Исследование поведенческих реакций и длительности ультразвуковой вокализации у крысят от стрессированных в период беременности самок

Согласно данным Росстата, в 2022 г. заболеваемость населения Российской Федерации психическими и поведенческими расстройствами составляла 58,7 тыс. человек, или 40 человек на 100 тыс. населения [1].

Материнский стресс в течение беременности является фактором риска развития психоэмоциональных и когнитивных расстройств у потомства в постнатальном онтогенезе. В исследовании F. Amici и соавт. [2] была показана взаимосвязь между наличием пренатального стресса и формированием поведенческих нарушений у детей в возрасте до 10 лет — от гиперкинетических расстройств до нарушения эмоционального поведения и проблем во взаимоотношениях со сверстниками. Похожие данные были получены Z. Clayborne и соавт. [3]. В их исследовании стрессовое воздействие в период беременности было ассоциировано с интернализующим и экстернализующим поведением в постнатальном онтогенезе потомства — у 8-летних детей наблюдались депрессия, тревожность, синдром дефицита внимания и гиперактивности, вызывающее оппозиционное расстройство.

Ультразвуковая вокализация является перспективным методом исследования поведенческой активности и эмоционального состояния у млекопитающих. Известно, что крысы общаются посредством звуковых сигналов в ультразвуковом диапазоне. Вокализации на частоте 50 кГц ассоциированы с социальными взаимодействиями особей, направленными на установление социальной близости [4], в том числе между самками и их потомством [5]. В то же время есть исследования, в которых показана взаимосвязь между параметрами ультразвуковой вокализации на частоте 50 кГц и различными психоэмоциональными, когнитивными нарушениями и экспериментально смоделированными заболеваниями — расстройствами аутистического спектра [6], болезнью Паркинсона [7], эпилепсией [8], тревожностью [9], стрессом [10], депрессией [11] и маниями [12].

Цель исследования — изучение психоэмоционального состояния и его взаимосвязи с длительностью ультразвуковой вокализации у потомства крыс с физиологической и осложненной стрессом беременностью.

Эксперименты были выполнены на потомстве (n=120), рожденном белыми крысами-самками линии Wistar с физиологической беременностью и животными, подвергшимися стрессорному воздействию в течение всего периода беременности (21—23 дня). Беременные самки опытной группы в течение 1 ч 1 раз в день находились в специальной установке с 6 изолированными отсеками одинакового объема и сменяющимися разномодальными раздражителями (пульсирующий свет, громкий звук и вибрация), которые меняли каждые 5 мин по стохастической схеме таким образом, что каждое последующее стрессирующее воздействие было непредсказуемым для крыс [13].

Животных получили в ФГУП «Питомник лабораторных животных Рапполово» (Ленинградская область). В виварии ВолгГМУ животных содержали в условиях 12-часового светового дня при температуре 21—22 °C и влажности 40—55%. Протокол экспериментального исследования был одобрен региональным исследовательским Этическим комитетом Волгоградской области: №2044-2017 от 25 декабря 2017 г.

Были сформированы группы: 1-я — Интактная — самцы и самки (n=52), рожденные здоровыми крысами; 2-я — Стресс — самцы и самки (n=68), рожденные крысами, подвергшимися стрессированию во время беременности.

Детеныши крыс используют ультразвуковую вокализацию, чтобы сообщить о своем местонахождении самке. В возрасте 17 дней крысят, которые еще не открыли глаза, тестировали с использованием установки SONOTRACK Quotation («Metris», Нидерланды). В течение 2 ч у потомства регистрировали суммарную длительность вокализации (частота 50 кГц).

Для оценки психоэмоционального состояния потомства проводили тесты Открытое поле и Приподнятый крестообразный лабиринт в возрасте 22 дней, Закапывание шариков в возрасте 35 дней и Принудительное плавание по Porsolt в возрасте 47 дней.

Тест Открытое поле проходил в течение 3 мин в круглой установке для крыс с одноименным названием (диаметр 97 см, ООО «НПК Открытая Наука», Россия). Фиксировали количество пересеченных секторов, стоек без опоры и с опорой, количество болюсов и уринаций, время в центральной зоне (ЦЗ) и количество выходов в нее.

Тест Приподнятый крестообразный лабиринт проводили в установке, представляющей собой крестообразную платформу с двумя открытыми (ОР) и двумя непрозрачными закрытыми (ЗР) рукавами длиной 50 см и шириной 14 см (ООО «НПК Открытая Наука», Россия). В течение 3 мин регистрировали латентный период (ЛП) выхода из ЦЗ, количество заходов и время, проведенное крысой в ОР и ЗР, количество стоек и свешиваний в ОР, длительность пребывания животного в ЦЗ.

В тесте Закапывание шариков крыс предварительно на 30 мин помещали в клетку 42×26×15 см с 5-сантиметровым слоем плотно утрамбованных опилок. После этого в клетке раскладывали стеклянные шарики по схеме 4 ряда по 5 шариков и оставляли в ней крысу на 30 мин. Далее подсчитывали количество закопанных (погруженных более чем на ²/₃ в подстилку) шариков.

Для проведения теста Принудительное плавание по Porsolt крыс помещали в прозрачные пластиковые цилиндры (высота 45 см, диаметр 20 см, ООО «НПК Открытая Наука», Россия), заполненные водой до расстояния 10 см от кромки (температура 25±2 °C). В течение 3 мин фиксировали ЛП двигательной активности и иммобилизации, время иммобилизации и активного плавания, количество периодов неподвижности.

Для оценки когнитивных функций у потомства исследовали кратковременную рабочую память в тесте Распознавание нового объекта в возрасте 35 дней и долговременную память в тесте Условный рефлекс пассивного избегания в возрасте 47 дней.

Тест Распознавание нового объекта проводили в установке Открытое поле. В качестве объектов использовали два металлических цилиндра белого цвета и один цилиндр синего цвета. Они имели одинаковый размер (d=6 см, h=11 см) и вес (385 г). В первую фазу Ознакомления крысы изучали два одинаковых незнакомых объекта (белые цилиндры) в течение 4 мин, регистрировалось время исследования каждого из них. Затем на 3 мин крысу помещали в индивидуальную клетку. Во вторую фазу Тестовую объект 2 меняли на другой, одинаковый по форме, но различающийся по цвету (синий). После чего 4 мин регистрировали время исследования знакомого и нового объектов. Перед началом теста для каждой последующей крысы установку и цилиндры протирали спиртом для уничтожения меток и запаха, оставленных предыдущим животным. Для оценки рабочей памяти и исследовательской активности крыс использовали коэффициент дискриминации (Кд), отражающий разницу между временем исследования двух объектов по отношению к суммарному времени исследования их. Увеличение Кд расценивали как повышение когнитивных процессов. Кд рассчитывали по формуле:

Кд=(Время (Объект Новый)– –Время (Объект Знакомый))/(Время (Объект Новый)+ +Время (Объект Знакомый)).

Установка для обучения УРПИ состоит из двух отсеков, сообщающихся между собой: темного с электрифицированным полом и светлого. Животных по одному помещали в светлую камеру хвостом к входному отверстию в темную камеру (ТК). После захода в ТК животное закрывали в ней и в течение 10 с наносили электроболевое раздражение (10 ударов током, напряжение 45 В). Оценку сформировавшегося памятного следа производили через 24 ч после сеанса обучения, а сохранности его — на 3, 7 и 14-е сутки после обучения. Крысу помещали в установку и в течение 180 с регистрировали латентный период (ЛП) первого захода в ТК, который является показателем выработки памятного следа, и количество животных от общего количества каждой исследуемой группы, зашедших в нее. В день воспроизведения навыка при заходе животного в ТК болевое раздражение не наносили.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). Нормальность распределения проверяли по критерию Шапиро—Уилка. При нормальном распределении изучаемых параметров использовали тест Стьюдента. При распределении, отличном от нормального, применяли тест Манна—Уитни. Статистически значимыми считали различия при p<0,05. Данные представлены в виде M±SD, где M — среднее арифметическое значение, SD — стандартное отклонение.

В тесте Открытое поле крысята от самок, подвергшихся стрессированию в течение беременности, имели статистически значимо меньшее, по сравнению с интактной группой, количество пересеченных секторов и стоек без опоры. Количество стоек с опорой, болюсов и уринаций у первых, наоборот, было больше относительно потомства самок с физиологической беременностью. Потомство стрессированных крыс реже выходило в ЦЗ установки и проводило там мало времени (табл. 1). Это свидетельствует о повышенной тревожности крысят от самок, подвергшихся в период беременности стрессовому воздействию.

Таблица 1. Параметры поведенческой активности в тесте Открытое поле (M±SD)

Примечание. ЦЗ — центральная зона. Различия статистически значимы относительно: * — интактной группы (Student’s t-test); ^# — интактной группы (тест Манна—Уитни), p<0,05 (здесь и в табл. 2—4).

Результаты теста Приподнятый крестообразный лабиринт согласуются с данными теста Открытое поле. Потомство стрессированных самок проводило мало времени в ОР лабиринта, делало меньше свешиваний и реже заходило в них по сравнению с интактной группой. При этом количество заходов и время, проведенное в ЗР установки, у животных группы Стресс было статистически значимо больше (табл. 2).

Таблица 2. Параметры поведенческой активности в тесте Приподнятый крестообразный лабиринт (M±SD)

Примечание. ЛП — латентный период, ОР — открытый рукав¸ ЗР — закрытый рукав, ЦЗ — центральная зона.

В тесте Закапывание шариков потомство стрессированных самок закапывало значительно больше шариков по сравнению с интактной группой (рис. 1), что свидетельствует о компульсивном поведении у первых.

Рис. 1. Параметры поведенческой активности в тесте Закапывание шариков (M±SD).

Здесь и на рис. 3: различия статистически значимы относительно: ^# — интактной группы (тест Манна—Уитни), p<0,05.

Результаты теста Принудительное плавание по Porsolt свидетельствуют о наличии депрессивного поведения у потомства самок, подвергшихся стрессу во время беременности, — крысята имели более длительное, по сравнению с интактной группой, время иммобилизации, более короткую продолжительность активного плавания и большее количество периодов неподвижности (табл. 3).

Таблица 3. Параметры поведенческой активности в тесте Принудительное плавание по Porsolt (M±SD)

Примечание. ЛП — латентный период.

В тесте Условный рефлекс пассивного избегания потомство, рожденное стрессированными крысами, имело статистически значимо меньший, по сравнению с интактной группой, ЛП захода в ТК и чаще заходило в нее на 3-й день теста, а также проводило больше времени в ТК на 3-й и 7-й дни наблюдения (табл. 4). Это свидетельствует о том, что у потомства группы Стресс в меньшей степени сохраняется памятный след.

Таблица 4. Параметры поведенческой активности в тесте Условный рефлекс пассивного избегания (M±SD)

Примечание. ЛП — латентный период, ТК — темная камера.

В тесте Распознавание нового объекта статистически значимых различий между группами выявлено не было (рис. 2).

Рис. 2. Параметры поведенческой активности в тесте распознавания нового объекта (M±SD).

Кд — коэффициент дискриминации.

Суммарная длительность вокализации у крысят от самок, подвергшихся стрессорному воздействию в течение всего периода беременности, была значительно больше, по сравнению с интактной группой (рис. 3).

Рис. 3. Суммарная длительность вокализации (M±SD).

Таким образом, результаты тестов Открытое поле и Приподнятый крестообразный лабиринт свидетельствуют от том, что у потомства стрессированных в течение беременности самок наблюдается тревожное поведение, что согласуется с данными литературы [14, 15]. Кроме того, животные от стрессированных крыс проявляли компульсивное и депрессивное поведение в тестах Закапывание шариков и Принудительное плавание по Porsolt, а также нарушения сохранности памятного следа в тесте Условный рефлекс пассивного избегания.

Очевидно, названные нарушения психоэмоционального состояния обусловлены изменением материнского гормонального фона при стрессе. Известно, что нормальная активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы необходима для поддержания гомеостаза и выживания организма во время стресса. В физиологических условиях глюкокортикоиды взаимодействуют со специфическими внутриклеточными рецепторами в мозге и необходимы для выживания нейронов гиппокампа, консолидации памяти, облегчения глутаматергической нейротрансмиссии и формирования возбуждающих синапсов, а также для образования дендритных шипиков [16]. Однако аномальная стимуляция работы этой системы в период беременности способна привести к развитию ряда психических отклонений у потомства в постнатальном онтогенезе. Это может быть связано как с непосредственным изменением работы гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы плода вследствие повышенного уровня материнского кортизола и стимуляции выработки плацентарного кортикотропин-рилизинг-фактора, так и с негативным влиянием симпатико-адреналовой системы. Несмотря на то что в отличие от глюкокортикоидов катехоламины плохо проникают через плацентарный барьер и, как правило, метаболизируются в неактивные формы в плаценте через моноаминоксидазу и катехол-О-метилтрансферазу, адреналин и норадреналин способствуют сужению плацентарных кровеносных сосудов, тем самым уменьшая поступление питательных веществ и кислорода к развивающемуся ребенку [17].

Было показано, что у потомства самок мышей, которые подверглись воздействию повышенного уровня кортикостерона (80 мкг/мл) в течение либо последней недели беременности, либо 1-й недели лактации, наблюдается повышенный уровень кортикостерона в ответ на острое стрессовое воздействие и аномальный поведенческий фенотип, по сравнению с контрольной группой. Кроме того, у первых были обнаружены изменения в плотности глюкокортикоидных и минералокортикоидных, окситоциновых и μ- и κ-опиоидных рецепторов [18]. Более высокие, по сравнению с контрольной группой, концентрации кортикостерона и дезоксикортикостерона в ответ на острое стрессовое воздействие были обнаружены в стволе мозга у самцов, которые подверглись пренатальному стрессу, в то время как у самок уровень дезоксикортикостерона в гиппокампе был ниже. Также наблюдался умеренный дефицит тетрагидрокортикостерона в стволе мозга, миндалине и фронтальной коре самцов и во фронтальной коре самок, у которых был пренатальный стресс [19].

Известно, что детеныши крыс издают ультразвуковые вокализации в стрессовых ситуациях (при разлуке с матерью) [20]. Считается, что звуки в диапазпоне 22 кГц являются сигналами, отражающими негативные аффективные состояния, в то время как вокализации на частоте 50 кГц координируют социальное поведение [21, 22].

В нашем исследовании нарушения психоэмоциональной и когнитивной сфер у потомства стрессированных крыс сопровождались изменением вокализации животных — суммарная длительность вокализации в диапазоне 50 кГц у них была статистически значимо больше, по сравнению с интактной группой. Вероятно, увеличение вокализации детенышей на этой частоте связано с повышенной потребностью в социальном взаимодействии или поддержке со стороны матери, особенно после разлуки. Кроме того, воздействие стресса во время беременности приводит к изменениям в нейронных сетях потомства [23], ответственных за эмоциональную регуляцию и коммуникацию. Это может вызвать аномальную вокализационную активность, не соответствующую типичным эмоциональным ассоциациям. Также нужно отметить, что в диапазоне 50 кГц существует множество различных типов вокализаций, включая короткие частотные модуляции, трели и другие сложные звуки, которые отвечают за разные эмоциональные и поведенческие реакции. В связи с этим требуются дальнейшие исследования вокализации потомства стрессированных крыс для уточнения полученных данных.

Таким образом, у потомства стрессированных во время беременности самок наблюдается тревожное, компульсивное и депрессивное поведение, которое сопровождается увеличением длительности ультразвуковой вокализации на частоте 50 кГц.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.