Экспрессия клаудинов-1, 3, 4 в раке и полипах толстой кишки

Клаудины — семейство трансмембранных белков, относящихся к белкам плотных контактов. Семейство клаудинов состоит как минимум из 24 белков массой 2—27 кД. Белки плотных контактов играют ключевую роль в неопластических процессах, поскольку они участвуют в формировании единого сигнального пути между внеклеточным матриксом и внутриклеточным цитоскелетом [1]. В плотных контактах злокачественных клеток часто наблюдаются структурные и функциональные аномалии, проявляющиеся в изменении уровня экспрессии различных типов клаудинов [2]. Известно, что клаудины-1, 2, 3 и 5 активируют про-MMP-2, которая, как предполагается, вовлечена в процессы инвазии и метастазирования [3].

Для некоторых типов рака, например рака предстательной железы, поджелудочной железы и яичника, характерно увеличение экспрессии белков клаудинов-3 и 4 [4, 5]. Для гепатоцеллюлярной карциномы и почечно-клеточного рака, напротив, характерно снижение уровня клаудинов-4 и 5 [6]. Клаудин-1 является потенциальной мишенью β-катенин/Tcf-сигнального пути, поэтому обсуждается роль его дизрегуляции в возникновении колоректального рака [7], однако в литературе приведены противоречивые данные об уровне экспрессии клаудина-1 в аденокарциномах толстой кишки. Больший консенсус достигнут относительно экспрессии клаудинов-3 и 4 в колоректальном раке, хотя количество работ, посвященных этим маркерам, существенно меньше. Подавляющее большинство авторов отмечают снижение экспрессии этих маркеров и корреляцию со стадией, низкой степенью дифференцировки, лимфоваскулярной инвазией, метастатическим поражением лимфатических узлов, наличием отдаленных метастазов и худшим прогнозом [8, 9]. В единичных работах приводятся данные об увеличении экспрессии клаудина-4 в колоректальном раке и об активации им матриксных металлопротеиназ [10].

Единичные исследования посвящены оценке экспрессии клаудинов разных типов в полипах толстой кишки. В связи с выделением ВОЗ новой группы зубчатых образований [11] представляется интересным сравнить уровень экспрессии клаудинов в разных типах полипов толстой кишки, а также сравнить этот уровень с экспрессией в колоректальном раке.

Целью настоящего исследования явилась оценка уровня экспрессии клаудинов в аденокарциноме толстой кишки и сравнение его с уровнем экспрессии в полипах толстой кишки.

В работе использован операционный и биопсийный материал, полученный от 118 пациентов с новообразованиями толстой кишки. В исследование не входил материал от больных, которым в предоперационном периоде проводили лучевую или химиотерапию. Возраст пациентов варьировал от 30 до 86 лет (в среднем 61,1 года). Для исследования отбирался материал, содержащий в одном фрагменте новообразование и прилежащую интактную слизистую оболочку.

В исследуемую выборку включен материал от 32 больных раком толстой кишки с гистологическим типом «аденокарцинома» (критериями исключения явились аденоплоскоклеточный и коллоидный рак) и от 86 больных с полипами, которые были классифицированы согласно критериям ВОЗ 2010 г.: аденома тубулярная (АТ) — 18 образцов, аденома тубуловорсинчатая (ATV) — 16, аденома ворсинчатая (AV) — 3, гиперпластический полип (HP) — 13, зубчатая аденома на широком основании (SSA) — 19, традиционная зубчатая аденома (TSA) — 17 образцов (рис. 1).

Ворсинчатые аденомы ввиду их малочисленности были исключены из дальнейшего анализа.

Иммуногистохимическое исследование проводили с поликлональными антителами к белкам плотных контактов клаудинами-1, 3, 4 (RTU, «Thermo Scientific», Англия).

Существуют разные системы оценки экспрессии клаудинов 1, 3 и 4 [9, 12, 13]. Мы использовали систему G. Sheehan и соавт. (2007), поскольку она является наиболее полной [5]. В новообразовании отдельно оценивалась интенсивность окрашивания (И) по шкале 0=0; 1=1+; 2=2+; 3=3+) и количество прореагировавших клеток (К) по шкале 0=0%; 1=<25%; 2=25—50%; 3=>51%). Итоговый балл (ИБ) формировался по формуле ИБ = И∙К и выражался в единицах от 0 до 9. ИБ в диапазоне от 0 до 3 расценивался как слабая реакция; от 4 до 6 — как умеренная, от 7 до 9 — как выраженная. Дополнительно оценивалось количество прореагировавших клеток и интенсивность окрашивания в интактной слизистой оболочке с формированием итогового балла слизистой оболочки (ИБс), который также выражался в единицах от 0 до 9. Сравнительный балл (СБ) вычислялся по формуле СБ = ИБ – ИБс.

Во всех 115 случаях наблюдалась выраженная мембранная реакция клаудинов-1, 3 и 4 в интактной слизистой оболочке (рис. 2, а). Среднее значение ИБс в каждой группе полипов и рака приближалось к максимальному (табл. 1). ИБ в новообразованиях варьировал от 0 до 9, СБ во всех 115 случаях оказался отрицательным, в связи с чем экспрессия клаудинов в раке и полипах толстой кишки расценивалась как пониженная, что соотносится с мировыми данными [14]. В связи с этим принято решение для статистической обработки данных учитывать только ИБ в новообразованиях.

Клаудин-1. Отрицательная реакция наблюдалась только в 1 из 115 случаев. В группах «рак», ATV, SSA чаще всего наблюдалась умеренная реакция, в группах АТ, HP — слабая реакция, а в группе TSA — выраженная или умеренная реакция в примерно равном количестве случаев. Распределение выраженности реакции, а также средние значения ИБ новообразований во всех группах приведены в табл. 2.

Клаудин-3. Отрицательная реакция наблюдалась в 6 из 115 случаев. В группах «рак», ATV, SSA и TSA чаще всего наблюдалась умеренная реакция, в группах АТ, HP — низкая реакция. Распределение выраженности реакции клаудина-3, а также средние значения ИБ новообразований во всех группах приведены в табл. 3. Обращает внимание однонаправленность распределения выраженности экспрессии клаудинов-1 и 3 в исследуемых группах (см. табл. 2, 3) с разными превалирующими компонентами: умеренной в группах «рак», ATV, SSA и низкой в группах АТ, HP. В группе TSA выраженная и умеренная экспрессия клаудина-1 обнаруживалась приблизительно с равной частотой, а экспрессия клаудина-3 в большинстве случаях оказалась умеренной, однако равенство абсолютных значений показателей и отсутствие статистически значимой разницы между ними позволяет считать данную разницу незначительной (рис. 3, 4).

Клаудин-4. Отрицательной реакции выявлено не было, слабая реакция наблюдалась в малом количестве случаев. Чаще всего во всех группах, кроме АТ, выявлена выраженная реакция клаудина-4. В группе АТ чаще всего наблюдалась умеренная реакция. Распределение выраженности реакции клаудина-4, а также средние значения ИБ новообразований во всех группах приведены в табл. 4. Обращаем внимание, что однонаправленности распределения клаудина-4 и клаудинов других типов не наблюдалось, что может косвенно свидетельствовать о его иной роли в развитии новообразований толстой кишки или особом механизме регуляции.

В большинстве случаев реакция с клаудинами-1, 3 и 4 в раке и полипах толстой кишки имела мембранную локализацию, как и в интактной слизистой оболочке толстой кишки.

В группе «рак» наблюдалась умеренная отрицательная взаимосвязь между уровнем экспрессии клаудина-1 и степенью злокачественности аденокарциномы, т. е. чем выше степень злокачественности, тем ниже уровень экспрессии клаудина-1 (p=0,004). Данная корреляция представляется логичной, поскольку снижение экспрессии клаудина-1 свидетельствует об уменьшении его количества на мембране клеток, что ассоциировано с уменьшением количества функционирующих плотных контактов, нарушением избирательной парацеллюлярной проницаемости, потерей полярности клеток, увеличением их подвижности, инвазией в окружающие ткани и, как следствие, — с увеличением степени злокачественности опухоли. Эти данные соотносятся с результатами других авторов, которые отмечали снижение экспрессии клаудина-1 в колоректальном раке, раке простаты и других локализаций [5]. В исследовании M. Shibutani [13] посредством мультивариантного анализа показано, что низкая экспрессия клаудина-1 является самостоятельным фактором возникновения рецидива. Во многих работах также исследуются возможные корреляции между уровнем экспрессии клаудина-1 и размером опухолевого узла, глубиной опухолевой инвазии, вовлечением лимфатических узлов, стадией опухолевой прогрессии, наличием отдаленных метастазов и снижением общей и безрецидивной выживаемости [9, 13, 15, 16]. Однако в нашем исследовании данные взаимосвязи проследить не удалось.

Стоит также указать, что в ряде работ отмечается положительная взаимосвязь уровня экспрессии клаудина-1 и степени злокачественности аденокарциномы, что объясняется авторами активацией матриксных металлопротеиназ (ММР) [17]. Авторы предполагают, что повышенная экспрессия клаудина-1 инициирует опухолевый рост за счет активации MMP, что было доказано in vitro [10]. Однако инактивация миРНК клаудинов не приводила к полному ингибированию MMP-2, что свидетельствует о наличии альтернативного пути активации MMP [18].

Между исследованными нами шестью группами новообразований толстой кишки достоверных различий по экспрессии клаудинов-1, 3 и 4 выявлено не было, в связи с чем для улучшения репрезентативности выборки принято решение укрупнить группы. Тубулярные, тубуловорсинчатые аденомы и традиционные зубчатые аденомы были включены в группу «классические (conventional) аденомы» (51 случай), а гиперпластические полипы и зубчатые аденомы на широком основании — в группу «зубчатые образования» (32 случая). Группа «рак» осталась без изменений. При проведении статистической обработки данных выявлены следующие особенности.

Самый низкий уровень экспрессии клаудина-1 наблюдался в зубчатых образованиях (среднее значение 3,6), самый высокий уровень — в аденокарциномах (5,8). Между этими группами выявлена достоверная статистическая разница (p<0,05). В группе «классические аденомы» среднее значение экспрессии клаудина-1 составило 5,1. Между группами «классические аденомы» и «зубчатые образования» также выявлена достоверная статистическая разница (p<0,05), между группами «рак» и «классические аденомы» статистически значимой разницы выявлено не было (рис. 5).

Аналогичная корреляция наблюдалась для клаудина-3. Самый высокий уровень экспрессии клаудина-3 наблюдался в классических аденомах (среднее значение 4,8), близкий к нему уровень выявлялся в группе «рак» (4,6). Уровень экспрессии в зубчатых образованиях оказался достоверно ниже (среднее значение 2,9; p<0,05). Также в группе «классические аденомы» наблюдалась положительная взаимосвязь уровня экспрессии клаудина-1 и размера полипа (чем больше полип, тем выше уровень экспрессии клаудина-1; r=0,35). Аналогичная связь наблюдалась в этой же группе между уровнем экспрессии клаудина-3 и размером полипа (r=0,32) (рис. 6). В группе «зубчатые образования» подобных корреляций выявить не удалось.

Таким образом, экспрессия клаудинов-1 и 3 указывает на отличие зубчатых образований от классических аденом и рака, что может объясняться собственным «зубчатым» путем канцерогенеза, о чем сообщается во многих статьях [19, 20]. Достоверной разницы в экспрессии клаудинов 1 и 3 между раком и классическими аденомами выявлено не было. С одной стороны, это может быть связано с общностью их путей развития, с другой — можно предположить, что клаудины не определяют потенциал злокачественности полипов толстой кишки, а их отличный уровень экспрессии в зубчатых образованиях является отражением процессов дифференцировки. Также не исключено, что при увеличении выборки статистически значимая разница появится. Однонаправленность экспрессии клаудинов-1 и 3 (см. рис. 5, 6) свидетельствует о схожей роли клаудинов этих типов, что, вероятно, обусловлено принадлежностью к одной группе плотных контактов. Кроме того, выявлено различие между экспрессией клаудинов-1 и 3 в зубчатых образованиях в зависимости от их локализации: в полипах, расположенных в правой половине кишки, экспрессия данных маркеров оказалась выше, чем в левой (p<0,01 соответственно). Принимая клаудин-1 в качестве маркера, отражающего степень злокачественности аденокарциномы, а также учитывая достоверно более высокий уровень экспрессии клаудина-1 в раке по сравнению с зубчатыми образованиями, можно предположить, что зубчатые полипы, расположенные в правой половине толстой кишки, имеют больший потенциал злокачественности по сравнению с зубчатыми полипами, расположенными в левой половине. Данный вопрос требует дальнейшего изучения.

Роль клаудинов в канцерогенезе до настоящего времени остается неопределенной. Показано снижение экспрессии клаудинов 1 и 3 в колоректальном раке и полипах толстой кишки разных типов в сравнении с интактной слизистой оболочкой. Обнаружена отрицательная взаимосвязь степени злокачественности аденокарциномы и уровня экспрессии клаудина-1, что может свидетельствовать о нарушении функции плотных контактов, приводящей к разрозненности опухолевых клеток.

Уровень экспрессии клаудинов-1 и 3 достоверно отличался в группе зубчатых образований по сравнению с классическими аденомами и раком толстой кишки. Взаимосвязь локализации полипов с уровнем клаудинов-1 и 3 также продемонстрирована только для зубчатых образований. Все это свидетельствует об отличительных особенностях зубчатых образований (гиперпластических полипов и зубчатых аденом на широком основании) и, возможно, их собственном пути формирования.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Н.А.Н., П.Г.М.

Сбор и обработка материала: Н.А.Н., О.А.Х.

Статистическая обработка: Н.А.Н.

Написание текста: Н.А.Н.

Редактирование: П.Г.М.

Конфликт интересов отсутствует.