,6—36% случаев. Однако в 50% случаев ПР развивается на фоне клинически неизмененной слизистой оболочки, без предшествующей патологии [5]. Тщательное диспансерное наблюдение в первые 2 года после выявления ЭГ или SIN является важным звеном в предотвращении развития ПР СОР [1]. Большое значение имеет ранняя диагностика перехода потенциально злокачественного образования в злокачественное – рак in situ, так как это влияет на выбор метода лечения [6]. Адекватное и своевременное лечение способствует улучшению качества и продолжительности жизни пациентов [7]. При П.Р. СОР 5-летняя выживаемость за последние 30 лет существенно не изменилась и составляет около 50% [1], поэтому поиск новых диагностических критериев малигнизации эпителия является актуальной задачей. Пролиферация опухолевых клеток — это индикатор неоплазии, который может считаться дополнительным прогностическим индикатором, определяется при использовании маркера Ki-67 [8]. Оценка митотической активности при помощи белка РНН3 является стандартной процедурой для определения степени малигнизации [9]. В свою очередь при различных злокачественных опухолях отмечаются изменения экспрессии цитоплазматического белка цитокератина 15 [10].

Цель исследования — изучить особенности экспрессии белков Ki-67, РНН3 и цитокератина 15 в клетках СОР и зависимость от степени ее злокачественной трансформации.

Материал и методы

В работе использовали операционный материал из отделения хирургической стоматологии, архивный материал из лаборатории патологической анатомии ФГБУ «ЦНИИС и ЧЛХ» Минздрава России, полученный за период с 2010 по 2018 г. Исследовали биоптаты СОР 69 пациентов (38 женщин и 31 мужчина; средний возраст 67,9 года) с клиническим диагнозом: лейкоплакия и плоскоклеточный рак СОР. В 17 (24,6%) случаях на основании гистологического исследования установлен диагноз ЭГ, в 21 (30,4%) случае — плоскоклеточная внутриэпителиальная неоплазия (Squamous Intraepithelial Neoplasia — SIN), в 7 (10,1%) случаях — рак in situ (Carcinoma in situ — CIS). В 24 (34,8%) случаях при морфологическом исследовании выявлен ПР СОР.

Гистологическое и иммуногистохимическое исследования биопсийного материала проводили в соответствии со стандартным протоколом [11]. Тканевые антигены определяли с помощью мышиных моноклональных антител к Ki-67 (ММ1, Diagnostic Biosystems), кроличьих поликлональных антител к фосфогистону Н3 (РНН3) (Cell Marque) и мышиных моноклональных антител к цитокератину 15 (СК15) (ЕР14, Epitomics). Для визуализации антигенов использовали систему QUANTO на основе пероксидазы хрена и диаминобензидина.

Индекс пролиферации (ИП) по Ki-67 определяли по процентному отношению клеток с иммунореактивными ядрами к общему числу клеток. Для анализа митотической активности (МА) по РНН3 использовали процентное отношение количества митозов к общему числу клеток. Экспрессию белка СК15 эпителиальными клетками оценивали по интенсивности окрашивания цитоплазмы: 0 — нет реакции; 1 — слабое окрашивание; 2 — умеренное окрашивание; 3 — интенсивное окрашивание.

Большая часть пролиферирующих клеток при ЭГ, SIN и CIS локализована в нижних 2/3 эпителия, поэтому оценку экспрессии белков Ki-67 и СК15 проводили в 300 клетках двух зон эпителия: 1-я — ростковая зона (мальпигиев слой), к которой относятся базальный слой и 2 вышележащих ряда клеток, и 2-я зона — шиповатый слой. При П.Р. СОР выделены центральная и периферическая зоны опухоли. Периферическую зону ПР сравнивали с ростковым слоем при ЭГ, SIN и CIS, а центральную зону ПР — с шиповатым слоем эпителия. МА клеток исследовали без деления на зоны от базальной мембраны до зернистого слоя. Подсчет клеток проводили при увеличении 400.

Для количественной оценки результатов проводили морфометрические исследования. Статистический анализ осуществляли при помощи программы STATISTICA 10.0 в среде Windows 7. С помощью W-критерия Шапиро—Уилка установлено ненормальное распределение полученных показателей, при этом указывались медианы (Me), 25-й и 75-й процентили признаков (Q1; Q3). Проверку неоднородности выборок осуществляли с помощью Н-критерия Краскела—Уоллиса. Достоверность различия отдельных выборок определяли с помощью U-критерия Манна—Уитни, различия считали статистически значимыми при р<0,05. Корреляционные отношения между ИП и МА клеток, а также между ИП клеток и синтезом белка СК15 оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

Исследование пролиферативной активности по ядерному белку Ki-67 при ЭГ показало наличие иммунопозитивных клеток только в ростковом слое (см. рисунок,

Динамика злокачественной трансформации многослойного плоского эпителия слизистой оболочки рта. а—г — эпителиальная гиперплазия; д—з — плоскоклеточная интраэпителиальная неоплазия; и—м — рак in situ; н—р — плоскоклеточный рак. а, д, и, н — окраска гематоксилином и эозином; б, е, к, о — ИГХ-реакция с маркером Ki-67; в, ж, л, п — ИГХ-реакция с маркером РНН3; г, з, м, р — ИГХ-реакция с маркером СК15. ИГХ-окрашивание — ДАБ-гематоксилин Майера, ×100.
а, б). При SIN и CIS во всех случаях пролиферация клеток установлена как в мальпигиевом слое эпителия, так и в шиповатом (см. рисунок, д, е, и, к). При П.Р. пролиферация клеток выявлена по периферии и в центре солидных образований (см. рисунок, н, о). Количественные показатели представлены в таблице.
Послойное распределение пролиферирующих клеток, митозов и белка СК15 при эпителиальной гиперплазии, плоскоклеточной внутриэпителиальной неоплазии, раке in situ и плоскоклеточном раке СОР Примечание. Достоверные различия: * — между 1-й и 2-й группами (р<0,01), 1—3 (р<0,05) и 1—4 (р<0,01); ● — между группами 1—2, 1—3 и 1—4 (р<0,01); ♦ — между группами 1—3, 1—4, 2—3 и 2—4 (р<0,01); ♠ — между группами 1—2, 2—3 и 2—4 (р<0,01).

Митотическую активность изучали с использованием ядерного белка фосфогистона Н3. При Э.Г., SIN и CIS митозы выявлены в зонах пролиферации клеток (см. рисунок, в, ж, л). Количественные показатели представлены в таблице.

Поскольку белок СК15 является цитоплазматическим, при ИГХ-исследовании отмечали окрашивание цитоплазмы эпителиоцитов в коричневый цвет. При Э.Г. установлено интенсивное окрашивание только клеток мальпигиевого слоя, в вышележащих слоях реакция отсутствовала либо была слабой (см. рисунок, г). При SIN все клеточные слои были интенсивно окрашены (см. рисунок, з). Для CIS отмечено снижение интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток как мальпигиевого, так и шиповатого стоя, однако отмечали единичные клетки с выраженной цитоплазматической ИГХ-реакцией (см. рисунок, м). Подобную ИГХ-картину наблюдали и при ПР СОР (см. рисунок, р). Количественные показатели представлены в таблице. В 9 (37,5%) случаях низкодифференцированного ПР реакция отсутствовала.

Из представленных в таблице данных видно, что при дисплазии эпителия СОР пролиферирующие клетки появляются в шиповатом слое, отмечается также увеличение пролиферативной активности клеток в ростковом слое. Митотическая активность клеток во всех исследуемых группах достоверно не различается. Наиболее выраженная экспрессия белка СК15 наблюдается при SIN СОР с интенсивным окрашиванием цитоплазмы во всех слоях. При CIS резко снижается экспрессия этого белка в ростковом и шиповатом слоях, а при ПР она полностью отсутствует в центральной зоне и резко снижена в периферической.

При проведении рангового дисперсионного анализа пролиферативной активности клеток в исследуемых группах Н-критерий составил 19,03 (p<0,01) для мальпигиевого слоя и 38,35 (p<0,01) для шиповатого, что указывает на неоднородность сравниваемых показателей.

Достоверные различия пролиферативной активности клеток в мальпигиевом слое отмечали между ЭГ и SIN (U=99,5; p<0,01), ЭГ и CIS (U=28,0; p<0,048), также в мальпигиевом слое при ЭГ и периферической зоне при ПР СОР (U=32,0; p<0,01). При сравнении других групп различия были недостоверны (см. таблицу). В шиповатом слое достоверные отличия пролиферативной активности эпителиальных клеток установлены между ЭГ и SIN (U=8,5; p<0,01), ЭГ и CIS (U=0; p<0,01), подобные различия были достоверны между шиповатым слоем при ЭГ и центральной зоной ПР СОР (U=0; p<0,01). В других исследуемых группах различия по маркеру Ki-67 были недостоверны (см. таблицу).

При проведении рангового дисперсионного анализа митотической активности клеток в исследуемых группах Н-критерий составил 2,134 (p=0,54), что указывает на однородность сравниваемых показателей и отсутствие достоверных различий между ними (см. таблицу).

Ранговый дисперсионный анализ экспрессии белка СК15 установил неоднородность сравниваемых показателей в группах по критерию Краскела—Уоллиса. Для мальпигиевого слоя Н-критерий составил 58,97 (p<0,01) и для шиповатого — 59,48 (p<0,01).

В интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток по белку СК15 в мальпигиевом слое достоверные различия установлены между ЭГ и SIN (U=42,0; p<0,01), ЭГ и CIS (U=0; p<0,01), SIN и CIS (U=0; p<0,01), также в мальпигиевом слое при ЭГ и периферической зоне при ПР (U=0; p<0,01) и SIN и ПР (U=0; p<0,01). При сравнении CIS и ПР различия были недостоверны (см. таблицу). В шиповатом слое достоверные различия выявлены между ЭГ и SIN (U=0; p<0,01), SIN и CIS (U=0; p<0,01), а также в шиповатом слое при SIN и центральной зоне при ПР (U=0; p<0,01). В других исследуемых группах достоверных различий не выявлено (см. таблицу).

При исследовании корреляционных отношений установлена достоверная умеренная положительная корреляция между ИП в шиповатом слое и МА при SIN (r=0,76, p<0,05), достоверная сильная положительная корреляция между ИП в шиповатом слое и МА при CIS (r=0,96; p<0,05) и достоверная умеренная положительная корреляция между ИП и интенсивностью окрашивания цитоплазмы по белку СК15 в шиповатом слое при SIN (r=0,48; p<0,05). При изучении зависимости интенсивности окрашивания цитоплазмы клеток по белку СК15 от их пролиферативной активности установлена слабая отрицательная корреляция (r=–0,258; p<0,05). Более выраженные корреляционные отношения установлены между ИП в шиповатом слое и МА (r=0,431; p<0,05) по сравнению с мальпигиевым слоем (r=0,291; p<0,05).

Повышение пролиферативной активности клеток является одним из важных звеньев патогенеза опухолевого роста. Белок Ki-67 считается универсальным маркером пролиферирующих клеток. Известно, что пролиферативная активность эпителиоцитов повышается как в базальном слое, так и в шиповатом в процессе опухолевой трансформации клеток СОР. Маркеры М.А., которые выявляются в определенных фазах клеточного цикла, дают возможность лучше прогнозировать течение заболевания, чем маркер Ki-67, который окрашивает ядра во всех фазах пролиферации, кроме G0 [11]. Для этого можно использовать белок фосфогистон Н3, появляющийся в позднюю G2- и М-фазу клеточного цикла. Гистон 3 — это ядерный белок, который вместе с другими гистонами формирует основную часть хроматина эукариотической клетки. Маркер РНН3 специфично выявляет гистон Н3 только в процессе его фосфорилирования в серин 10 или серин 28 [9]. Мы провели исследование МА в эпителии СОР на разных этапах малигнизации, которое не выявило достоверных различий во всех исследуемых группах.

Цитокератины (кератины) — белки, которые формируют промежуточные филаменты цитоскелета во всех эпителиальных клетках и функционируют как супрамолекулярный каркас, соединяя цитоплазму с мембраной собственной и соседних клеток [12]. Их особенностью является способность к полимеризации в филаменты без участия вспомогательных белков. Кератиноциты многослойного плоского эпителия в митотически активном базальном слое всегда экспрессируют пару К5/К14. В процессе дифференцировки базальные кератиноциты выходят из клеточного цикла и двигаются в поверхностные слои эпителия. В мигрирующих на поверхность эпителия клетках подавляется экспрессия белков К5/К14 и активируется экспрессия другой пары кератиноцитов в зависимости от типа ткани. В ороговевающем эпителии кожи и десны дифференцированные кератиноциты экспрессируют пару белков К1/К10, тогда как в неороговевающем многослойном плоском эпителии — пару К4/К13. СК15 относится к I типу кератинов, который не имеет белка-партнера из II типа белков. Известно, что в неизмененном эпителии экспрессия СК15 отмечается только в клетках базального слоя [13], а изменения его экспрессии отмечаются при различных злокачественных опухолях [10]. В настоящем исследовании установлены увеличение экспрессии данного белка по мере нарастания диспластических изменений в эпителии СОР и значительное ее снижение при П.Р. Возможно, появление большого количества белка СК15 при SIN связано с перемещением эпителиальных клеток от базальной мембраны к поверхности без должной дифференцировки, что характерно для диспластических процессов в целом [7]. При CIS и ПР количество белка СК15 в цитоплазме резко снижается, а при низкодифференцированном ПР этот белок полностью отсутствует в опухолевых клетках. Подобный процесс, помимо опухолевого роста, возможен в период эмбриогенеза и при заживлении ран. При опухолевом росте данную закономерность можно объяснить феноменом эпителиально-мезенхимальной трансформации, в процессе которой опухолевые эпителиальные клетки приобретают свойства мезенхимальных клеток, которые обладают способностью инфильтрировать. При этом образуются подвижные клетки вместо жестко сцепленных межклеточными связями эпителиальных клеток [11].

Заключение

В настоящем исследовании установлены повышение пролиферации, а также значительное снижение экспрессии белка СК15 в эпителии СОР при раке in situ и плоскоклеточном раке по сравнению с плоскоклеточной внутриэпителиальной неоплазией. Таким образом, белок СК15 может быть использован для дифференциальной диагностики между дисплазией высокой степени и малигнизацией эпителия СОР на стадии рака in situ и плоскоклеточным раком.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — И.И.Б., А.А.И.

Сбор и обработка материала — В.А.С., З.С.Х.

Статистическая обработка — И.И.Б., А.А.И.

Написание текста — И.И.Б., А.А.И., В.А.С., З.С.Х.

Редактирование — И.И.Б.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Ивина А.А. — https://orcid.org/0000-0001-8387-4413;

Семкин В.А. — https://orcid.org/0000-0002-0615-8779;

Хабадзе З.С. — https://orcid.org/0000-0002-7257-5503;

Бабиченко И.И. — https://orcid.org/ 0000-0001-5512-6813

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Ивина А.А., Семкин В.А., Хабадзе З.С., Бабиченко И.И. Иммуногистохимическое исследование экспрессии белков Ki-67, PHH3 и CK15 при малигнизации эпителия слизистой оболочки рта. Архив патологии. 2019;81(5):30-34. https://doi.org/10.17116/patol20198105130

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail