Влияние сыворотки крови больных шизофренией на астроциты в культуре ткани эмбрионального мозга человека: морфометрическое исследование

Данные о том, что сыворотка крови (СК) больных шизофренией оказывает цитотоксическое действие на культивируемые нейроны, были получены в средине прошлого века [1—5]. Нагревание сывороток до 56 ^оС лишало их цитотоксического действия, что было расценено как свидетельство в пользу белковой природы повреждающего агента и определенной специфичности феномена. Эти данные стали важной частью представлений об эндотоксической природе заболевания, с одной стороны [3—5], и концепции о возможной роли воспаления в патогенезе шизофрении, с другой [6, 7]. Последняя активно обсуждается в настоящее время. Были получены данные о повышении экспрессии генов, вовлеченных в воспалительные реакции [8] и иммунный ответ [9, 10], а также нарушениях иммунитета у пациентов [11, 12], и, что особенно важно, свидетельства связи этих нарушений с клиническими особенностями заболевания и нейролептической терапией [12].

Концепция о возможной роли воспаления в патогенезе шизофрении не может рассматриваться вне функции иммунокомпетентных клеток в ткани мозга. Согласно современным представлениям, иммунокомпетентными клетками мозга являются микроглиальные клетки и астроциты. Их основная роль состоит в сохранении иммунопривилегированного статуса мозга [13]. В клеточной культуре астроциты сохраняют способность экспрессировать Toll-like-рецепторы, ответственные за распознавание патогенных молекул, и стимуляция этих рецепторов индуцирует продукцию астроцитами нейропротективных медиаторов и противовоспалительных цитокинов (интерлейкин-9, -10, -11 и др.) [14]. При этом в крови больных шизофренией обнаружены противомозговые антитела, в частности к астроцитарным мускариновым рецепторам [15, 16], глутаматным NMDA-рецепторам [17, 18]. С другой стороны, дисфункция астроцитов может быть существенным звеном патогенеза шизофрении, так как имеет прямое отношение к нарушениям энергетического, глутаматного и кинуренинового метаболизма в мозге пациентов [19—21]. К тому же в аутопсийном мозге больных шизофренией были выявлены нарушения ультраструктуры астроцитов дистрофического типа в префронтальной коре, гиппокампе и хвостатом ядре мозга [22—25]. Однако причины и механизмы этих изменений остаются малоизученными.

Для изучения влияния факторов СК пациентов на астроциты достаточно адекватной моделью считается органотипическая культура ткани мозга человека, в условиях которой воспроизводятся сложные межклеточные взаимодействия. Так, астроциты в монокультуре активно пролиферируют и имеют уплощенную форму, но при добавлении в культуру нейронов приобретают форму, характерную для них in vivo, и образуют специфические межклеточные контакты [26]. В лаборатории клинической нейроморфологии Научного центра психического здоровья (НЦПЗ) РАН была разработана [27] методика получения органотипической культуры из эмбрионального мозга человека, с применением иммуногистохимических маркеров охарактеризован ее клеточный состав и описана ультраструктура. Такая культура состоит из нейронов, микроглиальных клеток, астроцитов, а также недифференцированных клеток, обладает развитым нейропилем, состоящим из отростков астроцитов и нервных клеток с синаптическими контактами между ними. Ранее было установлено [28], что введение в такую культуру СК больных шизофренией вызывает активацию микроглиальных клеток.

Цель настоящего исследования — определить вызывает ли СК у больных шизофренией гибель клеток в органической культуре эмбрионального мозга человека и выявить характер изменений ультраструктуры астроцитов в этой культуре с учетом состояния периферического иммунитета больных.

Пациенты, СК которых была использована в настоящей работе, входили в группу больных шизофренией, которые проходили подробное клинико-лабораторное исследование, включавшее изучение показателей состояния периферического иммунитета, а также функции глутамат- и серотонинергической медиаторных систем [29—31].

СК была получена от 33 больных шизофренией с приступообразно-прогредиентным течением (по МКБ-10 рубрики F20.02, F20.22). Средняя длительность их заболевания составляла 10,7±9,4 года, возраст к периоду начала заболевания — 22,6±6,9 года.

Контрольную группу составили 20 психически здоровых. Характеристика обеих групп представлена в таблице.

Критериями включения пациентов в исследование были наличие острого психотического состояния, отсутствие алкогольной, лекарственной или иной зависимости, отсутствие лечения антипсихотическими препаратами перед началом исследования, письменное информированное согласие пациентов на участие в тестированиях. Более подробно критерии включения и исключения изложены в ранее опубликованных статьях [29, 30].

Получение и исследование органотипической культуры эмбрионального мозга человека. Эмбриональный материал получали во время проведения медицинских абортов в гинекологических отделениях родильных домов и клиник Москвы по согласованию с их администрацией и с согласия женщин-доноров. Этические нормы получения и использования эмбрионального человеческого материала были согласованы с этическим комитетом НЦПЗ РАН. Критериями отбора в этих случаях являлись: возраст 20—35 лет; срок беременности 9—10 нед; отрицательные показатели реакции Вассермана, на ВИЧ и НВs-антиген.

Для культивирования было использовано 8 эмбрионов 9—10 нед развития с сохранным головным мозгом. Эмбриональный материал переносили в ламинарный шкаф, промывали охлажденным сбалансированным солевым раствором Эрла. Последующие манипуляции проводили в стерильных условиях. Под контролем бинокулярной лупы мозг освобождали от оболочек, выделяли продолговатый мозг и делали поперечные срезы толщиной 300—400 мкм. Из полученных срезов вырезали более мелкие кусочки размером примерно 0,4×1×1 мм и переносили их во флаконы с питательной средой для последующего культивирования. Методика получения органотипических культур эмбрионального мозга человека была описана ранее [27].

Через 1 нед культивирования экспланты приобретали сферическую форму и сохраняли ее в течение времени культивирования. Диаметр таких эксплантов колебался от 0,64 до 1,3 мм. Через 3 нед культивирования экспланты от каждого эмбриона распределяли по двум флаконам. В первый флакон добавляли 1 мл СК, полученной от психически здорового человека, во второй — 1 мл СК пациента, страдающего шизофренией. Экспланты исследовали светооптическим и электронно-микроскопическим методами через 7 дней после аппликации СК.

Для световой микроскопии экспланты фиксировали в 4% растворе параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,4 (ФБ) в течение 24 ч. Затем обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафин. Полученные парафиновые срезы толщиной 20 мкм окрашивали крезиловым фиолетовым по методу Ниссля.

Для электронной микроскопии экспланты фиксировали в смеси 3% глутаральдегида и 4% параформальдегида на ФБ в течение 24 ч, отмывали ФБ, обрабатывали в 1% растворе осмиевой кислоты, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в эпоксидную смолу (аралдит). Полутонкие (1 мкм) срезы окрашивали толуидиновым синим и использовали для точной ориентации в процессе получения ультратонких срезов. Ультратонкие срезы помещали на медные сетки, предварительно покрытые формваровой пленкой и напыленные углеродом, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе Philips-420 (Голландия).

Измерение численной плотности (Nv) живых и погибших клеток в культуре проводили методом оптического диссектора [32] на 20 мкм срезах, окрашенных по методу Ниссля. К погибшим причисляли клетки с пикнотичными или фрагментированными ядрами и слабо окрашенной цитоплазмой [33].

Для морфометрического анализа ультраструктуры астроцитов были отобраны клетки, в ядрах которых присутствовали ядрышки. Такой подход позволяет провести объективное сравнение площади клеток и их ядер, а также параметров распределения органелл. Были получены микрофотографии 40—50 астроцитов с ядрышками для каждой из культур, подвергнутых действию СК здоровых и больных шизофренией. На негативах микрофотографий, полученных при увеличении 3300, оценивали следующие параметры астроцитов: площадь клетки, ядра и цитоплазмы, число и объемную фракцию (Vv) митохондрий и липофусциноподобных включений в цитоплазме астроцитов. Площади измеряли с помощью тестовой сетки для двухмерных подсчетов, накладываемой на негативы при конечном увеличении 26 000. Расстояние между точками сетки составляло 2 мкм для клеток и 0,2 мкм для органелл. Vv органелл определяли как отношение суммарной площади срезов соответственно митохондрий или липофусциновых гранул к площади среза цитоплазмы астроцита, выраженное в процентах.

Для статистического анализа данных использовали пакет Статистика 6.0. Нормальность распределения для исследуемых параметров в группах сравнения тестировали с использованием критерия Колмогорова—Смирнова, гомогенность дисперсий — с использованием Levene-теста. При соблюдении условий нормальности распределения и гомогенности дисперсий для сравнения параметров использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA).

Через 3 и 4 нед культивирования на срезах, окрашенных по Нисслю, были отчетливо видны группы нейронов, которые случайно распределялись по площади среза, а также недифференцированные клетки и единичные макрофаги. Тела большинства нейронов имели веретенообразную или полигональную форму, содержали округлое или овальное ядро с видимым ядрышком; в цитоплазме этих клеток четко определялось вещество Ниссля (рис. 1). В течение всего времени культивирования в эксплантах постоянно обнаруживались митотические фигуры. Признаков центрального некроза не было обнаружено ни на одном из сроков культивирования эксплантов. Однако в срезах выявлялось небольшое число клеток с пикнотичными или фрагментированными ядрами и прозрачной цитоплазмой, которые расценивались как поврежденные или погибающие клетки.

При морфометрическом исследовании достоверных различий в численной плотности погибших клеток между культурами, подвергнутыми воздействию СК здоровых и больных шизофренией, выявлено не было (p>0,1).

Что касается ультраструктуры органотипической культуры эмбрионального мозга человека, то она была подробно описана нами ранее [27], и воздействие сыворотки здоровых не вызывало качественных изменений клеточных элементов или нейропиля. Через 4 нед культивирования многочисленные нейроны обладают хорошо развитой цитоплазмой с цистернами гланулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР) и комплекса Гольджи, митохондриями, полисомами и микротрубочками, сосредоточенными в основании проксимального дендрита. Микроглиальные элементы характеризуются неправильной формой, наличием отростков, высокой электронной плотностью ядра и цитоплазмы, содержащей удлиненные профили цистерн ГЭР, рибосомы, митохондрии, разнообразные по размеру и форме вакуоли и фагосомы.

Тела астроцитов в изучавшейся культуре отличались светлой цитоплазмой, включающей глиофибриллы, гранулы гликогена, свободные полирибосомы, митохондрии, лизосомы, иногда микротрубочки. Овальное светлое ядро этих клеток заполнено дисперсным хроматином и содержит электронно-плотное ядрышко. От тела астроцитов отходят один или два отростка с многочисленными глиофибриллами (рис. 2). Нейропиль представляет собой межклеточные участки плотно упакованных профилей, включая отростки нейронов (дендриты, аксоны) и астроцитов, которые характеризуются светлой цитоплазмой с глиофибриллами, гранулами гликогена и иногда лизосомами. Аксонные терминали, имеющие вид округлых профилей и заполненные синаптическими пузырьками, формируют множественные синаптические аксодендритные контакты и единичные аксосоматические синапсы. Отростки астроцитов часто локализуются в непосредственной близости к синаптическим контактам и телам нейронов. Однако, если различий в ультраструктуре нейронов, их отростков и синапсов в культурах, подвергнутых воздействию СК больных шизофренией и здоровых, выявлено не было, то астроциты в культурах, подвергнутых действию СК больных шизофренией, отличались меньшими размерами и наличием в цитоплазме липофусциноподобных включений.

Результаты морфометрического исследования подтвердили, что площадь астроцитов [F (1,64)=15,3, p=0,0002], их ядер [F (1,64)=17,3, p=0,0001] и цитоплазмы [F (1,64)=5,36, p=0,02] достоверно уменьшается (~ –14%) при введении в культуральную среду СК больных шизофренией по сравнению с контрольными культурами, подвергнутыми действию СК здоровых (рис. 3).

Число митохондрий в астроцитах снижалось [на 22%; F (1,64)=5,19, р=0,03] при воздействии СК больных по сравнению с контролем (рис. 4). Снижение (на 17%) объемной фракции митохондрий в астроцитах не достигало уровня статистической значимости [F (1,64)=2,9, p=0,095]. При воздействии на культуры СК больных шизофренией выявлены также достоверные изменения числа [F=(1,64)=11,35, p=0,0013] и объемной фракции [F (1,64)=10,1, p=0,002] липофусциноподобных включений в астроцитах (см. рис. 4). При этом как число, так и Vv липофусциноподобных включений были достоверно больше в астроцитах из культур, подвергнутых воздействию СК больных шизофренией по сравнению с астроцитами из контроля (соответственно в 3 и 6 раз).

По данным настоящего исследования, органотипические культуры, полученные из продолговатого мозга человека, через 3—4 нед после начала культивирования представляют собой устойчивые клеточные системы, включающие нейроны, микроглию, астроциты и малодифференцированные клетки без признаков деструктивных изменений. Клеточный состав данных культур был подтвержден ранее с использованием иммуноцитохимических маркеров [27]. Плотные участки нейропиля между клетками состоят из профилей дендритов, аксонов и астроцитарных отростков, а также синаптических контактов, что свидетельствует о развитых межклеточных взаимодействиях в этих культурах.

Мы не выявили достоверных различий в численной плотности погибших клеток между культурами, подвергнутыми воздействию СК здоровых и больных шизофренией. Численная плотность клеток с прозрачной неокрашенной цитоплазмой и пикнотичными или фрагментированными ядрами, расцениваемых как гибнущие, составляла в среднем 10% (1—22%) и не изменялась достоверно при воздействии СК больных шизофренией по сравнению с контролем. Таким образом, аппликация СК больных шизофренией не влияет на выживаемость клеток в органотипической культуре эмбрионального мозга человека. Следует отметить также сохранность ультраструктуры подавляющего большинства клеточных элементов и структуры нейропиля, включая отростки клеток и синаптические контакты, в культурах при воздействии СК больных шизофренией. Однако в этих культурах наблюдались изменения ультраструктуры астроцитов, которые можно расценить как дистрофические: уменьшение размеров клеток, их ядер и цитоплазмы, уменьшение числа митохондрий, увеличение числа и объемной фракции липофусциноподобных включений в их цитоплазме. Уменьшение размеров астроцитов в данном случае можно рассматривать как гипотрофию клеток, так как снижение их размеров происходит преимущественно за счет размеров ядер. Снижение числа митохондрий в астроцитах может быть объяснено преимущественно уменьшением размеров цитоплазмы клеток, однако имеющаяся тенденция к существенному (на 17%) уменьшению их объемной фракции может свидетельствовать об истинном дефиците митохондрий в астроцитах при воздействии на культуру СК пациентов по сравнению с контролем. Следует отметить впервые установленное сходство изменений астроцитов в культуре ткани под влиянием СК больных шизофренией с результатами исследований аутопсийного материала, при которых были выявлены дистрофические изменения астроцитов в мозге больных шизофренией: уменьшение числа и объемной фракции митохондрий, появление липофусциноподобных включений в их цитоплазме [22—25]. Кроме того, результаты молекулярно-генетических и биохимических исследований свидетельствуют о дисфункции астроцитов и нарушении их энергетического, глутаматного и кинуренинового метаболизма в мозге при шизофрении [19—21].

Таким образом, воздействие СК больных шизофренией на органотипическую культуру эмбрионального мозга человека не оказывает общего цитопатического действия на большинство клеток этой культуры, но вызывает гипотрофию астроцитов и появление в них липофусциноподобных включений, что свидетельствует о специфичности повреждающего фактора.

В литературе имеются данные [34—36] о том, что при совместном культивировании нейронов и астроцитов последние могут защищать нейроны от различных повреждающих воздействий, однако вопрос о том, являлось ли отсутствие изменений со стороны нейронов и других клеток проявлением защитного воздействия со стороны астроцитов в наших экспериментах, еще требует дополнительного изучения.

Напомним, что в настоящей работе использовались СК больных шизофренией, которые были частью большой выборки пациентов (59 человек), вовлеченных в подробное исследование состояния периферического иммунитета (эти исследования проводились в лаборатории иммунологии под руководством проф. Г. И. Коляскиной). Было обнаружено достоверное повышение уровня циркулирующих иммунных комплексов в крови этих пациентов [29], что свидетельствует об активации гуморального иммунитета и активной выработке антител. Среди причин такой активации могут быть как аутоиммунный процесс, так и вирусные инфекционные агенты. Что касается возможного присутствия аутоантител в СК пациентов, то для интерпретации результатов настоящего исследования представляют интерес данные литературы [15, 16] о наличии в крови больных шизофренией антител к мускариновым ацетилхолиновым рецепторам астроцитов, которые способны взаимодействовать с культивируемыми астроцитами, действуя как агонисты соответствующих рецепторов и супрессоры продукции цАМФ. Было также установлено [17, 18], что в СК больных шизофренией присутствуют аутоантитела к ряду ключевых белков мозга, дисфункция которых характерна для шизофрении, включая рецепторы дофамина и NMDA-рецепторы глутамата, экспрессируемые в том числе и астроцитами [17, 18]. Так, установлена связь [37] между наличием антител к NMDA-рецепторам и психотическими симптомами. Эти данные не исключают возможности влияния аутоантител на астроциты, которые непосредственно контролируют уровни эндогенных агонистов и антагонистов глутаматных NMDA-рецепторов в мозге. Если же принимать во внимание данные литературы [38, 39] о наличии в сыворотке крови больных шизофренией антител к белкам ядер, в частности гистонам, то в нашем исследовании с этим можно связать уменьшение размеров ядер астроцитов и отчасти цитоплазмы.

Таким образом, можно предположить, что выявленные нами дистрофические изменения астроцитов при воздействии на культуры СК больных шизофренией могут быть связаны с наличием в ней противомозговых аутоантител. Однако следует отметить, что цитотоксическим действием могут обладать также собственно глутамат и аспартат, повышение концентрации которых в СК больных при шизофрении было описано [40, 41]. Такая возможность должна учитываться, поскольку астроциты экспрессируют соответствующие рецепторы и являются ключевым звеном в обмене синаптического глутамата в мозге, в том числе в его нарушениях при шизофрении [20].

Результаты настоящего исследования в совокупности с данными, полученными нами ранее [28], свидетельствуют, что воздействие СК больных шизофренией на органотипическую культуру эмбрионального мозга человека выражается в основном изменениями со стороны астроцитов и микроглиальных клеток. В значительно меньшей степени это касается нейронов, их отростков и синаптических контактов. Это позволяет предположить, что астроциты и микроглия могут играть роль детекторов повреждающего воздействия в органотипической культуре мозга человека и способны защищать от него другие клеточные элементы.

Учитывая данные некоторых авторов [42, 43] о влиянии нейролептических препаратов как на число астроцитов в мозге, так и на глиогенез, нельзя не принимать во внимание также возможность непосредственного влияния нейролептической терапии на морфологию астроцитов. В связи с этим важным представляется исследование влияния на культуру мозга сыворотки крови больных шизофренией в процессе лечения антипсихотическими средствами, что должно быть предметом отдельного исследования.