Отсутствие эффекта полиморфизма Val66Met BDNF на когнитивный дефицит у больных шизофренией и риск развития заболевания у их родственников

Ген мозгового нейротрофического фактора (BDNF),локализованный на хромосомном участке 11p14.1, считается геном-кандидатом для шизофрении [1—3]. В настоящее время в связи с шизофренией в этом гене активно изучается однонуклеотидный полиморфизм Val66Met (rs6265), ведущий к замене валина на метионин в кодоне 66 белка-предшественника BDNF. Аллель Met, у европейцев являющийся минорным, влияет на транспорт и локализацию proBDNF внутри клетки, вследствие чего снижается зависимая от деполяризации секреция зрелого BDNF [4, 5]. Обзоры соответствующей литературы [2, 6—8] свидетельствуют о возможной связи аллеля Met с менее благоприятными нейроанатомическими, нейрофункциональными и когнитивными показателями по сравнению с аллелем Val как в общей популяции, так и у пациентов с психическими расстройствами. В свете этих данных аллель Met можно было бы считать фактором риска шизофрении. Однако только один из метаанализов подтвердил связь генотипа Met/Met с повышенным риском развития заболевания [9]. Результаты других исследований [10—12] указывают на отсутствие такой ассоциации или повышение риска при носительстве любого из гомозиготных генотипов по сравнению с гетерозиготным [13]. Вместе с тем обобщенные данные о вовлеченности BDNF в патофизиологию шизофрении и вкладе полиморфизма Val66MetBDNF в вариативность ее отдельных проявлений [2, 3, 14, 15] позволяют предположить, что BDNF модифицирует течение и клиническую картину болезни, включая выраженность когнитивного дефицита.

Модифицирующая роль BDNF в проявлениях шизофрении может быть рассмотрена в контексте представлений о резистентности когнитивных процессов к развитию церебральной патологии, ведущей к психическому расстройству, за счет привлечения дополнительных нейрональных ресурсов. Такие ресурсы получили название мозговых или когнитивных резервов. Их существование связывают с высокой пластичностью мозга, обусловленной количеством нейронов и/или мощностью существующих и возможностью образования новых нейронных сетей. Полагают, что когнитивные резервы формируются в процессе генотип-средового взаимодействия под влиянием обогащенной среды, поскольку когнитивная и физическая стимуляция активирует факторы, способствующие нейро- и синаптогенезу [16, 17].

Известно, что BDNF играет важную роль в этих процессах [18—20]. Экспрессия, секреция и действие BDNFнепосредственно управляются нейронной активностью, вызванной психической и физической деятельностью. Секретируемый BDNF вовлечен во многие процессы, связанные с этой активностью, включая рост и дифференцировку нейронов и формирование синапсов, причем как на самых ранних этапах онтогенеза, так и в гиппокампальных отделах взрослого мозга. Кроме того, он играет роль в модификации уже сформированных нейронных сетей, в частности через участие в долговременной потенциации. Помимо данных о роли в этих процессах зрелого BDNF, имеются данные о роли proBDNF в апоптозе и долговременной синаптической депрессии в гиппокампе [20]. Генетические исследования указывают, что полиморфизм Val66Met BDNF может отвечать за различия между людьми по сопротивляемости процессам, связанным с поражением ЦНС. Так, Val66MetBDNF вносит вклад в различия по объему серого вещества мозга уже при рождении [21], во взрослом возрасте он модифицирует влияние физических упражнений на когнитивную сферу [22] и восстановление когнитивных процессов после перенесенной мозговой травмы [23], а в позднем — ассоциирован с прогредиентностью болезни Альцгеймера [6]. Наконец, в пользу участия BDNF в формировании когнитивных резервов свидетельствует его связь с широким кругом нейропсихических расстройств [3].

При шизофрении высокие когнитивные резервы могут вести к снижению вероятности развития заболевания у предрасположенных к нему лиц, более мягким проявлениям расстройства и улучшению функционального исхода болезни [24]. Учитывая это, мы предположили [25], что гены когнитивных резервов при шизофрении должны соответствовать следующим критериям: 1) благоприятные аллели/генотипы могут снижать выраженность различных проявлений болезни, особенно характерный для шизофрении когнитивный дефицит; 2) в группе лиц, генетически предрасположенных к шизофрении, но остающихся здоровыми (родственники больных), должно наблюдаться накопление благоприятных аллелей/генотипов по гену когнитивных резервов относительно здоровых лиц без наследственного отягощения и заболевших; 3) при этом ген не должен быть ассоциирован с заболеванием, что отличает гены когнитивных резервов от формирующих предрасположенность к шизофрении и тесно связанных с ее патогенезом.

Цель данной работы — проверка BDNF на соответствие критериям гена когнитивных резервов.

Настоящая работа является продолжением исследования [26, 27] роли BDNF в развитии расстройств шизофренического спектра в русской популяции, в которых была показана связь генотипа Val/Val с более тяжелой формой течения и повышением выраженности позитивных и общих психопатологических симптомов у мужчин, страдающих шизофренией.

Задачи настоящего исследования: 1) изучение ассоциации гена с особенностями когнитивной сферы больных; 2) сравнение частоты генотипов по полиморфизму Val66MetBDNF у непораженных родственников больных с таковыми у пробандов и психически здоровых лиц без наследственной предрасположенности к психозам.

В работе были использованы коллекция биологических образцов и база данных лаборатории клинической генетики Научного центра психического здоровья РАМН, включающая в себя клинические, нейропсихологические и психометрические показатели обследования больных с эндогенными психозами, их родственников первой степени родства и психически здоровых лиц без наследственной отягощенности психозами. Принципы формирования коллекции и постановки диагноза были описаны ранее [26, 27].

Для решения поставленных задач были сформированы две перекрывающиеся выборки.

Первая включала в себя лиц, прошедших экспериментально-психологическое обследование когнитивных функций: 169 больных (74% женщины) с расстройствами шизофренического спектра (с диагнозом по МКБ-10 F20 — 150 человек, F21 — 5, F25 — 14); их средний возраст был 32±12 лет. Средняя длительность болезни в этой группе составила 7±8 лет, средняя выраженность по шкале PANSS позитивных симптомов на момент обследования была равна 24±7, негативных — 18±6, общих психопатологических — 28±9 баллов. Контрольную группу составили 159 здоровых (64% женщины) без наследственной отягощенности психозами (средний возраст 32±11 лет).

Вторая выборка включала в себя 320 родственников больных с расстройствами шизофренического спектра из 161 семьи (родители, сиблинги, взрослые дети; средний возраст 45±13 лет, 51% женщины), 206 больных (50% женщины) с расстройствами шизофренического спектра из этих семей (средний возраст 30±13 лет) и 320 здоровых (51% женщины) (контроль) без наследственной отягощенности психозами, соответствующих группе родственников по демографическим характеристикам (средний возраст 44±14 лет).

Критериями исключения являлось наличие сопутствующих психических расстройств и соматические расстройства, влекущие нарушения когнитивной деятельности, уровень образования менее 9 классов и неевропейское происхождение.

Экспериментально-психологическое обследование включало в себя измерение эпизодической вербальной памяти (тест слухоречевой памяти и научения Рея, RAVLT), психической скорости (семантическая вербальная беглость) и управляющих функций (Trail Making Test — Part B, TMT-B). При проведении RAVLT испытуемому 5 раз предъявляют для воспроизведения список, А из 15 слов, затем 1 раз список Б из 15 других слов. От испытуемого требуется отсроченное воспроизведение и узнавание слов списка А. В настоящей работе в качестве показателя эпизодической вербальной памяти мы использовали суммарное количество слов, воспроизведенное после каждого из 5 предъявлений, т. е. вербальное научение. При измерении вербальной беглости испытуемому предлагали назвать за 1 мин как можно больше слов, принадлежащих к определенной семантической категории. Показатель — суммарное количество названных слов, принадлежащих к категориям «животные» и «фрукты». TMT-B оценивает переключаемость внимания: испытуемый должен соединять в правильном порядке кружки с буквами и числами, чередуя их. Показатель — время выполнения.

У всех испытуемых были определены генотипы по маркеру Val66MetBDNF. Генотипирование проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Использовали олигонуклеотидные праймеры со следующей последовательностью: 5’-GAGGCTTGACATCATTGGCT-3’(прямой) и 5’ CGTGTACAAGTCTGCGTCCT-3’ (обратный). Реакционная смесь для проведения ПЦР (15 мкл) содержала 2,5 мМ хлорида магния, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,05 ед. полимеразы Taq, 100 нг геномной ДНК, 10 пкмол каждого из праймеров, 10хбуфер для Taq-полимеразы. Денатурацию проводили в течение 2 мин при 94 ^oC, далее — 30 циклов амплификации (94 ^oC — 15 с; 60 ^oC — 15 с; 72 ^oC — 15 с). На заключительной стадии образцы прогревали при 72 ^oC 4 мин. Полученную в результате ПЦР последовательность ДНК длиной 113 пар оснований (п.о.) инкубировали с рестриктазой PcpCI («Сибэнзим») при 37 °C. Результаты рестрикционного анализа ПЦР-продуктов оценивали разделением полученных фрагментов в 8% полиакриламидном геле в течение 1 ч. Размер фрагмента, полученного в результате амплификации, составлял 113 п.о. Аллелю, А (Met) соответствовал фрагмент длиной 113 п.о., аллелю G (Val) — 78 и 35 п.о. Во всех исследованных группах распределение генотипов не отличалось от равновесия Харди—Вайнберга.

Статистический анализ проводили с помощью программы Statistica 6.0 для Windows. Для оценки роли генотипа в когнитивном функционировании применяли построение общей линейной модели с генотипом, группой, полом и возрастом в качестве независимых переменных. В связи с малым количеством гомозигот по минорному аллелю и для сравнения с большинством имеющихся работ носители генотипа Met/Met были объединены с гетерозиготами в общую группу носителей аллеля Met+, которую сравнивали с лицами с генотипом Val/Val. Показатели вербальной беглости и научения имели нормальное распределение согласно критерию Колмогорова—Смирнова. Показатель времени в пробе ТМТ-В был приведен к нормальному распределению с помощью функции Log10. Вычисляли также интегральный индекс когнитивного функционирования, представлявший собой среднее значение предварительно стандартизованных первичных когнитивных показателей. По частотам генотипов группы родственников, больных и контроля сравнивали с помощью критерия χ².

Больные статистически достоверно отличались от контроля по всем изученным когнитивным показателям (p<0,002). Однако не было найдено значимых эффектов генотипа и его взаимодействия с полом на отдельные когнитивные признаки и когнитивный индекс ни в группе больных, ни в контроле (табл. 1). При дополнительном анализе группы больных с введением в качестве ковариат выраженности симптомов и длительности болезни также не было обнаружено эффектов гена на когнитивные показатели. Больные с когнитивным дефицитом (значение когнитивного индекса более чем на одно стандартное отклонение ниже среднего контрольной группы) и без такового (28% всех больных) не различались по частотам генотипов между собой и от контроля.

Распределение частот генотипов и аллелей в группах родственников, больных и контроля представлено в табл. 2. Значимых различий между группами выявлено не было. Распределение генотипов и аллелей в исследованных когортах соответствовало таковому в других европейских популяциях [13].

Таким образом, в проведенном исследовании не было обнаружено влияния полиморфизма Val66MetBDNF на когнитивную сферу больных и накопления кого-либо генотипа у родственников больных относительно пациентов и контроля. Подтверждено также отсутствие ассоциации этого маркера с шизофренией [10, 26].

Поиску ассоциаций гена BDNF с различными когнитивными процессами при шизофрении и в норме посвящено значительное количество работ, и в ряде из них выявлен вклад гена в отдельные аспекты когнитивного функционирования больных (это нашло отражение, в частности, в ряде обзоров [8, 14, 15]). Кроме того, существуют данные об эффекте полиморфизма BDNF на связанную с когнитивной деятельностью активацию соответствующих регионов мозга при шизофрении [28, 29]. Это позволяет предположить влияние полиморфизма Val66MetBDNF по крайней мере на некоторые когнитивные процессы у больных с данным расстройством. Отрицательные результаты ряда исследований, включая наше, могут быть связаны с разными причинами. Так, это может быть малый размер эффекта BDNF и, как следствие, недостаточная мощность используемых выборок для его обнаружения, взаимодействие BDNF с другими генами или специфичность влияния полиморфизма BDNF на разные когнитивные процессы и состояния. Например, в работе X. Zhang и соавт. [30] аллель Val оказался ассоциирован с лучшими зрительно-конструктивными способностями независимо от диагноза, в то время как связь аллеля Met с худшими показателями внимания была характерна только для больных шизофренией. Некоторые авторы [31, 32], кроме того, указывают на важность учета пола в ассоциациях между BDNF и проявлениями шизофрении. В настоящей работе эффектов в зависимости от пола не выявлено. Однако в нашей выборке большинство составляли женщины, что могло повлиять на результаты анализа.

На основании полученных результатов даже с учетом перечисленных ограничений представляется маловероятным, что какой-либо из генотипов BDNFможет иметь протективный эффект на развитие когнитивного дефицита при шизофрении.

Данные о ненакоплении какого-либо генотипа по маркеру Val66MetBDNFу непораженных родственников свидетельствуют против гипотезы о BDNFкак гене когнитивных резервов и являются дополнительным аргументом в пользу отсутствия влиянияBDNFна риск возникновения шизофрении.

К основным ограничениям настоящей работы, помимо полового состава и средней численности выборки, прошедшей когнитивное обследование, следует отнести тот факт, что мы не учитывали лечение антипсихотическими препаратами и антидепрессантами, которые предположительно влияют на уровни BDNF в организме и, возможно, экспрессию гена [33]. Следует также отметить, что мы не вводили понижающий коэффициент для уровня значимости при сравнении частот генотипов в группах родственников и больных, которые включали в себя небольшие кластеры родственных индивидов. Однако в отсутствие значимых различий это не могло повлиять на выводы исследования.

В целом, полученные данные указывают на несоответствие BDNF критериям гена когнитивных резервов. Это не исключает возможной модифицирующей роли BDNF в отдельных проявлениях шизофрении, как показано в предыдущих исследованиях, например его связи с типом течения заболевания у мужчин или с отдельными группами симптомов [26, 34].