Церебральная микроангиопатия (ЦМА) (болезнь мелких сосудов, cerebral small vessel disease), ассоциированная с возрастом и сосудистыми факторами риска, является основной причиной сосудистых когнитивных нарушений, смешанных вариантов с болезнью Альцгеймера, значимой причиной инсультов, инвалидизации и смертности [1—7]. Артериальная гипертензия (АГ) — главный фактор риска развития возраст-зависимой ЦМА [8—14]. Однако в значительной части случаев прямые причинно-следственные отношения между АГ и ЦМА отсутствуют, что указывает на наличие иных самостоятельных или коморбидных с АГ условий развития заболевания. Одним из них может быть нарушение гомеостаза натрия, в основном рассматриваемое в качестве феномена чувствительности к соли. Последнее предполагает повышение артериального давления (АД) при избыточной и снижение АД при недостаточной солевой нагрузке у гипертоников и нормотоников [15]. Данное предположение обосновывается связью повышенного потребления соли с риском сердечно-сосудистых осложнений, независимым от АГ [16]; ускоренным развитием ЦМА у спонтанно-гипертензивных крыс, предрасположенных к инсульту [17]; увеличением объема гиперинтенсивности белого вещества (ГИБВ) [18, 19] и выраженности других МРТ-признаков ЦМА — лакун, микрокровоизлияний — при поправке на возраст и АГ [19].

Одним из механизмов самостоятельного влияния нарушений гомеостаза натрия на развитие ЦМА может быть повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Косвенным подтверждением этого является установленная связь гипернатриемии с увеличением объема мозга, что по данным МРТ Т1-динамического контрастирования сопровождалось задержкой контраста в визуально неизмененном белом веществе [18]. Вероятно, определяющим во взаимоотношениях пищевого и плазменного натрия с проницаемостью ГЭБ является буферная емкость гликокаликса эндотелия и эритроцитов по отношению к натрию. Установлено, что потребление соли, превышающее возможности отрицательно заряженных гликозамингликанов гликокаликса удерживать натрий, сопряжено с его повреждением и выходом натрия через эндотелиальные натриевые каналы за пределы сосудистого русла [20, 21]. Результаты нескольких исследований показали связь повышенной проницаемости ГЭБ с повреждением гликокаликса эндотелия и нарушением работы натриевых транспортеров, главным образом Na⁺/K⁺-АТФазы [22—25]. Кроме того установлено, что экспрессия Na⁺/K⁺-АТФазы в эндотелии сосудов является важным регулятором эндотелиальной жесткости при избыточной солевой нагрузке [26].

Таким образом, полученные экспериментальные и клинические данные позволяют предполагать, что у лиц с повышенным потреблением соли развитие ЦМА может зависеть от индивидуальных особенностей гликокаликса и функционирования натриевых транспортеров клеточных мембран. Мы использовали модификацию метода Salt blood test, предложенного H. Oberleithner и соавт. [27, 28], для определения индивидуальной соль-чувствительности по измерению буферной емкости гликокаликса эритроцитов больного. Метод основан на функциональном единстве гликокаликса эндотелия и эритроцитов и предполагает измерение буферной емкости предварительно экранированного гликокаликса эритроцитов в бесплазменной среде по скорости их оседания в растворах разной моляльности хлорида натрия [27, 28].

Для характеристики функциональных свойств натриевых транспортеров клеточных мембран была выбрана осморезистентность эритроцитов, соответствующая их способности противостоять гемолизу в гипотонических растворах [29, 30]. Использовался тест осмотической резистентности, основанный на оценке степени гемолиза эритроцитов в гипотонических растворах со снижающимися концентрациями [29, 30]. Связь осморезистентности с функцией натриевых транспортеров, в частности Na⁺/K⁺-АТФазы, впервые была установлена при серповидно-клеточной анемии [31, 32] и до настоящего времени тест осморезистентности используется в диагностике наследственных заболеваний мембран эритроцитов [33, 34]. Основанием для выбора теста осморезистентности явились и данные, полученные на спонтанногипертензивных крысах раннего возраста, — повышенная проницаемость эритроцитов по отношению к натрию и калию [35] и скопление эритроцитов в капиллярах и артериолах [36] задолго до развития изменений в сосудах и мозге.

Цель исследования — провести индивидуальное тестирование соль-чувствительности и осморезистентности на эритроцитах больных и оценить предиктивные возможности показателей в отношении ЦМА.

Материал и методы

В исследование были включены 73 пациента (48 женщин, средний возраст 60,1±6,5 года) и 19 здоровых добровольцев (14 женщин, средний возраст 56,9±6,4 года). В исследование были включены больные в возрасте 46—70 лет, обратившиеся с когнитивными жалобами в ФГБНУ «НЦН» с января 2016 г. по декабрь 2018 г., у которых МРТ-изменения при исследовании головного мозга соответствовали ЦМА (лакуны, ГИБВ, расширенные периваскулярные пространства, микрокровоизлияния, атрофия головного мозга) [37]. Больные с ГИБВ стадии Fazekas I включались в исследование при наличии АГ 2-й и 3-й степеней и/или ≥1 лакуны.

Критерии невключения: 1) выраженная деменция; 2) когнитивные нарушения вследствие вероятной болезни Альцгеймера по критериям Национального института старения США [38, 39]; 3) пациенты с малыми субкортикальными инфарктами/лакунами <3 мес после острого нарушения мозгового кровообращения; 4) ЦМА вследствие других самостоятельных причин (генетических, воспалительных, тромбофилических, системных, токсических, тяжелой мигрени в анамнезе); 5) наличие иной причины инсульта и сопутствующей патологии вещества головного мозга, кроме ЦМА; 6) атеросклеротический стеноз >50% экстра- или интракраниальных артерий; 7) тяжелая соматическая патология — кардиальная (фракция выброса <50%), эндокринная (сахарный диабет 1-го или 2-го типов с тяжелыми сосудистыми осложнениями, некомпенсированные нарушения функции щитовидной железы), почечная (хроническая болезнь почек со скоростью клубочковой фильтрации <30 мл/мин) и др.; 8) противопоказания для МРТ-исследования.

Группу контроля составили добровольцы с отсутствием клинических и МРТ-данных сосудистой и дегенеративной патологии головного мозга, сопоставимые по возрасту и полу.

У пациентов и лиц группы контроля оценивалось наличие классических сосудистых факторов риска — АГ, сахарный диабет 2-го типа, гиперхолестеринемии, ожирения, курения [40].

МРТ головного мозга проводили на магнитно-резонансном томографе Siemens MAGNETOM Verio («Siemens AG», Erlangen, Германия) с величиной магнитной индукции 3 Тл с использованием 12-канальной головной катушки. Для обеспечения стандартов исследования STRIVE в протокол сканирования вошли следующие режимы: 1) Т2-спиновое эхо в аксиальной проекции (time repetition, TR) 4000 мс, time echo (TE) 118 мс, толщина среза 5 мм, продолжительность 2 мин 2 с); 2) 3D Т1-mpr эхо в сагиттальной проекции (TR 1900 мс, TE 2,5 мс; толщина среза 1 мм; продолжительность 4 мин 16 с); 3) 3D FLAIR в сагиттальной проекции (TR 6000 мс, TE 395 мс; толщина среза 1 мм, продолжительность 7 мин 12 с); 4) DWI (diffusion-weighted image) в аксиальной проекции (TR 6600 мс, TE 100 мс, толщина среза 4 мм, 2 b-фактора = 0 и 1000 с/мм², 3 направления диффузии; продолжительность: 2 мин 4 с); 5) SWI (англ.: susceptibility-weighted imaging) в аксиальной проекции (TR 28 мс, TE 20 мс, фазовые и магнитудные изображения с толщиной среза 1,2 мм, а также mIP-изображения с толщиной среза 9,6 мм; продолжительность 7 мин 50 с). Визуальный анализ МРТ-признаков ЦМА проводился двумя независимыми нейрорадиологами в соответствии с рекомендациями STRIVE. ГИБВ анализировалась качественно по шкале Fazekas (стадии 0—3) [41]. Уточнялись наличие и количество лакун в проекции подкорковых структур, белом веществе полушарий большого мозга, стволе и мозжечке; микрокровоизлияний в проекции подкорковых структур и раздельно в лобной, теменной, затылочной и височной долях; периваскулярных пространств в проекции подкорковых структур и семиовальных центрах полушарий головного мозга.

Соль-чувствительность оценивалась с помощью модифицированного метода Salt blood test [27, 28]. Модификация заключалась в замене специализированных буферных сред, альбумина и 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты, на 3% декстран со схожими функциональными свойствами. Методика: 2 мл крови получали при кубитальной венопункции натощак в утренние часы в пробирки-вакутейнеры с К3 ЭДТА, затем центрифугировали 5 мин со скоростью 1800 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли. В 2 пробирки раскапывали по 80 мкл остаточной жидкости, содержащей эритроцитарную массу, в каждую из которых добавляли 3% декстран. В первую пробирку добавляли 120 мкл 0,73% раствора хлорида натрия (0,73% NaCl), во вторую — 120 мкл 0,87% раствора хлорида натрия (0,87% NaCl). Полученные смеси помещались в капилляры Панченкова для экспозиции в течение 60 мин при комнатной температуре, по истечении которой измерялась скорость оседания эритроцитов в мм/ч, соответствующая соль-чувствительности в 0,73 и 0,87% растворах хлорида натрия. По отношению этих двух показателей вычислялся коэффициент соль-чувствительности.

Оценка функции натриевых транспортеров клеточных мембран определялась классическим тестом осмотической резистентности [29, 30]. Методика: 2 мл крови получали при кубитальной венопункции натощак в утренние часы в пробирки-вакутейнеры с К3 ЭДТА. Затем раскапывали по 20 мкл цельной крови в 14 центрифужных пробирок, в каждую из которых добавляли 5 мл раствора хлорида натрия концентрацией от 1 до 0,10%. Полученные смеси оставляли для экспозиции на 30 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали в течение 5 мин со скоростью 2000 об/мин. В последующем в надосадочной жидкости каждой из 14 центрифужных пробирок оценивали выраженность гемолиза на фотоэлектроколориметре при длине волны 500—560 нм по интенсивности поглощения света в единицах абсорбции (ед. аб.). Выраженность гемолиза в пробирке с его началом принимали за минимальную осморезистентность, а в пробирке с полным гемолизом — за максимальную осморезистентность. По отношению этих двух показателей вычисляли коэффициент осморезистентности.

Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБНУ НЦН. Все обследуемые подписали информированное согласие на проведение исследования и обработку личных данных.

Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения IBM SPSS 23.0 и R 3.4.3. Основными показателями для категориальных и порядковых переменных были частота и доля (%), для количественных — медиана и квартили. Во всех случаях использовали двусторонние варианты статистических критериев. Нулевую гипотезу отвергали при p<0,05.

Качественные показатели сравнивали при помощи критерия χ² Пирсона или точного критерия Фишера, количественные — t-критерия Стьюдента, при количестве категорий >2 — одномерного дисперсионного анализа с последующим попарным сравнением по методу наименьшей значимой разницы. Для оценки связи показателей использовался корреляционный анализ Пирсона.

Оценка предсказательной способности лабораторных тестов в отношении развития ЦМА проводилась с помощью ROC-анализа и методом бинарной логистической регрессии, с использованием которой была создана модель расчета вероятности развития ЦМА. С помощью ROC-кривых для каждого показателя и построенной предиктивной модели были определены оптимальные пороговые значения с определением чувствительности и специфичности.

Результаты

Основные демографические данные и сосудистые факторы риска у обследованных пациентов с ЦМА и лиц группы контроля представлены в табл. 1. В обеих группах отмечалось преобладание женщин. Больные с ЦМА статистически значимо отличались от группы контроля по наличию и тяжести АГ и наличию сахарного диабета 2-го типа.

Таблица 1. Основные демографические показатели и сосудистые факторы риска у больных ЦМА и в группе контроля

Основные клинические проявления и МРТ-признаки ЦМА у обследованных пациентов представлены в табл. 2.

Таблица 2. Клинические проявления и МРТ-признаки ЦМА у пациентов с ЦМА

У пациентов с ЦМА по сравнению с лицами контрольной группы имелась статистически значимо более высокая соль-чувствительность в 0,73 и 0,87% растворах хлорида натрия (p=0,002 и p=0,003 соответственно) (рис. 1). Коэффициент соль-чувствительности значимо не различался между группами (p=0,067). В соответствии с результатами ROC-анализа наибольшей площадью под кривой обладала соль-чувствительность в 0,73% растворе хлорида натрия (AUC (95% CI): 0,723 (0,610; 0,836)), а ее пороговое значение 8,5 мм/ч имело лучшие характеристики — чувствительность 64%, специфичность 74% (см. рис. 1).

Рис. 1. Сопоставление показателей соль-чувствительности между пациентами с ЦМА и контролем, ROC-кривые тестов на соль-чувствительность в отношении развития ЦМА.

У пациентов с ЦМА по сравнению с лицами контрольной группы имелись статистически значимо более высокие минимальная осморезистентность и коэффициент осморезистентности (p=0,007 и p=0,004 соответственно), но не максимальная осморезистентность (p=0,169). Проведенный ROC-анализ показал, что среди использованных лабораторных тестов на осморезистентность наибольшей предсказательной способностью в отношении развития ЦМА обладала минимальная осморезистентность (AUC (95%CI): 0,708 (0,578; 0,839)), а ее пороговое значение 0,62 ед. аб. имело лучшие характеристики — чувствительность 52%, специфичность 90% (рис. 2).

Рис. 2. Сопоставление показателей осморезистентности между пациентами с ЦМА и контролем и ROC-кривые показателей осморезистентности в отношении развития ЦМА.

Показатели соль-чувствительности и осморезистентности не имели значимых взаимосвязей между собой.

Результаты тестов с лучшими предиктивными способностями в отношении развития ЦМА — соль-чувствительность в 0,73% растворе хлорида натрия и минимальная осморезистентность, были использованы для сопоставления с МРТ-признаками ЦМА. Соль-чувствительность в 0,73% растворе хлорида натрия и минимальная осморезистентность имели статистически значимые различия для выраженности ГИБВ по шкале Fazekas (p, ANOVA = 0,019 и 0,004 соответственно). Последующее межгрупповое сопоставление установило значимое повышение соль-чувствительности у пациентов 2-й и 3-й стадий Fazekas по сравнению с контролем и осморезистентности у пациентов 3-й стадии Fazekas по сравнению с контролем (рис. 3).

Рис. 3. Связь соль-чувствительности и осморезистентности с выраженностью ГИБВ по Fazekas.

Соль-чувствительность и осморезистентность не показали значимых связей с выраженностью других МРТ-признаков ЦМА — лакун, микрокровоизлияний, расширенных периваскулярных пространств.

Данные по соль-чувствительности в 0,73% растворе хлорида натрия и минимальной осморезистентности были использованы для построения предиктивной модели развития ЦМА методом бинарной логистической регрессии. Полученная модель обладала высокой предсказательной способностью в отношении развития ЦМА (p<0,000001). Ее характеристика представлена в табл. 3.

Таблица 3. Характеристика предиктивной модели развития ЦМА

Предиктивная модель ЦМА на основе одновременного использования обоих тестов показала лучшие характеристики, чем каждый тест в отдельности (AUC (95%CI): 0,824 (0,724; 0,923)). В соответствии с проведенным ROC-анализом пороговое значение предиктивной модели составило 0,62, чувствительность — 88%, специфичность — 68% (рис. 4).

Рис. 4. ROC-кривая предиктивной модели развития ЦМА.

Обсуждение

Для уточнения потенциальной роли нарушений гомеостаза натрия в развитии ЦМА с помощью модифицированного Salt blood test [27, 28] и теста осмотической резистентности [29, 30] на эритроцитах больных с ЦМА проводилось измерение показателей соль-чувствительности и осморезистентности, определялись их чувствительность и специфичность в отношении предикции ЦМА и связь с МРТ-признаками.

Используемые в исследовании тесты условно отражают события при потреблении поваренной соли: наполнение гликокаликса натрием в соответствии с его буферной емкостью и продвижение натрия через эндотелиальные натриевые каналы в межклеточное пространство, обеспечиваемое активностью натриевых транспортеров, главным образом Na⁺/K⁺-АТФазы [20, 21]. Выбор данных тестов был обусловлен значением определяемых в них показателей для проницаемости ГЭБ — ведущего механизма развития ЦМА [42, 43]. Установлено, что повреждение гликокаликса эндотелия и нарушение работы натриевых транспортеров клеточных мембран сопряжено с повышением проницаемости ГЭБ [22—25]. Потребление количества соли, превышающего буферную емкость гликокаликса, является фактором его разрушения и выхода натрия за пределы сосудистого русла в межклеточное пространство [20, 21]. Показано, что при высокой солевой нагрузке возрастает экспрессия Na⁺/K⁺-АТФазы и регулируемая ей эндотелиальная жесткость [26]. Использование эритроцитарных моделей для оценки индивидуальных соль-чувствительности по буферной емкости гликокаликса по отношению к натрию и осморезистентности по активности натриевых транспортеров обосновано сходством эндотелия и эритроцитов в отношении натриевых транспортеров [44] и функциональным единством их гликокаликса [27, 28]. Ранее Salt blood test использовался только у здоровых добровольцев и был рекомендован в качестве in vitro тест-системы оценки соль-чувствительности при проведении профилактики и лечения сосудистой дисфункции [27, 28]. Для определения функциональных свойств натриевых транспортеров клеточных мембран был использован тест осмотической резистентности, как упоминалось ранее, являющийся классическим тестом при диагностике некоторых наследственных заболеваний мембран эритроцитов [33, 34]. Ранее данный тест не использовался у больных с ЦМА. Следует отметить, что в настоящее время установлена связь серповидно-клеточной анемии с развитием ЦМА, как и характерные для нее эндотелиальная дисфункция и формирование ГИБВ [45, 46].

Используемые тесты, отражающие разные патогенетические механизмы, показали однонаправленные результаты — возможность предикции ЦМА, диагностированной по МРТ-признакам и клиническим проявлениям. Среди показателей обоих тестов с помощью ROC-анализа были отобраны наиболее тесно связанные с развитием ЦМА — соль-чувствительность в 0,73% растворе хлорида натрия и минимальная осморезистентность. Значения соль-чувствительности в 0,73% растворе хлорида натрия и минимальной осморезистентности не коррелировали между собой, что свидетельствует о независимости данных показателей и различиях функциональных возможностей гликокаликса и натриевых транспортеров при повышенном потреблении соли. С этим согласуется установленная в исследовании равнозначность предикции ЦМА по соль-чувствительности и осморезистентности при превышении их пороговых величин. В то же время использование обоих тестов в предиктивной модели ЦМА позволило повысить вероятность ее диагностирования. Это указывает на синергизм патологического действия повышенной соль-чувствительности и осморезистентности в развитии ЦМА.

Установленная возможность предикции ЦМА была проверена уточнением связей соль-чувствительности в 0,73% растворе хлорида натрия и минимальной осморезистентности с МРТ-признаками ЦМА. Значимые различия в виде повышения соль-чувствительности и осморезистентности были получены только в отношении выраженности ГИБВ по стадиям Fazekas. ГИБВ — патогенетически гетерогенный признак ЦМА [47]. До недавнего времени она рассматривалась исключительно как постишемические изменения вследствие артериолосклероза [48]. Мультимодальные исследования позволили установить в ее формировании важное значение повышенной проницаемости ГЭБ [42, 43]. В недавнем исследовании A. Heye и соавт. [18] были получены свидетельства участия гипернатриемии в данном механизме в виде зависимого от уровня натрия увеличения объема мозга и задержки контраста в визуально неизмененном белом веществе по данным МРТ Т1-динамического контрастирования. Результаты нашего исследования, выявившего связь повышенной соль-чувствительности и осморезистентности с ГИБВ, но не лакунами, имеющими ишемическое происхождение, указывают на значение оцениваемых показателей в проницаемости ГЭБ. Это согласуется с ранее установленными данными о роли повреждения гликокаликса эндотелия и нарушения работы натриевых транспортеров, главным образом Na⁺/K⁺-АТФазы, в повышении проницаемости ГЭБ [22—25]. Наши данные расходятся с результатами исследования S. Makin и соавт. [19], выявивших связь гипернатриемии и с ГИБВ, и с лакунами, что может объясняться значимым влиянием гипернатриемии на развитие артериолосклероза или различиями в тяжести больных и длительности заболевания. Следует отметить, что наши доказательные рассуждения о роли оцениваемых показателей в проницаемости ГЭБ поддерживаются данными о расположении Na⁺/K⁺-АТФазы на мембране эндотелиоцитов, обращенной к поверхности головного мозга, что обеспечивает вхождение 3 ионов натрия в цереброспинальную жидкость в обмен на 2 иона калия в клетку [22, 23].

Таким образом, проведенное исследование, использующее тесты определения соль-чувствительности и осморезистентности на эритроцитах больного, установило возможность предикции ЦМА по пороговым величинам раздельно по соль-чувствительности в 0,73% растворе хлорида натрия и минимальной осморезистентности и с большей диагностической точностью при их одновременном определении. Это указывает на высокое значение функциональной емкости гликокаликса по отношению к натрию и активности натриевых транспортеров клеточных мембран в развитии ЦМА у лиц с повышенным потреблением соли и позволяет рассматривать соль-чувствительность и осморезистентность факторами риска развития ЦМА. Необходимы дальнейшие исследования с целью уточнения условий использования данных тестов в клинической практике для выделения группы риска развития ЦМА и проведения патогенетически обоснованной профилактики и лечения.

Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБНУ НЦН.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.