Связь полиморфизма rs6265 гена BDNF с уровнем сывороточного нейротрофического фактора у пациентов с болезнью Паркинсона

Болезнь Паркинсона (БП) — это нейродегенеративное заболевание, характеризующееся потерей дофаминергических нейронов в черной субстанции и образованием телец Леви. Оно является результатом взаимодействия как генетических факторов, так и факторов окружающей среды. Основными клиническими проявлениями БП являются гипокинезия, тремор, ригидность, аномальные осанка и походка. Немоторные симптомы, такие как когнитивные поведенческие нарушения, расстройство сна, боль, депрессия, тревога, вегетативная дисфункция, обонятельные нарушения, являются другими важными клиническими проявлениями, встречающимися на всех стадиях БП, и появляются раньше, чем двигательные симптомы, серьезно снижая качество жизни [1].

Согласно данным ВОЗ, за последние 25 лет распространенность БП выросла вдвое. В 2019 г. численность лиц, страдающих БП, оценивалась на уровне свыше 8,5 млн человек [2]. В 2019 г. БП привела к утрате 5,8 млн лет жизни, скорректированных на инвалидность (на 81% выше, чем в 2000 г.), и стала причиной смерти 329 тыс. человек (рост на 100% по сравнению с 2000 г.). Заболеваемость и распространенность БП увеличиваются с возрастом, достигая 1700 случаев на 100 тыс. населения у лиц старше 65 лет. Диагностика, лечение и уход за больными БП ложатся тяжелым экономическим бременем на государственный бюджет, проявляя тенденцию к неуклонному росту.

Нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) — это нейротрофин, который играет решающую роль в развитии нейронов, их дифференцировке, выживании и синаптической пластичности [3—5]. Нейротрофические факторы широко исследовались в контексте нейродегенеративных заболеваний. Хотя дисфункция в передаче сигналов BDNF не считается основной причиной БП, известно, что данный нейротрофический фактор важен для выживания и развития дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции [6].

Помимо того, что с увеличением возраста в головном мозге наблюдается снижение BDNF [7], при БП также регистрируется более низкий уровень этого белка как в черной субстанции, так и в сыворотке крови [8]. Ряд исследований установили значительное снижение уровня BDNF в сыворотке крови у пациентов с БП [9—13]. Низкие уровни данного белка были обнаружены post mortem в различных отделах головного мозга, таких как миндалина [14], передняя поясная извилина [15], префронтальная кора [16] и гиппокамп [17], у пациентов с депрессией, которая характерна для БП.

Уровень мРНК генов, кодирующих нейротрофические факторы, в том числе BDNF, повышался либо не изменялся по сравнению с контролем в дофаминовых терминально дифференцированных нейронах, полученных из линий индуцированных плюрипотентных клеток, в которые были репрограммированы фибробласты пациентов с БП. Однако уровень белка BDNF в этих нейронах значительно снижался у больных БП, что свидетельствует о нарушении регуляции экспрессии BDNF на посттранскрипционном уровне [18].

Тем не менее экспрессия гена BDNF может регулироваться на уровне нуклеотидной последовательности ДНК. Одним из таких функциональных однонуклеотидных полиморфизмов в гене BDNF считается несинонимичный вариант во 2-м экзоне rs6265 (G196A), приводящий к аминокислотной замене валина (Val) на метионин (Met) в 66-м кодоне. Показано, что аллель A (Met) изменяет внутриклеточный транспорт и секрецию зрелого белка BDNF по сравнению с аллелем G (Val) [19]. Полиморфизм rs6265 связан с избирательным снижением уровня мРНК и белка BDNF в определенных областях головного мозга [20]. Однако результаты исследований его роли в развитии БП остаются противоречивыми, отражая клиническую гетерогенность и межпопуляционные различия изученных групп [21—23]. Это подчеркивает важность исследований полиморфизма rs6265 в разных этнотерриториальных группах населения.

Учитывая важную роль BDNF в «благополучии» нейронов компактной части черной субстанции головного мозга, изучение функции данного белка при БП остается актуальной задачей.

Цель исследования — оценить клинические особенности и уровень сывороточного BDNF в группах пациентов с БП, дифференцированных по генотипам полиморфного варианта rs6265 соответствующего гена.

В исследовании приняли участие 134 пациента с БП (61 мужчина и 73 женщины). Все пациенты, включенные в исследование, преимущественно русские, проживающие на территории Томска и Томской области. Для подтверждения диагноза использовались новые критерии MDS (Международного общества расстройств движений) [1]. Средний возраст пациентов составил 64 (54;70) года, средняя продолжительность заболевания достигала 7 (4; 9) лет, средний возраст дебюта БП был равен 55 (47; 60) годам, выраженность двигательных проявлений по III части шкалы MDS-UPDRS (Унифицированная шкала оценки БП MDS) составила 33 (25; 36) балла.

Было проведено заполнение индивидуальной регистрационной карты на каждого пациента с подробной оценкой анамнеза, факторов риска, характера дебюта, типа течения, темпа прогрессирования БП, применяемой противопаркинсонической терапии. Стадию БП оценивали по шкале Хен и Яра у каждого пациента, когда он находился в оптимальном «включенном» состоянии. Степень тяжести заболевания определяли по шкале MDS-UPDRS [24]. Оценка немоторных нарушений, качества жизни и повседневной активности у наблюдаемых пациентов с БП проводилась с использованием валидизированных опросников и шкал. Для оценки эмоциональных нарушений применялась госпитальная шкала оценки тревоги и депрессии (HADS) [25]. Когнитивные функции исследовались с использованием Монреальской шкалы оценки когнитивных функций (MoCA) [26]. Средний балл составил 24 (21; 27).

Пациенты получали следующую терапию: леводопасодержащие препараты и агонисты дофаминовых рецепторов (АДР) (n=39; 29%), леводопасодержащие препараты + АДР + амантадин (n=38; 28%), монотерапия АДР (n=17; 13%), монотерапия леводопасодержащими препаратами (n=10; 8%), АДР + амантадин (n=10; 8%), леводопасодержащие препараты + ингибитор катехол-О-метилтрансферазы (КОМТ) + АДР + амантадин (n=7; 5%), другие сочетания противопаркинсонических препаратов (n=16; 12%).

В качестве контроля использовали группу обследуемых (n=192), соответствующих по полу, возрасту (63 (min: 53; max: 69) года) и этнической принадлежности группе пациентов с БП (p>0,5). Контрольная группа не была связана с БП, также в анамнезе не было других нейродегенеративных заболеваний.

Генотипирование полиморфного варианта rs6265 гена BDNF. Геномная ДНК была выделена из лейкоцитов периферической крови стандартным методом фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование полиморфного варианта гена BDNF (rs6265) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на анализаторе LightCycler 480 («Roche Diagnostics», Германия) с использованием зондов TaqMan выполнено с помощью коммерческого набора (кат. номер NP-6265, «ДНК-Синтез», Москва). Для ПЦР в реальном времени использовали набор БиоМастер HS-qPCR (2×) (ООО «Биолабмикс», Новосибирск), содержащий все необходимые компоненты для генотипирования, по следующему протоколу: начальная денатурация в течение 10 мин при 95 °C, затем 40 циклов 92 °C в течение 30 с и 55 °C в течение 1 мин.

Измерение уровня сывороточного BDNF. У всех обследуемых пациентов брали кровь из локтевой вены утром натощак в пробирки типа Vacuette с активатором свертывания. Образцы крови центрифугировали при 1500× g в течение 15 мин, делили на аликвоты и хранили при –70 °C до дальнейшего исследования. В качестве исследуемого материала использовалась сыворотка крови.

Определение концентрации сывороточного BDNF проводили на мультиплексном анализаторе MAGPIX («Luminex», США) с применением xMAP Technology. В исследовании была использована панель HNDG3MAG-36K производства MILLIPLEX MAP (Merck, Darmstadt, Германия). Конечные результаты концентрации BDNF в сыворотке крови представлены в пг/мл.

План и проведение исследования соответствовали принципам Надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice — GCP) и Хельсинкской декларации. Исследование было одобрено локальным Этическим комитетом ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России (регистрационный номер №7813 от 27 мая 2019 г.). Обследование, нейропсихологическое тестирование и забор венозной крови у всех индивидуумов проводились только после подписания информированного согласия. Молекулярно-генетический анализ выборок и измерение уровня BDNF в сыворотке крови пациентов были выполнены на базе Центра коллективного пользования «Медицинская геномика» Томского НИМЦ.

Статистический анализ. Для оценки распределения уровня сывороточного BDNF использовали W-критерий Шапиро—Уилка, согласно которому (W=0,95598, p=0,0003) данные отклоняются от нормального распределения. Для многогруппового сравнения непараметрические данные сравнивали с помощью тестов Краскела—Уоллиса и Манна—Уитни.

Проверку отклонения частот наблюдаемых и ожидаемых генотипов от канонического распределения Харди—Вайнберга выполнили с помощью онлайн-калькулятора (https://wpcalc.com/en/equilibrium-hardy-weinberg/). Для бинарных переменных (генотипов и аллелей) выполнена оценка отношения шансов (OR) и 95% доверительного интервала.

Статистически значимым считали значение p<0,05. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета прикладных программ Statistica 10.0 и MedCalc (версия 15.6).

Сравнение частот генотипов и аллелей полиморфизма rs6265 гена BDNF между группами. В контрольной выборке наблюдаемое распределение генотипов соответствовало ожидаемым значениям (χ²=0,5162, p=0,7725). Среди пациентов частота аллеля A (Met) регистрируется в 2 раза выше (5,97%) по сравнению с контрольной группой (3,13%). Однако значимых различий частот генотипов и аллелей по варианту rs6265 при сравнении группах пациентов и контроля не выявлено (см. таблицу).

Оценка частот генотипов и аллелей варианта rs6265 в сравниваемых группах

Примечание. OR — отношение шансов; 95% CI — 95% доверительный интервал; p — уровень значимости различий.

Вариабельность уровня сывороточного BDNF в зависимости от генотипов полиморфизма rs6265 гена BDNF. Средний уровень BDNF в плазме крови пациентов с БП составил 2791,271±1679,449 пг/мл. Уровень сывороточного BDNF не различался между мужчинами и женщинами. При разделении пациентов на подгруппы в зависимости от генотипов rs6265 были получены значимые отличия среднего уровня BDNF (p=0,0001). Максимальный уровень данного белка регистрировали у пациентов с генотипами GG (2949,4±1620,6 пг/мл) и GA (2944,2±1590,6 пг/мл). Минимальный уровень нейротрофического фактора выявлен у пациентов с генотипом AA (320,1±164,6 пг/мл). Уровень BDNF в сыворотке крови у индивидов с генотипом AA значимо отличается от индивидов с генотипами GA (p=0,0001) и GG (p=3,9·10^–5).

Вариабельность уровня сывороточного BDNF в группах, различающихся в зависимости от двигательных проявлений БП. Уровень BDNF значительно различался между исследуемыми группами пациентов в зависимости от формы заболевания (p=0,0007). Среднее значение сывороточного уровня белка у пациентов с PIGD-формой (с ранними постуральными нарушениями и расстройством ходьбы, n=76) составляет 2398,1±1524,8 пг/мл, а у пациентов с тремор-доминантной формой (n=58) — 3306,5±1745,2 пг/мл.

Кроме того, значительные различия получены при сравнении групп, различающихся по темпу прогрессирования (p=1,0·10^–6). Так, в группе пациентов с быстрым темпом прогрессирования (n=23) регистрируется значительно низкий уровень BDNF (1495,9±1349,5 пг/мл) в сравнении с группами с медленным (n=45; 4124,6±1648,5 пг/мл) и умеренным (n=66; 2333,5±1130,5 пг/мл) темпами прогрессирования, характеризующимися более благоприятным течением БП.

При сравнении групп, различающихся в зависимости от стадии по Хен и Яру, наблюдаются значительные различия в уровне сывороточного BDNF (p=1,0·10^–6). Средний уровень белка составил в группе с I стадией по Хен и Яру (n=35) 1363,6±1333,1 пг/мл, со II стадией (n=50) — 2772,2±1292,9 пг/мл, с III стадией (n=49) — 3830,5±1503,6 пг/мл.

На сегодняшний день патогенез БП не установлен, но считается, что он связан со многими механизмами, такими как дефектная деградация белка, реактивный микроглиоз, окислительный стресс и митохондриальная дисфункция [27]. Основными патологическими изменениями при БП являются хроническая прогрессирующая дегенерация дофаминовых нейронов в черной субстанции и подкисление микросреды вокруг них в головном мозге. У пациентов с БП были обнаружены апоптоз нейронов и массовая пролиферация глиальных клеток [28]. BDNF является одним из наиболее распространенных нейротрофинов у млекопитающих и участвует в функционировании, развитии и выживании нейронов [29].

В настоящем исследовании проведена оценка распространенности генотипов и аллелей полиморфного варианта rs6265 гена BDNF в группах пациентов с БП и контроле, а также изучена вариабельность уровня сывороточного BDNF в плазме крови у пациентов в зависимости от их генотипа.

Значимых различий в частоте генотипов и аллелей между исследуемыми группами больных БП и контролем не зафиксировано. Роль исследуемого полиморфизма гена BDNF (rs6265) в подверженности БП неоднозначна. В полногеномных ассоциативных исследованиях (GWAS) не обнаружено ассоциаций с развитием БП, а результаты работ в дизайне «случай-контроль» противоречивы.

Основываясь на результатах GWAS из каталога полногеномных ассоциативных исследований [30], полиморфизм rs6265 ассоциирован преимущественно с антропометрическими признаками и поведенческими расстройствами индивидов. Кроме того, этот вариант связан с развитием ишемической болезни сердца, воспалением и апноэ. Ни в одном GWAS rs6265 не был ассоциирован с БП, так же как не установлено связи с вариабельностью уровня BDNF в сыворотке. Однако выявлено, что уровень сывороточного BDNF у североевропейского населения связан с полиморфным вариантом rs80238569 [31], относящимся к псевдогену CBX3P1 (chr11:27,806,359-27,808,558 (GRCh38/hg38)) и расположенному на расстоянии 153665 п.н. от гена BDNF (chr11:27,654,893-27,722,058 (GRCh38/hg38)).

Несмотря на отсутствие ассоциаций с развитием БП при сравнении пациентов и контроля, уровень BDNF значительно варьировал в зависимости от генотипа (rs6265) в группе пациентов. По данным предыдущих исследований, BDNF проникает через гематоэнцефалический барьер [32] и коррелирует с концентрацией сывороточного белка [33], что, вероятно, отражает патологический процесс при БП.

В нашей работе максимальный сывороточный уровень BDNF наблюдали у пациентов с БП с генотипами GG и GA в отличие от носителей редкого генотипа AA. Подобные результаты о связи генотипов гена BDNF (rs6265) с сывороточным уровнем соответствующего белка среди пациентов европеоидного происхождения с большим депрессивным расстройством получены в исследовании R. Colle и соавт. [34], которые выявили минимальный уровень BDNF среди индивидов с генотипом AA по сравнению с генотипами GG и GA (p=0,04). Однако противоположные данные получены для популяции Юго-Восточной Азии, где не было установлено существенной разницы уровня сывороточного BDNF у пациентов с большим депрессивным расстройством, дифференцированным по генотипам гена BDNF (rs6265) [3]. Среди относительно здоровых индивидов, несмотря на то, что наследуемость концентрации сывороточного BDNF оценивается в 48%, не обнаружено значимых различий уровня белка и полиморфизма гена rs6265 [35]. Эти результаты указывают на более сложную генетическую регуляцию сывороточного BDNF.

Общепризнанно, что БП — гетерогенное заболевание, и в клинической практике выделяют три основные формы по преобладанию моторных симптомов: акинетико-ригидную, дрожательную и комбинированную (смешанную). В то же время в международных исследованиях по клиническому фенотипу выделяют две формы: PIGD-форму с ранними постуральными нарушениями и расстройством ходьбы (акинетико-ригидную, при которой наблюдаются выраженные расстройства позы, постуральная неустойчивость, когнитивные нарушения и более быстрое прогрессирование) и тремор-доминантную, с более благоприятным течением [36, 37]. В нашем исследовании установлен минимальный уровень сывороточного BDNF как у пациентов с PIGD-формой, так и в группе с быстрым темпом прогрессирования, в которой преобладают пациенты с PIGD-формой, характеризующейся неблагоприятным течением БП.

Несмотря на связь низкого уровня сывороточного нейротрофического фактора с быстрой прогрессией и неблагоприятной формой течения БП, пациенты с выраженными двигательными нарушениями, оцененными согласно шкале Хен и Яра, наоборот, характеризовались более высокими уровнями BDNF. Стоит отметить, что данные об увеличении уровня BDNF на более поздних стадиях заболевания согласуются с результатами других исследований, предполагающих повышение периферического нейротрофического фактора в качестве компенсаторного эффекта фармакологического лечения [38].

Необходимо отметить, что различные факторы могут выступать в качестве медиаторов уровня BDNF, как, например, стрессовые травмирующие события [39], лекарственная терапия, широко исследованная на примере антидепрессантов [40], немедикаментозная терапия, включая физические упражнения [41].

Учитывая, что больные БП зачастую принимают такие препараты, как амантадин (в составе схемы противопаркинсонической терапии он присутствует у 46% пациентов, вошедших в наше исследование), церебролизин, антидепрессанты и блокатор глутаматных NMDA-рецепторов мемантин, следует ожидать их потенциальное влияние на уровень нейротрофических факторов. Так в корковых нейронах крыс, а также в клетках глиомы в ответ на применение амантадина наблюдается повышение экспрессии BDNF наряду с нейротрофическим фактором глиальных клеток GDNF [42—44]. Однако влияние противопаркинсонических препаратов на уровень BDNF до сих пор не так хорошо изучено, делая актуальными дальнейшие исследования в этом направлении.

В результате исследования не установлено ассоциации полиморфного варианта rs6265 с развитием БП, однако впервые выявлены различия в уровне сывороточного BDNF в группах пациентов, дифференцированных в зависимости от генотипов.

У пациентов с более неблагоприятным типом течения, характеризующимся быстрым темпом прогрессирования и наличием широкого спектра снижающих качество жизни симптомов, был выявлен более низкий уровень нейротрофического фактора мозга. В то же время полученные данные подтверждают гипотезу о компенсаторной роли сывороточного BDNF, повышающегося в зависимости от стадий БП.

Учитывая полученные результаты в настоящем исследовании и данные, детализирующие влияние BDNF в развитии ряда нейропсихических расстройств [10, 13] и когнитивных нарушений [12, 45], а также лекарственно-обусловленных дискинезий [46] в зависимости от структурного полиморфизма гена BDNF, необходимы дальнейшие исследования последствий этих изменений на функциональном уровне в связи с вариабельностью моторных и немоторных проявлений БП.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.