Лактотрофные аденомы гипофиза — ЛАГ (синонимы: пролактинсекретирующие аденомы, пролактиномы) наиболее распространены среди гормонально активных опухолей и составляют около 40% всех новообразований аденогипофиза [1, 2]]. До 80% пролактином представляют собой микроаденомы диаметром менее 1 см [3]. В настоящее время основным методом лечения пролактином является терапия агонистами дофамина. В результате медикаментозного лечения данной группой препаратов в большинстве случаев отмечаются нормализация уровня пролактина (ПРЛ) в крови и регрессия опухоли [4]. Однако механизм влияния медикаментов на опухолевую ткань in vivo недостаточно изучен. Известно, что агонисты дофамина вызывают биологический эффект, связываясь с дофаминовыми рецепторами 2-го типа (ДР₂) опухолевых клеток. Полагают [5], что резистентность больных к терапии агонистами дофамина обусловлена низкой экспрессией ДР₂. Известна статистическая значимость индекса пролиферации Ki-67 как маркера агрессивного роста аденом гипофиза [6]. В литературе [7] имеются сведения о наличии в тканях ЛАГ эстрогеновых рецепторов. Встречаются единичные работы, в которых приводятся данные о применении препаратов из групп аналогов соматостатина [8], селективных модуляторов эстрогеновых рецепторов [9], темозоломида [10]. Современные методы консервативного и хирургического лечения больных с ЛАГ требуют теоретического обоснования. Поэтому представляет интерес изучение иммуногистохимических особенностей ПРЛ, резистентных к лечению агонистами дофамина, и в частности экспрессии ДР₂, эстрогеновых рецепторов, маркеров пролиферации и ангиогенеза.

Цель исследования — анализ гистологической и иммуногистохимической характеристики ЛАГ, резистентных к лечению агонистами дофамина.

В исследование включили 19 пациентов (13 женщин и 6 мужчин) с пролактиномами, резистентными к лечению агонистами дофамина. Резистентность к терапии агонистами дофамина оценивали как отсутствие нормализации уровня ПРЛ в сыворотке крови и/или уменьшения размера аденомы на 50% у пациентов, получавших лечение каберголином в недельной дозе 3 мг и более в течение не менее 6 мес.

По результатам магнитно-резонансной томографии (МРТ) и с использованием представленной далее классификации J. Hardy все опухоли были разделены на инвазивные и неинвазивные. Неинвазивным аденомам соответствовали степени 1 и 2А, инвазивным — степени 3 и 4 (А—Е).

Классификация аденом гипофиза по J. Hardy:

Степень 1 — эндоселлярная микроаденома;

Степень 2 — эндоселлярная макроаденома, полностью заполняющая полость турецкого седла;

Степень 3 — макроаденома с локальной деструкцией дна турецкого седла;

Степень 4 — макроаденома с тотальным разрушением турецкого седла.

Подразделение по группам при параселлярном росте аденомы:

D — интракраниальное (интрадуральное);

E — латеральное распространение в кавернозный синус.

Морфологический анализ операционного материала включал гистологический и иммуногистохимический (ИГХ) методы исследования. Гистологическое исследование проведено по стандартной схеме с окрашиванием гематоксилином и эозином. Срезы для ИГХ-исследования были нанесены на стекла с адгезивным покрытием, депарафинированы, выдержаны в 3% растворе перекиси водорода в течение 10 мин для подавления активности эндогенной пероксидазы, затем термически обработаны в цитратном буфере (pH 6,0) в микроволновой печи в течение 15 мин для восстановления антигенов опухолевой ткани. Далее срезы промывали в дистиллированной воде и фосфатном буфере, после чего на них наносили первичные антитела к ПРЛ, соматотропному (СТГ), тиреотропному (ТТГ), лютеинизирующему (ЛГ), фолликуло-стимулирующему (ФСГ), адренокортикотропному (АКТГ) гормонам, ДР₂, эстрогеновому рецептору-α (ЭРα), маркеру клеточной пролиферации Ki-67, маркеру ангиогенеза CD34. Инкубация с первичными антителами составила 40 мин при температуре 37 °C. После отмывания в фосфатном буфере на срезы наносили вторичные антитела к кроличьим и мышиным иммуноглобулинам, связанные с системой визуализации, не содержащей биотин, на 30 мин при температуре 37 °C. После отмывания вторичных антител в фосфатном буфере срезы окрашивали диаминобензидином в течение 5 мин. На последнем этапе проводили окрашивание клеточных ядер гематоксилином, затем обезвоживали срезы и заключали их в синтетическую среду.

Иммуноэкспрессия тропных гормонов была оценена в цитоплазме опухолевых клеток, ДР₂ — в цитоплазме и на мембране опухолевых клеток, Ki-67, ЭРα — в ядрах клеток аденом, CD34 — в цитоплазме эндотелиальных клеток сосудов опухолей. Участки некроза, выраженного фиброза, кровоизлияния, гиперплазии аденогипофиза были исключены из анализа. Иммуногистологическую реакцию на СТГ считали положительной при окрашивании более 50% опухолевых клеток, на ПРЛ — более 30%. Такой метод оценки выбран для исключения ложноположительных результатов, связанных с возможным попаданием клеток аденогипофиза во время транссфеноидальной аденомэктомии в исследуемый материал. Проценты отражают долю, которую составляют соматотрофы и лактотрофы от всех клеток нормального гипофиза [11]. Иммуноэкспрессию ДР₂ считали положительной при окраске более 30% опухолевых клеток в 10 полях зрения при 40-кратном увеличении микроскопа. Иммуноэкспрессия ЭРα оценена полуколичественным методом по формуле a+b, где a — количество окрашенных клеток: 0 — отсутствие окраски, 1 балл — единичные клетки, 2 балла — до ¹/₁₀ всех клеток, 3 балла — ¹/₁₀—1/3 клеток, 4 балла — 1/3—2/3 клеток, 5 баллов — более 2/3 клеток; b — интенсивность окрашивания, выраженная в баллах: 0 баллов — реакция отсутствует, 1 балл — слабая, 2 балла — умеренная, 3 балла — выраженная. При сумме баллов 3 и более результат окрашивания считали положительным. Значение индекса пролиферации Ki-67 вычисляли как среднее число положительно окрашенных ядер в поле зрения микроскопа (×40)при исследовании не менее 5 полей зрения. Количество сосудов опухоли определяли, подсчитав среднее число сосудов в препаратах, окрашенных на CD34, в 5 полях зрения при 40-кратном увеличении микроскопа.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием пакета прикладных программ Microsoft Office Excel 2010, Statistica for Windows v.10. Количественные данные приведены в виде медианы и квартилей — Me (Q25;Q75), качественные признаки — в виде долей. Сравнительный анализ независимых групп по количественному признаку проведен с использованием критерия Манна—Уитни, по качественному признаку — с использованием двустороннего точного критерия Фишера. Взаимосвязь изучаемых признаков определена с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Клиническая характеристика пациентов приведена в таблице.

Диагноз аденомы гипофиза во всех случаях подтвержден результатами гистологического исследования. Участки фиброза выявлены в 2 (10,5%) аденомах, отек стромы наблюдали в 2 (10,5%). Единичные митозы найдены в 5 (26%) опухолях, полиморфизм ядер — в 5 (26%) наблюдениях. Псаммомные тельца обнаружены в опухолях у 5 (26%) больных.

При ИГХ-исследовании у всех пациентов подтвержден диагноз ЛАГ на основании положительной иммуноэкспрессии ПРЛ (см. рисунок,

Положительная иммунореакция с антителами к ДР₂ обнаружена в 8 (42%) случаях (см. рисунок, в), ЭРα — в 6 (32%) (см. рисунок, г). У 6 (32%) пациентов не выявлено экспрессии ни одного из исследованных клеточных рецепторов. При сравнительном анализе данных у пациентов с положительной и отрицательной иммунореакцией на ДР₂ не найдено различий по таким клиническим характеристикам, как пол, возраст, длительность заболевания, объем опухоли и характер ее распространения, уровень ПРЛ в крови, доза каберголина.

В нашем исследовании ЛАГ характеризовались низкой пролиферативной активностью. Маркер опухолевой пролиферации Ki-67 у 12 (63%) из 19 случаев имел нулевые значения, у 7 (37%) из 19 случаев варьировал от 1 до 8% — 0 (0; 1), причем у 3 (16%) он составил более 3% (см. рисунок, д). Уровень Ki-67 был статистически значимо выше у пациентов с супраселлярным (p=0,047) или ретроселлярным (р=0,022) распространением опухоли. Найдена положительная корреляция между уровнями Ki-67 и ПРЛ в крови в дебюте заболевания (r=0,59; p=0,008). При этом не обнаружена зависимость между иммуноэкспрессией Ki-67 и полом, возрастом больных, длительностью заболевания, объемом аденомы и инвазивным ростом опухоли, а также связи между иммуноэкспрессией Ki-67 и такими гистологическими характеристиками, как наличие митозов, полиморфизм ядер, количество сосудов.

С целью оценки ангиогенеза аденомы мы провели исследование с помощью антител к маркеру сосудистого эндотелия CD34 (см. рисунок, е). Медиана количества сосудов составила 37 (25, 85). Выявлено, что у пациентов с параселлярным распространением опухоли, по данным МРТ, количество сосудов в аденоме больше, чем у больных без параселлярного роста аденомы — 85 (44; 97) против 32 (22; 38); р=0,001, а также при наличии инвазии в кавернозные синусы количество сосудов статистически значимо больше — 76 (44; 93) против 32 (24; 47); р=0,04). В нашем исследовании не выявлено зависимости иммуноэкспрессии CD34 от пола, возраста больных, длительности заболевания, размера опухоли, предоперационного уровня ПРЛ, наличия митозов, полиморфизма ядер клеток аденомы, уровня Ki-67.

Сочетанная иммуноэкспрессия ПРЛ и СТГ без клинико-лабораторных проявлений акромегалии встречается в ЛАГ [12]. Возможно, это связано с общей клеткой-предшественницей, из которой в присутствии эстрогенов происходит развитие лактотрофной клетки, а в отсутствие эстрогенов по умолчанию формируется соматотрофная клетка.

I. Pellegrini и соавт. [5] и A. Gurlek и соавт. [6] полагают, что основной причиной развития резистентности является отсутствие ДР₂ на мембране лактотрофов. Однако результаты настоящего исследования не могут полностью подтвердить эту теорию: ДР₂ присутствовали в 42% наблюдений. Кроме того, в исследовании S. Shimazu и соавт. [13] показано, что при ИГХ-исследованиии показатели иммуноэкспрессии ДР₂ статистически значимо не различались у пациентов с разной степенью ответа на медикаментозное лечение агонистами дофамина. В том же исследовании авторы, определив уровень мРНК ДР_2, обнаружили, что он ниже у резистентных, чем у чувствительных к терапии агонистами дофамина, пациентов. Таким образом, показано несоответствие результатов двух методов исследования ДР₂, что находит подтверждение и в других работах. L. Stefaneanu и соавт. [14] провели параллельно определение экспрессии ДР₂ при ИГХ-исследовании ткани аденомы и определение мРНК и показали, что лечение бромокриптином сопровождалось увеличением уровня мРНК ДР₂ при отрицательной иммуногистологической реакции; это указывает на стабильность мРНК. Аналогичные данные были получены при наблюдении больного с питуитарной карциномой, резистентной к агонистам дофамина, с внутри- и экстракраниальными метастазами. Наличие мРНК ДР₂ и белка ДР₂ изучали иммуногистологическим методом: мРНК ДР₂ была обнаружена в первичных опухолевых и метастатических тканях, тогда как белок ДР₂ выявлялся только в хирургически удаленной первичной опухоли гипофиза, но не в метастазах [15]. Авторы продемонстрировали отсутствие белка ДР₂ при ИГХ-исследовании, несмотря на сохранение транскрипта на поздней стадии злокачественной ЛАГ. Результаты работ [13—15] позволяют предположить, что механизмы посттранскрипции могут способствовать развитию резистентности к агонистам дофамина.

Эстрогеновые рецепторы обнаружены во многих тканях, в том числе в аденогипофизе [16]. В нашем исследовании резистентные к агонистам дофамина опухоли экспрессировали ЭРα в 1/3 случаев. Аналогичный показатель у G. Kaptain и соавт. [17] составляет 72%, однако они не учитывали степень ответа на лечение агонистами дофамина, кроме того, в описании работы не указан тип исследованных эстрогеновых рецепторов — α или β.

В. Manoranjan и соавт. [18] при проведении ИГХ-исследовании у 75 пациентов с аденомами гипофиза выявили значительное преобладание повышенной экспрессии ЭРα в макроаденомах по сравнению с микроаденомами и в неинвазивных аденомах по сравнению с инвазивными опухолями. E. Delgrange и соавт. [19], показали, что низкая экспрессия ЭРα ассоциируется с инвазивным ростом ЛАГ и резистентностью к лечению агонистами дофамина, и предлагают рассматривать отсутствие экспрессии ЭРα как вероятный показатель неблагоприятного прогноза.

Изучив резистентные к агонистам дофамина ЛАГ, мы не обнаружили связи между иммуноэкспрессией ЭРα и инвазивным ростом аденомы, по данным МРТ. Анализ различий иммуноэкспрессии у пациентов с микро- и макроаденомами не проводили, так как в 95% случаев пациенты, которым выполнено ИГХ-исследование, имели макроаденомы.

Пролиферативная активность клеток в настоящем исследовании определена с помощью индекса пролиферации Ki-67, который считается наиболее достоверным показателем клеточной пролиферации в аденомах гипофиза. Сравнительное исследование E. Delgrange и соавт. [20] показало более высокий индекс пролиферации Ki-67 у резистентных к агонистам дофамина пациентов по сравнению с чувствительными. Мы не проводили такой анализ, однако выявили положительную корреляцию между уровнем Ki-67 и уровнем ПРЛ в сыворотке крови в дебюте заболевания. Более высокий уровень ПРЛ у пациентов с резистентностью к агонистам дофамина [21] косвенно отражает тот факт, что индекс пролиферации Ki-67 выше в резистентных ЛАГ по сравнению с чувствительными.

Согласно данным литературы [22], не существует единого определения агрессивности аденом гипофиза. В клинической картине пролактином наиболее важными факторами являются резистентность к агонистам дофамина и высокая частота рецидивов после операции. Радиологическим признаком агрессивности аденом считается наличие инвазивного роста опухоли в смежные структуры, такие как кавернозный синус. В основе разрастания и инвазии опухоли лежит увеличение пролиферации клеток, митотической активности, клеточной адгезии. Известна статистическая значимость индекса пролиферации Ki-67 как маркера агрессивного роста аденом гипофиза [6]. Нами не найдено связи между уровнем Ki-67 и наличием инвазивного роста (по данным МРТ) аденомы, однако уровень Ki-67 был выше у пациентов с супра- или ретроселлярным ростом аденомы. Наши результаты согласуются с результатами других исследований, в которых также не обнаружено существенной разницы индекса пролиферации Ki-67 в зависимости от распространения опухоли, по данным МРТ [23], а также от размера аденомы [24].

В настоящем исследовании показана связь между маркером ангиогенеза и клиническими признаками агрессивного поведения ЛАГ: количество сосудов, оцененное с помощью CD34, оказалось статистически значимо больше в опухолях с параселлярным ростом, а также при распространении аденомы в кавернозные синусы, при которых хирургическое лечение часто не достигает успеха. Мы не обнаружили зависимости между иммуноэкспрессией маркеров ангиогенеза и показателем пролиферации, измеренным с помощью антител к Ki-67, что подтверждается данными других исследований [25].

Лактотрофные аденомы гипофиза, резистентные к агонистам дофамина, могут экспрессировать соматотропный гормон, характеризуются умеренной иммуноэкспрессией дофаминовых рецепторов 2-го типа и эстрогеновых рецепторов α, низкой пролиферативной активностью, повышенным ангиогенезом в аденомах с параселлярным ростом и инвазией в кавернозные синусы. Выявление в ткани аденомы эстрагеновых рецепторов α открывает новые возможности для консервативного лечения резистентных к агонистам дофамина лактотрофных аденом гипофиза.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Ю.А., Л.К.Д., И.И.Д.

Сбор и обработка материала — Н.С.Ф., Л.К.Д.

Статистическая обработка — Н.С.Ф., Е.А.П.

Написание текста — Н.С.Ф.

Редактирование — А.Ю.А., Л.К.Д., Е.А.П., И.И.Д.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Федорова Наталья Сергеевна — асп. отд. нейроэндокринологии и остеопатий; e-mail: fedorova.n.s.12@gmail.com; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-9816-5043

Абросимов А.Ю. — https://orcid.org/0000-0001-8284-9996

Дзеранова Л.К. — https://orcid.org/0000-0002-0327-4619

Пигарова Е.К. — https://orcid.org / 0000-0001-6539-466X

Дедов И.И. — https://orcid.org /0000-0002-8175-7886