Создание фармакологически активной малой молекулы, обладающей свойствами фактора роста нервов

Фактор роста нервов (nerve growth factor, NGF) — первый идентифицированный белок семейства нейротрофинов, принимающий участие в развитии, дифференцировке и выживании отдельных популяций нейронов и других клеток, в том числе и не относящихся к нервной системе [1]. NGF обладает широким спектром физиологических функций. В ЦНС он регулирует, в частности, развитие и поддерживает жизнеспособность холинергических нейронов базальных отделов переднего мозга, вовлеченных в процессы памяти, внимания и мотивации, а также нейронов оптического нерва и сетчатки глаза, осуществляет регуляцию функций норадренергических ядер гипоталамуса и ствола мозга, модулируя тем самым активность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы. В периферической нервной системе NGF регулирует развитие и поддерживает жизнеспособность симпатических и ноцицептивных нейронов. В ноцицептивных нейронах NGF стимулирует экспрессию нейропептидов, участвующих в передаче боли, таких как вещество P и пептид, родственный кальцитонину [2]. NGF поддерживает функциональное состояние β-клеток поджелудочной железы, кератиноцитов кожи, некоторых клеток иммунной системы.

Помимо поддержания жизнеспособности отдельных популяций клеток в нормальных условиях, NGF стимулирует их выживание и восстановление при различных повреждающих воздействиях [3]. Защитная роль NGF реализуется за счет его способности индуцировать синтез антиапоптотических белков и ингибировать проапоптотические [4].

NGF привлекает внимание специалистов в качестве перспективного средства лечения нейродегенеративных заболеваний. Однако в экспериментальных и единичных клинических исследованиях NGF в виде полноразмерной молекулы оказался фармакологически непригодным. Это связано с его неудовлетворительными фармакокинетическими свойствами как белка и плейотропностью, включающей нежелательные побочные эффекты — гипералгезию, катастрофическую потерю веса, канцерогенез [1, 5]. Переход от полноразмерного белка к малой молекуле, сохраняющей необходимые регуляторные свойства, позволяет решить фармакокинетические проблемы. В то же время диссоциация фармакологических и побочных эффектов представляет собой более сложную задачу. Так, в лаборатории F. Longo (Стэнфордский университет, СШA) [6], лаборатории H. Saragori (Университет МакГилла, Канада) [7], группой A. Colangelo (Миланский университет, Италия) [8], группой F. Cozzolino (Флорентийский университет, Италия) [9] и других центрах [10, 11] были получены активные низкомолекулярные миметики NGF с удовлетворительной фармакокинетикой, однако селективность в отношении терапевтических свойств не была достигнута.

NGF реализует свои основные эффекты, взаимодействуя со специфическими тирозинкиназными рецепторами TrkA, трансдукция сигнала от которых осуществляется через фосфатидилинозитол-3-киназный (PI3K/Akt) и активируемый митогеном протеинкиназный (MAPK/Erk) пути. Имеются данные литературы [12], что с PI3K/Akt связана выживаемость, тогда как MAP-киназный путь вовлечен как в нейропротекцию, так и дифференцировку. Кроме того, как полагают [13], последний участвует в индукции гипералгезии. Вероятно, селективная активация PI3K/Akt позволила бы избежать по крайней мере некоторых побочных эффектов нейротрофинов. Этой цели можно было бы достичь и ингибируя MAPK/Erk-киназный каскад. Однако MAPK/Erk-киназы участвуют в регуляции многих физиологических процессов, вмешательство в которые нежелательно.

В Научно-исследовательском институте фармакологии им. В.В. Закусова РАН была сформулирована [14] рабочая гипотеза о том, что разные петлеобразные структуры нейротрофинов при взаимодействии с рецептором могут активировать разные сигнальные пути, обусловливая разные эффекты нейротрофинов. Эта гипотеза стала основой нового направления фармакологических исследований по созданию низкомолекулярных миметиков нейротрофинов с диссоциированными свойствами нативного белка.

В настоящей статье представлен обзор работ авторов по созданию дипептидного миметика NGF с фармакотерапевтическими свойствами полноразмерного белка, но свободного от его побочных эффектов.

Для конструирования миметика NGF использована пространственная структура мышиного фактора роста нервов из Брукхавенской базы данных (PDB ID 1BET). NGF представляет собой белок, состоящий из двух идентичных полипептидных цепей, по 118 аминокислотных остатков каждая. Кристаллографические исследования показали, что каждый протомер NGF имеет семь β-тяжей, образующих три антипараллельные пары. При этом β-тяжи связаны четырьмя экспонированными наружу нерегулярными участками, называемыми петлями 1 (остатки 28—36), 2 (43—49) и 4 (91—98), а также серии из трех последовательных изгибов, или 3-й петлей (остатки 59—66). В соответствии с предложенной гипотезой в основу была взята структура β-изгиба 4-й петли NGF (Asp⁹³-Glu⁹⁴-Lys⁹⁵-Gln⁹⁶), который по данным рентгеноструктурного анализа наиболее экспонирован наружу и за счет этого может играть основную роль во взимодействии нейротрофина с рецептором. При конструировании был сохранен центральный дипептидный фрагмент Glu⁹⁴-Lys⁹⁵, который, по геометрическим данным, должен наиболее глубоко проникать в зону связывания рецептора и наиболее полно распознаваться им. Периферийный Asp⁹³ был заменен его биоизостером, остатком янтарной кислоты, а аминокислотный остаток Gln⁹⁶ —амидной группой. Цели эти двух замен — стабилизация конформации β-изгиба, увеличение устойчивости соединения к действию пептидаз, а также удешевление синтеза. Так как NGF является гомодимером, два миметика β-изгиба были димеризованы голова-к-голове гексаметилендиаминовым спейсером (рис. 1). Таким образом, был сконструирован дипептидный миметик гексаметилендиамид бис-(моносукинил-глутамил-лизина), получивший рабочий шифр ГК-2 [15].

Активация TrkA-рецептора под действием NGF сопровождается фосфорилированием тирозинкиназного домена. Влияние ГК-2 на фосфорилирование тирозинкиназы A в культуре иммортализованных клеток гиппокампа мыши линии НТ-22 изучали методом Вестерн-блот-анализа с использованием моноклональных антител к фосфорилированной форме TrkA. Временны́е интервалы 15, 30, 60 и 180 мин были выбраны в соответствии с данными D. Senger и R. Campeton [16] для NGF. Достоверное увеличение содержания фосфорилированной тирозинкиназы, А наблюдали уже через 15 мин, эффект сохранялся до 180 мин после стимуляции клеток ГК-2 (10^–8M) и использованного в качестве позитивного контроля NGF (10^–9M) (рис. 2). Полученные данные свидетельствуют, что ГК-2 является агонистом TrkA-рецептора.

Как указывалось выше, основными внутриклеточными сигнальными каскадами TrkA-рецептора являются PI3K/Akt и MAPK/Erk.

С использованием клеток линии НТ22 и метода Вестерн-блот-анализа с антителами к фосфорилированным и нефосфорилированным формам Akt и Erk киназ установлено, что при инкубации клеток с ГК-2 активация Akt происходила в те же временны́е промежутки, что и при внесении NGF (рис. 3). Однако ГК-2 в отличие от NGF не увеличивал фосфорилирование Erk киназ (рис. 4). Следовательно, invitro ГК-2 активирует PI3K/Akt, не влияя на MAPK/Erk сигнальный путь [17]. Таким образом, получены веские доказательства возможности избирательного включения механизмов трансдукции сигнала TrkA.

В опытах invitro изучено влияние ГК-2 на основные эффекты, вызываемые нативным NGF, — нейропротективное и дифференцировочное действие.

ГК-2 проявлял нейропротективную активость в микронаномолярных концентрациях в условиях окислительного стресса, глутаматной и МФТП-токсичности как в иммортализованных, так и первичных клеточных культурах [18]. Эти данные суммированы в табл. 1.

Для определения дифференцировочной активности ГК-2в среду культивирования клеток добавляли РС12 в концентрациях 10^–5 и 10^–8М. В качестве положительного контроля использовали NGF в концентрации 10^–9М. Подсчет дифференцированных клеток показал, что ГК-2 не вызывал дифференцировку клеток РС12 ни в одной из исследованных концентраций [14].

Полученные данные согласуются с результатами, демонстрирующими активацию пептидом ГК-2 PI3K/Akt киназного пути при отсутствии таковой для MAP-киназного пути.

Для выявления связи активации именно PI3K/Akt сигнального пути с нейропротективной активностью ГК-2 изучали влияние селективных ингибиторов фосфатидилинозитол-3-киназы и MAP-киназы, соответственно LY294002 и PD98059. Для этого клетки линии HT-22 инкубировали с LY294002 (100 µM) или PD98059 (50 µM) в течение 30 мин перед добавлением ГК-2 (10^–5M и 10^–8M) или NGF (10^–9M). Затем через 24 ч добавляли H2O2 (1,5 мМ) на 30 мин. Через 4 ч после отмывки H2O2 жизнеспособность клеток оценивали с помощью MTT-теста. Показано, что нейропротективные эффекты как NGF, так и ГК-2 полностью блокируются соединением LY294002, но не PD98059. Таким образом, полученные данные подтверждают, что нейропротективная активность ГК-2 связана с селективной активацией PI3K/Akt сигнального пути.

Механизмы нейропротективного действия NGF включают стимуляцию синтеза белков теплового шока HSP70 и HSP32. С помощью Вестерн-блот-анализа нами было установлено, что инкубация с ГК-2 вызывает увеличение содержания как HSP70, так и HSP32 в цитоплазматической фракции клеток линии НТ-22[19]. Это говорит о том, что механизм нейропротективного действия ГК-2 аналогичен таковому NGF.

Фармакологические свойства ГК-2 были изучены с использованием ряда экспериментальных моделей заболеваний, для которых доказано патогенетическое значение дефицита NGF.

При использовании экспериментальных моделей ишемии мозга было установлено, что содержание NGF снижается в поврежденных участках [20], однако в первые несколько часов после возникновения ишемии количество как мРНК NGF, так и самого белка многократно возрастает, что рассматривается как реакция защиты нейронов от гибели [21]. В одном из клинических исследований [22] была отмечена достоверная обратная зависимость между размерами сформированного к 5—7-м суткам после инсульта очага повреждения и уровнем NGF в цереброспинальной жидкости в 1-е сутки.

Фармакологические эффекты ГК-2 изучены на моделях как фокальной, так и глобальной церебральной ишемии.

На модели ишемического микроинсульта у крыс, вызванного двусторонним фототромбозом коры головного мозга, ГК-2 при субхроническом внутрибрюшинном (в/б) введении (первое введение через 4 ч после инсульта) снижал объем коркового инфаркта на 62% и полностью предупреждал развитие ретроградной амнезии, по данным теста условного рефлекса пассивного избегания [23].

В условиях ишемического обширного инсульта, вызванного обратимой окклюзией среднемозговой артерии у крыс, ГК-2 при субхроническом в/б введении (первое введение через 4 ч после инсульта) снижал на 18% объем инфаркта и значительно уменьшал выраженность неврологического дефицита [24].

Были выявлены нейропротективные и когнитотропные эффекты ГК-2 на модели неполной глобальной ишемии, вызванной двусторонней необратимой окклюзией сонных артерий у крыс. На этой модели ГК-2 при субхроническом введении (первое введение через 4 ч после операции) полностью предотвращал гибель животных и восстанавливал жизнеспособность клеток коры головного мозга, а также корректировал когнитивные нарушения в ряде поведенческих тестов [25].

Эффективность ГК-2 доказана и на модели полной глобальной ишемии, вызванной остановкой системного кровообращения у крыс. При введении через 30 мин и далее через 48 ч после оживления он примерно на 25% снижал неврологический дефицит и значимо предотвращал повреждение клеток Пуркинье мозжечка и пирамидных нейронов гиппокампа в раннем постреанимационном периоде (7 дней после операции). В отдаленном постреанимационном периоде (14 дней после операции) ГК-2 полностью предотвращал гибель нейронов гиппокампа и примерно вдвое снижал гибель клеток Пуркинье мозжечка [26].

Известно, что болезнь Паркинсона (БП) сопровождается значительным снижением уровня NGF в области нигростриарных нейронов [27], а также крови [28]. На экспериментальных моделях паркинсонического синдрома было показано, что NGF увеличивает выживаемость дофаминергических нейронов и восстанавливает двигательные функции [29, 30].

Антипаркинсонические эффекты ГК-2 изучены на моделях галоперидоловой каталепсии и паркинсонического синдрома, индуцированного метил-фенил-тетрагидропиридином (МФТП) или 6-OHDA [31].

Установлено, что ГК-2 при внутрибрюшинном введении в дозах 0,01—5 мг/кг за 24 ч до галоперидола значительно (на 80—90%) снижает выраженность каталепсии у крыс. ГК-2 сохранял активность на данной модели и при пероральном введении в дозах 5 и 10 мг/кг. Изучение разных временны́х режимов введения дипептида ГК-2 показало, что он проявляет антикаталептическую активность и при введении через 45 мин после галоперидола.

На модели МФТП-индуцированного паркинсонического синдрома у мышей линии C57Bl/6 дипептид ГК-2 при однократном введении (1 мг/кг в/б) за 24 ч до МФТП статистически достоверно снижал выраженность олигокинезии и ригидности. При субхроническом введении после МФТП дипептид ГК-2 полностью предотвращал уменьшение длины шага (симптом ригидности) у мышей.

Дипептид ГК-2 проявил антипаркинсоническую активность и на модели паркинсонического синдрома у крыс, вызванного унилатеральным введением 6-OHDA в стриатум. На этой модели ГК-2 при субхроническом введении (1 мг/кг в/б, первое введение через 1 ч после операции, всего 7 инъекций) практически полностью предотвращал развитие индуцированных апоморфином ротаций у крыс.

Таким образом, димерный дипептидный миметик NGF ГК-2 проявляет выраженную антипаркинсоническую активность при использовании батареи валидированных фармакологических тестов.

Перспективность основанной на NGF терапевтической стратегии лечения болезни Альцгеймера (БА) обусловлена тем, что наиболее уязвимые при данном заболевании холинергические нейроны базальных отделов переднего мозга являются основной мишенью протективного действия этого нейротрофина в ЦНС. На различных экспериментальных моделях БА было показано, что NGF при внутримозговом введении защищает холинергические нейроны от гибели, противодействует холинергическому дефициту и восстанавливает нарушенные когнитивные функции [32—35]. Было установлено, что NGF противодействует амилоидогенезу [36] и гиперфосфорилированию тау-белка, образующего нейрофибриллярные клубки [37].

Мы изучили эффекты ГК-2 при субхроническом введении после следующих повреждений: 1) в условиях септо-гиппокампальной перерезки; 2) холинергического дефицита, вызванного длительным введением скополамина; 3) на модели БА, индуцированной введением стрептозотоцина в желудочки мозга [38].

На модели септо-гиппокампальной перерезки ГК-2 (1 мг/кг в/б каждые 48 ч, первое введение через 2 ч после операции, всего 7 инъекций) препятствовал нарушению негативного обучения у крыс в открытом поле с терапевтическим эффектом около 70%.

В условиях холинергического дефицита, вызванного длительным введением скополамина, ГК-2 (10 дней по 0,2 мг/кг в/б каждые 24 ч) практически полностью предотвращал нарушение способности крыс к пространственному обучению в лабиринте Морриса.

На модели БА у крыс, индуцированной введением стрептозотоцина в желудочки мозга, ГК-2 (14 дней по 0,5 мг/кг в/б каждые 48 ч) полностью предотвращал развитие дефицита пространственной памяти в водном лабиринте Морриса. При этом по величине действующей дозы ГК-2 был на порядок активнее, чем широко используемый в клинике для лечения БА препарат мемантин.

Таким образом, ГК-2 был активен и в моделях также хронического нейродегенеративного заболевания — БА.

Фармакологические эффекты ГК-2 на invivo моделях церебральной ишемии, БП и БА суммированы в табл. 2.

К основным побочным эффектам NGF, ограничивающим его применение в клинике, относят гипералгезию и потерю веса. Представленные выше данные показывают, что ГК-2 избирательно активирует PI3K/Akt сигальный путь, и в отличие от NGF не активирует MAP-киназный путь. Это позволило предположить отсутствие у ГК-2 побочных эффектов полноразмерного нейротрофина.

Для проверки этой гипотезы было изучено влияние ГК-2 на болевую чувствительность и массу тела крыс [17].

Для оценки влияния соединения ГК-2 на пороги болевой реакции использован иммерсионный тест «отдергивания хвоста» у крыс. ГК-2 вводили внутрибрюшинно в дозах 0,5—2,0 мг/кг. Эффекты оценивали через 30 и 60 мин, а также 24 ч после введения пептида. Временны́е интервалы избраны по аналогии с данными по гипералгезии, вызываемой NGF [39]. ГК-2 во все интервалы времени и во всех исследованных дозах не проявлял гипералгетического эффекта. Более того,ГК-2 через 30 мин и 24 ч после введения достоверно увеличивал болевой порог относительно как среднего значения в контрольной группе, так и исходного уровня (рис. 5).

Выраженным побочным эффектом NGF-терапии является катастрофическая потеря веса. Оценка возможного влияния ГК-2 на массу тела крыс выполнена при ежедневном хроническом (14 дней) введении в наиболее эффективной дозе (0,5 мг/кг). На всем протяжении эксперимента различий по массе тела между животными, получавшими ГК-2 или дистиллированную воду, выявлено не было [17].

Таким образом, показано, что дипептидный миметик 4-й петли NGF ГК-2, активирующий TrkA-рецептор и PI3K/Akt-путь, но не активирующий MAP-киназный каскад, обладает фармакотерапевтическими эффектами полноразмерного белка на invivo моделях ишемии мозга, БП и Б.А. При этом, если применение NGF сопровождается такими серьезными побочными эффектами, как гипералгезия и катастрофическая потеря веса, то ГК-2, по предварительным данным, не снижает болевой порог и не вызывает потерю веса у крыс.

Изучение острой токсичности показало, что ГК-2 является малотоксичным соединением. При однократном внутривенном введении беспородным мышам-самкам ЛД50 установлена на уровне 668 мг/кг, а при таком же введении беспородным мышам-самцам — 714 мг/кг. При дальнейшем наблюдении за выжившими в ходе эксперимента животными установлено, что их состояние и поведение нормализовалось в течение суток. Выжившие животные становились активными, начинали есть корм и пить воду. В течение 14 дней наблюдения гибели животных не отмечалось.

Изучение фармакокинетики субстанции ГК-2 на крысах при внутрибрюшинном введении с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии (ВЭЖХ/МС) показало, что неизмененный препарат определяется в плазме крови более 20 мин и проникает через ГЭБ. Концентрации ГК-2 в образцах как плазмы крови, так и ткани мозга практически не меняются через 5, 10 и 20 мин после введения. При этом определяемая концентрация препарата в мозге примерно на порядок ниже, чем в плазме крови.

Таким образом, возвращаясь к гипотезе, положенной в основу дизайна ГК-2, можно думать, что β-изгиб 4-й петли NGF является структурной детерминантой, достаточной для активации через TrkA Akt-киназного пути. Отсутствие побочных эффектов, характерных для нативного NGF, у миметика 4-й петли экспериментально доказывает предположение о том, что избирательная активация Akt-киназного пути не вызывает их проявления.

Для создания лекарственного препарата важно, что ГК-2 активен как при введении внутрибрюшинном (интервал доз 0,01—5 мг/кг), так и пероральном (5—10 мг/кг). Его эффекты проявлялись при однократном превентивном и при хроническом лечебном введении.

Совокупность полученных данных позволяет заключить, что синтезирован и фармакологически изучен системно активный низкомолекулярный миметик NGF, воспроизводящий его фармакотерапевтические эффекты invivo, избирательно активирующий PI3K/Akt сигнальный путь и свободный от основных побочных эффектов полноразмерного белка.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 14−15−00596).