Молекулярные механизмы развития рака легкого у работников атомной отрасли

Эпидемиологическими исследованиями доказано, что радиационное воздействие приводит у человека к повышенному риску развития солидных опухолей и лейкемии [1—4]. Исследования когорты работников предприятия атомной промышленности ПО «Маяк» показали, что у специалистов, подвергшихся внутреннему альфа-облучению от инкорпорированного плутония 239, повышен риск возникновения опухолей легкого, печени и скелета [5, 6].

Патогенетические механизмы развития злокачественных новообразований, в том числе и у лиц, подвергшихся различным видам облучения, исследуют во всем мире [7, 8]. В развитии рака легкого, сложного и многостадийного процесса, большое значение имеют изменения функции генов, регулирующих пролиферацию, дифференцировку и апоптоз [9, 10]. Из большого количества генов-регуляторов жизни клетки одним из важнейших является опухолевый ген-супрессор , играющий ключевую роль в интеграции сигналов повреждающего воздействия на ДНК с последующей реализацией регуляции прохождения клеточного цикла, репарации ДНК и апоптоза, в связи с чем он назван «стражем генома» [11]. Изменение функционирования гена приводит к нарушению контроля повреждений ДНК и к осуществлению апоптоза, что в свою очередь вызывает нестабильность генома и может играть определенную роль в развитии рака. Ген является наиболее часто мутирующим геном при злокачественных новообразованиях. Более того, считается, что в каждом случае рака наблюдается уменьшение активности гена [12].

Учитывая стадийность развития рака, пока недостаточно ясно, на какой стадии выявляется нарушение функционирования гена .

По данным литературы, 90% мутаций, выявляемых в злокачественных новообразованиях у человека, возникают в центральном ДНК-связывающем домене гена , включающем 5—8-й экзоны. Этот домен играет исключительно важную роль в проявлении транскрипционной активности гена [13].

Целью настоящего исследования являлась оценка мутационных событий в 5, 7 и 8-м экзонах гена и выявление мутантного белка р53 в морфологически верифицированных случаях измененной (пролиферативные и предопухолевые изменения, рак легкого), а также гистологически неизмененной ткани легкого работников, подвергшихся профессиональному облучению.

Для исследования были использованы фиксированные в формалине залитые в парафиновые блоки (ФФПБ) ткани легкого из радиобиологического репозитория тканей человека (РРТЧ) Южно-Уральского института биофизики [14]. Были исследованы пролиферативные изменения (гиперплазии) — 4 случая, предопухолевые изменения (дисплазии) — 5 и рак легкого — 5 случаев (3 случая аденокарциномы и 2 — мелкоклеточного рака). В качестве контроля использовали участки неизмененной ткани легкого у этих же больных. Срезы ткани толщиной 5 мкм, подготовленные из парафиновых блоков, окрашивали гематоксилином и эозином по общепринятой методике [15]. После морфологической верификации случаев из соответствующих блоков вновь изготавливали срезы толщиной 5 мкм. Для элиминации маскировки антигенных детерминант, развившейся вследствие фиксации ткани в формалине, проводили демаскировку по HEAT-методу [16].

Иммуногистохимическое исследование по определению мутантного белка р53 проводили, основываясь на особенности мутантного конформационно-измененного белка р53 накапливаться в ядрах клеток, что дает возможность его определения иммуногистохимическими методами, в отличие от неизмененного белка р53, обладающего коротким полупериодом жизни.

Определение мутантного белка р53 проводили с применением непрямого иммунопероксидазного метода [17]. В работе использовали первичные мышиные антитела к протеину p53 («DAKO», Дания). Для детекции результатов применяли NovoLink Polymer Detection System (LEICA microsystems) с ДАБ (диаминобензидин)-хромогеном. После инкубации с ДАБ срезы докрашивали гематоксилином, входящим в набор реактивов для визуализации ядер. Интенсивность иммуногистохимической реакции оценивали на микроскопе Olympus BX40. Изображения оцифровывали в программе MMCam с использованием цифровой фотокамеры MicroCam 5 М. Далее подсчитывали общее количество клеток в фокусах измененной ткани легкого и количество клеток с выпавшим в зоне ядра ДАБ, дающим коричневое окрашивание, что свидетельствовало о наличии мутантного белка р53, с последующим расчетом доли р53-позитивных клеток. Для проведения молекулярно-генетических исследований выделяли препараты ДНК из ФФПБ ткани легкого с использованием 5 срезов толщиной 10 мкм, согласно протоколу производителя набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit фирмы «QIAGEN» [18]. Количественный и качественный анализ выделенной ДНК, проведенный методом спектрофотометрии и электрофореза, показал их удовлетворительное качество. С целью изучения мутационного процесса гена исследовали 5, 7 и 8-й экзоны, обладающие повышенной частотой мутаций при развитии рака различной локализации. При этом экзон 5 был «разбит» на два участка (5A и 5B), каждый из которых анализировали отдельно. Для получения достаточного для анализа количества специфических фрагментов гена использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводимый по следующей схеме: к 100 нг матрицы ДНК добавляли по 6 пмоль каждого праймера, 6 мкмоль каждого дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP), смесь ферментов TrueStart Hot Start полимеразы (Fermentas) в количестве 0,48 ед. и рекомбинантной Pfu-полимеразы (Fermentas) в количестве 0,12 ед. (соотношение 4:1), 90 нмоль MgCl. Для исследования использовали следующие нуклеотидные последовательности: экзон 5А, праймеры F: ctctgtctccttcctctt, R: GC-tgtgactgcttgtagatg, длина исследуемого фрагмента 190 п.н.; экзон 5 В, праймеры F: GC-ttccacacccccgcccg, R: gccctgtcgtctctcca, длина исследуемого фрагмента 191 п.н.; экзон 7, праймеры F: GC-gcctgtgttatctccta, R: cagggtggcaagtggct, длина исследуемого фрагента 191 п.н.; экзон 8, праймеры F: cctcttgcttctcttttc, R: GC-ccaccgcttcttgtcctg, длина исследуемого фрагмента 235 п.н. Температура отжига для фрагментов экзона 5А и 5 В соответствовала 55 °C, для экзона 7 — 58 °C, для экзона 8 — 56 °C. Детекцию продуктов реакции ПЦР проводили с помощью метода TTGE (гель-электрофореза продуктов реакции ПЦР при временнóм градиенте температуры), позволяющего обнаружить наличие/отсутствие мутаций [19]. Для подтверждения найденных методом TTGE мутаций и определения их вида и места локализации использовали модифицированный метод секвенирования по Сэнджеру [20]. Анализ полученных фрагментов ДНК осуществляли на 16-капиллярном секвенаторе ABI Prism 3100 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США; «Hitachi», Япония) с использованием наборов (BigDye Terminator v1.1) в соответствии с рекомендациями производителя. Полученные нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями, представленными в базе данных GeneBank .

В качестве базового программного пакета для интерпретации данных секвенирования использовали программу SeqScape («Applied Biosystems», США) и программные модули KB Basecaller («Applied Biosystems», США). Для статистической обработки данных использовали пакет прикладных программ Statistica 6.0. Статистическую значимость различий оценивали с помощью критерия Стьюдента (при ≤0,05).

В табл. 1 приведены характеристики доноров, бывших работников ПО «Маяк», привлеченных к исследованию, с верифицированными пролиферативными (1-я группа) и предопухолевыми (2-я группа) изменениями ткани легкого и раком легкого (3-я группа) [21]. Не установлено статистически значимых различий между группами по полу и возрасту на момент смерти. Выявлено, что в группе рака легкого средняя поглощенная доза внутреннего альфа-облучения от инкорпорированного плутония-239 в легких была наибольшей по сравнению с другими группами. В этой же группе индекс курения статистически значимо отличался от показателей в других группах (см. табл. 1).

Иммуногистохимический анализ показал отсутствие мутантного белка р53 в клетках неизмененной ткани легкого и увеличение количества клеток с мутантным белком р53 у всех больных при пролиферативных и предопухолевых изменениях, и при раке легкого (табл. 2). Результаты подсчета клеток показали широкую вариабельность экспрессии мутантного белка р53 в клетках с пролиферативными изменениями (бокаловидно-клеточная гиперплазия) — доля р53-позитивных клеток варьировала от 13,2 до 59,1%, а средняя величина составила 34,85±11,94 (см. табл. 2 и рис. 1). Примерно такая же вариабельность экспрессии мутантного белка р53 выявлена в очагах дисплазии эпителия — в клетках с предопухолевыми изменениями (см. табл. 2 и рис. 1).

В клетках рака легкого доля р53-позитивных клеток варьировала от 20,7 до 90,2%, а средняя величина составила 44,74±12,18 (см. табл. 2). При этом количество клеток с мутантным белком p53 было неодинаково в опухолях различной гистоструктуры. Так, количество клеток с мутантным белком p53 было меньшим в аденокарциноме, в то время как синтез мутантного белка p53 был выявлен в большем числе клеток мелкоклеточного рака (см. рис. 1). Однако в целом различия между долями р53-позитивных клеток в ткани легкого с пролиферативными и предопухолевыми изменениями и в ткани рака легкого были статистически незначимы, по-видимому, из-за малого числа наблюдений (см. табл. 2).

Таким образом, иммуноморфологическое исследование показало, что во всех случаях измененной ткани легкого выявлены клетки с мутантным протеином р53. Метод иммуноморфологического исследования с использованием моноклональных антител позволил зарегистрировать экспрессию мутантного белка p53 и судить об утрате свойств контроля клеточных функций геном в клетках с мутантным протеином р53. Применение молекулярно-генетического анализа дало возможность определить месторасположение и тип мутаций в гене .

Для молекулярно-генетического анализа была выделена ДНК из ФФПБ архивной ткани легкого. Количественный выход ДНК, полученной из разных ФФПБ ткани легкого, существенно варьировал в пределах 9,30—549,50 нг/мкл, что связано с историей получения, фиксации и хранения данного блока. Первый этап по обнаружению мутаций в 5, 7 и 8-м экзонах гена в подобранных случаях проводили с использованием TTGE-анализа (гель-электрофорез продуктов реакции ПЦР при временнóм градиенте температуры). При TTGE-анализе 5, 7 и 8-го экзонов было обнаружено 6 мутаций, о чем свидетельствовало наличие 2 и более различных по нуклеотидной последовательности продуктов (табл. 3).

Для подтверждения результатов, полученных TTGE-методом, было проведено секвенирование 5, 7 и 8-го экзонов, при этом одна предполагаемая мутация (5-й экзон, образец № 7), обнаруженная TTGE-методом, при секвенировании не подтвердилась. Это, по-видимому, связано с тем, что при TTGE-анализе появление разных по нуклеотидной последовательности продуктов может возникать не только при наличии мутации, но и вследствие ошибок полимеразы, при недостатке или избытке праймеров, избытке матрицы ДНК, а также из-за ее индивидуальной характеристики. Кроме того, обнаружена новая мутация в случае № 39, которая не была выявлена при исследовании методом TTGE-анализа (см. табл. 3 и рис. 2).

Был также обнаружен TTGE-методом и подтвержден при секвенировании редкий случай расположенных рядом мутаций в 5-м экзоне пробы № 4106 — 226 Met/Ile (677 G/T) и 227 Ala/Ser (678 G/T) (см. табл. 3).

Общее количество мутаций гена в 5, 7 и 8-м экзонах, обнаруженных TTGE-методом и подтвержденных секвенированием, равно 6 (см. табл. 3). Все выявленные мутации были трансверсиями (замена пурина на пиримидин, или наоборот), что указывает на воздействие экзогенных мутагенов [22]. При этом наблюдалось увеличение количества мутаций в группе рака легкого по сравнению с другими группами. Так, по 1 мутации было найдено в группах пролиферативных и предопухолевых изменений и 4 мутации в группе рака легкого. При этом можно выделить случай № 4106 с несколькими мутациями в 5-м и 7-м экзонах (см. табл. 3). Общее число случаев в группах с пролиферативными и предопухолевыми изменениями ткани легкого и группе рака легкого, в которых были обнаружены мутации гена , составило 25, 20 и 40% соответственно.

Сопоставляя результаты TTGE-анализа и секвенирования с данными иммуногистохимического исследования тех же образцов, можно отметить, что клетки с мутантным белком p53 были выявлены во всех случаях измененной ткани легкого, а мутации были обнаружены далеко не во всех исследованных образцах измененной ткани легкого. Эти результаты хорошо согласуются с данными литературы. Так, для некоторых раков, например в случае колоректального рака, наблюдалась сильная корреляция накопления мутантного белка р53 и мутаций в гене [23], в то время как при раке легкого сильной связи не обнаружено [24].

В настоящей работе были исследованы 3 из 11 экзонов гена  — это 5, 7, 8-й экзоны центрального домена гена, в которых выявляют 90% всех возникающих мутаций в злокачественных новообразованиях у человека. Кажется очевидным, что остальные 10% мутаций, возникающих в других экзонах гена , из-за малой вероятности их возникновения, не окажут какого-либо существенного влияния на появление мутантного протеина р53 в измененной ткани легкого. Можно предполагать, что существуют другие причины, кроме мутационных изменений гена , приводящие к появлению мутантного белка р53. Это могут быть сплайсинговые мутации или посттранскрипционные нарушения активности мРНК с участием микроРНК [13]. В то же время результаты настоящего исследования подтверждают данные других исследователей о том, что мутации гена при раке легкого наблюдаются в 40—70% случаев [25].

Выявление мутаций гена в 25% случаев пролиферативных, 20% — предопухолевых изменений ткани легкого и в 40% — рака легкого по сравнению с присутствием аномального белка р53 в 100% случаев измененной ткани легкого отражает сложные многоуровневые взаимодействия, определяющие функционирование гена в клетке. Эти взаимодействия затрагивают начальные структурные изменения гена (мутации) и могут включать посттранскрипционные модификации экспрессии гена и эффекты, связанные с конформационными изменениями белка р53.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Т.В.А., Г.Г. Р., М.В.Б.

Сбор и обработка материала: Н.С.В., М.В.Б., В.С.Р., И.В.Г. , М.Ю.Г. , Э.В.Г. , Н.В.З.

Статистическая обработка данных: С.В.О.

Написание текста: Г.Г. Р.

Редактирование: Г.Г. Р.