Ассоциации полиморфизмов гена DRD3 с болезнью Паркинсона

Болезнь Паркинсона (БП) — одно из наиболее тяжелых и распространенных нейродегенеративных заболеваний, характеризующееся хроническим прогрессирующим течением с нарушением функции базальных ганглиев, клинически проявляющееся расстройством произвольных движений и тяжелой инвалидизацией больных. В связи с увеличением средней продолжительности жизни БП, несомненно, оказывает влияние на качество жизни населения и приводит к значительным социально-экономическим потерям [1, 2]. К сожалению, в последние годы в мире отмечена тенденция к «омоложению» БП, нередко заболевание дебютирует в 35—40 лет, что принято связывать с генетическими особенностями, изменением стиля жизни, неблагоприятным воздействием экологических факторов [2].

Этиология БП до настоящего времени остается окончательно не выясненной. В основе ее развития лежит прогрессирующая дегенерация дофаминсодержащих нейронов ряда структур ствола мозга, главным образом компактной части черной субстанции и голубого пятна, что сопровождается резким снижением содержания дофамина и стойкой дисфункцией дофаминергических путей ЦНС [3]. Патоморфологически старение сопровождается уменьшением числа нейронов черной субстанции головного мозга, появлением в них телец Леви (патологические агрегаты белка α-синуклеина), а также нейрохимическими изменениями: снижением содержания дофамина и уменьшением числа дофаминовых рецепторов в стриатуме.

Важную роль в развитии БП играют генетическая предрасположенность, воздействие некоторых нейротоксинов, образующихся в самих дофаминовых нейронах, и свободных радикалов, приводящих к повреждению дофаминергических нейронов, истощению в них запасов дофамина, нарушению трофики и их гибели [4, 5].

Согласно современным представлениям, примерно у 10% больных БП имеет наследственную моногенную природу, тогда как у абсолютного большинства — представляет собой спорадическую форму мультифакториальной природы [6, 7]. Многочисленными молекулярно-генетическими исследованиями показана роль мутаций генов SNCA, LRRK2, PRKN, DJ1, PINK1 и ATP13A2 в развитии моногенных форм [4, 8, 9]. Развитие спорадических форм мультифакториальной природы зависит от комбинации различных генов, а на клинические особенности заболевания воздействуют внешние средовые факторы (как пусковые, так и модифицирующие факторы риска БП).

Цель исследования — изучение ассоциаций таг-полиморфизмов гена дофаминового рецептора DRD3 с БП.

Проведено комплексное клинико-биологическое обследование 143 пациентов с БП, 93 (65%) женщин и 50 (35%) мужчин, от 44 до 83 лет (в среднем — 71,4±7,6 года), находившихся под наблюдением на кафедре неврологии и нейрохирургии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» (СибГМУ). Дебют болезни в среднем приходился на 59,3±8,5 года; ее длительность на момент обследования составила 12,2±4,8 года. Преобладали лица с высшим (54,3%) и средним специальным (36,2%) образованием. План и проведение исследования полностью соответствовали принципам Надлежащей клинической практики (Good Clinical Practice — GCP) и Хельсинкской декларации (включая поправки). Протокол исследования был одобрен независимым локальным Комитетом по этике ГБОУ ВПО СибГМУ. Письменное информированное согласие получали от пациентов или их близких родственников и лиц, официально признанных ответственными за пациентов на момент проведения исследования. Пациенты и родственники были информированы о характере исследования, его цели и возможных осложнениях, а также могли в любое время в одностороннем порядке прервать исследование.

Диагноз устанавливали согласно МКБ-10, код рубрики для БП — G20, формулируя согласно рекомендациям Центра экстрапирамидных заболеваний Минздрава Р.Ф. с указанием клинической формы, тяжести постуральной неустойчивости и нарушения ходьбы, распределения выявленных симптомов в конечностях; выраженности когнитивных нарушений, депрессии и вегетативной недостаточности; уточнением стадии болезни по Хену и Яру (1967) и темпа прогрессирования; с учетом наличия осложнений, связанных с длительным лечением леводопасодержащими препаратами.

В группу контроля вошли 97 здоровых без неврологических, психических и соматических заболеваний. Отбор контроля проводили, используя углубленный опрос с помощью анкеты обследования здоровых лиц. Все испытуемые считали себя этническими русскими и являлись жителями Сибирского региона.

ДНК выделяли из венозной крови с ЭДТА сорбентным методом с использованием набора фирмы «Медиген» согласно протоколу производителя. Выбор однонуклеотидных таг-полиморфизмов (tag single nucleotide polymorphism, tag SNPs) был осуществлен с использованием специальной программы (SNPinfo Web Server; http://www.niehs.nih.gov/snpinfo) [10]. Для выбора tag SNPs были применены следующие критерии: локализация в гене включала 1000 пар оснований (п.о.) до и после экзона (5’- и 3’-регионы), порог неравновесного сцепления (LD, linkage disequilibrium) — 0,8, частота минорного аллеля ≥0,1, максимальная дистанция между SNPs для расчета LD=250 000 п.о., база данных генотипов — «Европейская» [dbSNP]. Генотипирование 10 полиморфных вариантов (rs963468, rs2134655, rs9817063, rs324035, rs11721264, rs1800828, rs3773678, rs167770, rs167771, rs7633291) гена дофаминового рецептора DRD3 проводили по методу ПЦР в реальном времени на приборе StepOne Plus с помощью наборов той же фирмы («Applied Biosystems», США). Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием критериев χ² Пирсона и Краскела—Уоллиса с помощью пакета программ SPSS 17.0 for Windows. Соответствие распределения частот аллелей и генотипов равновесию Харди—Вайнберга проверяли по критерию χ². Для оценки связи полиморфизма с развитием БП вычисляли отношение шансов (OR) и доверительные интервалы (CI) для отношения шансов (95% CI).

Хромосомные позиции tag SNPs гена DRD3 представленыв табл. 1. Распределение частот генотипов полиморфизмов гена DRD3 в исследуемых группах соответствовало равновесию Харди—Вайнберга, кроме rs324035 в группе контроля.

Сравнение частот генотипов и аллелей в группах пациентов с БП и контроля выявило достоверные отличия по четырем полиморфизмам (табл. 2). Частота встречаемости генотипа GG (rs11721264) у пациентов с БП составила 45,6%, у здоровых — 34,2%, генотип АА встречался при БП в 11,2% случаев, что в 2,58 раза реже по сравнению с контролем (28,9%). Носителями аллеля G являлись 67,2% пациентов, что достоверно выше, чем в контроле (52,6%). OR, которое отражает относительный риск развития заболевания у носителей определенного аллеля по сравнению со здоровыми с 95% доверительным интервалом, составило 1,84 для носителей аллеля G (p=0,004, 95% CI=1,22—2,79). Достоверно высокое значение OR подтверждает наличие ассоциации полиморфного маркера rs11721264 с БП.

Генотип GG полиморфизма rs3773678 статистически значимо чаще встречался при БП по сравнению со здоровыми. OR составило 2,66 (p=0,005, 95% CI=1,53—4,64) для носителей генотипа GG. Достоверные ассоциации с БП также были выявлены при анализе частот генотипов полиморфизмов rs167771 и rs324035 гена DRD3.

Дофаминовые рецепторы — класс метаботропных рецепторов, сопряженных с G-белками, играют важную роль в функционировании ЦНС. Они участвуют в процессах мотивации, обучения, тонкой моторной координации, модулирования нейроэндокринных сигналов. Этот класс включает пять типов рецепторов: D1, D2, D3, D4 и D5. По структурным, биохимическим и фармакологическим характеристикам соответствующие рецепторы подразделяют на D1- (D1, D5) и D2-подобные (D2, D3, D4). В отличие от D1-подобных, рецепторы D2 и D3 присутствуют не только на постсинаптических мембранах клеток, чувствительных к дофамину, но и пресинаптических мембранах дофаминергических нейронов.

Гены дофаминовых рецепторов позиционируются как возможные гены-кандидаты патогенеза БП в связи с их влиянием на дофаминовую нейротрансмиссию. D. Dai и соавт. [11] провели метаанализ, в котором были проанализированы ассоциации полиморфизмов генов DRD2 и DRD3 с БП в 16 зарубежных работах, объединяющих 4279 пациентов и 5661 здорового [11]. Метаанализ продемонстрировал достоверную ассоциацию rs1800497 гена DRD2 и rs2134655 гена DRD3 с БП. В предыдущих исследованиях [12] было показано, что носительство T-аллеля (rs1800497) гена DRD2 сопровождалось снижением плотности DRD2-рецепторов в мозге умерших больных и снижением дофаминовой активности в ЦНС, что имеет существенное значение при БП.

Несмотря на то что известно 88 полиморфизмов в гене DRD3 [11], наиболее изученным является rs6280, который относится к миссенс-мутациям, приводит к аминокислотной замене серина на глицин в 9-м положении (Ser9Gly) и изменению функции рецептора у носителей данной мутации. Показаны ассоциации этого полиморфизма с развитием как БП, так и побочных эффектов дофаминергических лекарственных средств (леводопаиндуцированная дискинезия при БП и нейролептикиндуцированные дискинезии при шизофрении) [13—16].

Отличительной особенностью настоящего исследования является анализ не отдельно взятых однонуклеотидных полиморфизмов, а генотипирование tag SNPs. Tag SNP — это полиморфизм, который представляет гаплотип в определенном участке генома. Для каждого участка гена DRD3 был выбран один SNP, который строго связан с остальными полиморфизмами на данном участке гена, и между ними нет статистически значимых точек рекомбинации, что называется неравновесным сцеплением. Данная технология позволяет, не проводя генотипирование всех однонуклеотидных полиморфизмов или секвенирование гена, оценить вариабельность исследованного гена при определенных патологических состояниях.

Таким образом, проведенное впервые исследование tag SNPs гена DRD3 позволило выявить достоверные ассоциации четырех полиморфизмов и подтверждает наличие молекулярно-генетических особенностей дофаминовых рецепторов и их вовлеченность в патофизиологические изменения при БП.

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 14−35−00023 «Лаборатория фармакогенетических исследований персонализированной терапии психических и нейродегенеративных расстройств».