Исследование длины теломер у пациентов с болезнью Паркинсона

Концы линейных эукариотических хромосом представляют собой потенциальные сайты репарации двойных разрывов ДНК (DNA double-strand breaks, DSBs), гомологической репарации и негомологичного объединения концов хромосом (non-homologous end joining, NHEJ) [1]. Теломеры представляют собой гетерохроматиновые структуры на концах хромосом, состоящие из тандемных повторов 5'-TTAGGG-3'. На концах теломер находятся одноцепочечные участки 3'-цепи, образующей D-петлю, которая играет важную роль в защите концов хромосомы [2, 3]. Формирование структуры теломерной петли также обеспечивает белковый комплекс шелтерин (shelterin), который состоит из 6 основных белков, специфически связывающихся с теломерной последовательностью: TRF1, TRF2, TIN2, RAP1, TPP1 и POT1. Эти белки присоединяются к 1- или 2-цепочечным участкам ДНК и защищают теломеры, тем самым поддерживая их длину и предотвращая от эрозии [4].

У человека средняя длина теломер обычно составляет от 10 000 до 15 000 пар нуклеотидов [5] и неизбежно сокращается со скоростью от 50 до 200 пар оснований при каждом акте клеточной репликации [6] в результате недорепликации, а также действия нуклеаз. Процесс укорочения продолжается до тех пор, пока размер теломер не достигнет критической длины [7], что вызывает остановку клеточного цикла, приводящую к старению или апоптозу. Это позволяет рассматривать теломеры в качестве митотических часов, которые регулируют способность клетки к делению. Половые и стволовые клетки тем не менее справляются с прогрессирующей эрозией теломер с помощью теломеразы - РНК-зависимой обратной транскриптазы, которая может достраивать ДНК теломер.

Теломераза состоит из обратной транскриптазы (telomerase reverse transcriptase, TERT) - фермента, который отвечает за синтез теломерных повторов, а также РНК (telomerase RNA, TER), которая служит матрицей для удлинения теломерной ДНК. Каталитический комплекс теломеразы состоит из 2 молекул TERT и TER, а также дискерина белка, который участвует в процессинге 3'-конца TER и его встраивании в активный комплекс теломеразы [8]. Кроме того, удлинение теломер может осуществляться посредством теломераза-независимого альтернативного удлинения теломер (alternate lengthening of telomeres, ALT), которое представляет собой гомологичную рекомбинацию теломерных участков.

В последние годы получены новые данные относительно роли теломер в регуляции клеточного старения и их связи со многими заболеваниями человека, в том числе врожденным дискератозом, синдромами Вернера, Блума, Неймегена, атаксией-телеангиэктазией, анемией Фанкони и др. Общим признаком этих заболеваний является то, что у пациентов обнаруживаются критически короткие теломеры по сравнению со здоровыми того же пола и возраста. Это подводит нас к новому пониманию заболеваний, а также ориентирует в направлении, в котором следует осуществлять поиск будущих диагностических и терапевтических стратегий.

В последнее время длину теломер в клетках периферической крови изучали в качестве основной модели при попытках расшифровать связи между изменением длины теломер и возрастными нарушениями и старением людей [9]. Высказано предположение, что причинами ускоренного укорочения теломер в клетках периферической крови лиц с возрастными заболеваниями являются повышенный уровень системного окислительного стресса и хроническое воспаление [9, 10]. Лейкоциты периферической крови являются прекрасным объектом для исследования динамики теломер [11]. Многие авторы полагают, что метод определения длины теломер (terminal restriction fragment measurement) в легкодоступных образцах, таких как периферическая кровь, может давать надежные данные для установления относительной длины теломер в других тканях [12]. Таким образом, укорочение теломер в лейкоцитах периферической крови может служить маркером не только старения, но и интенсивности окислительного стресса и хронического воспаления, которое может быть индикатором системного патологического стресса [13]. Например, средняя длина теломер лейкоцитов у больных с инфарктом миокарда оказалась значительно короче, чем у лиц контрольной группы. Существенное укорочение длины теломер в этом случае было ассоциировано с увеличением риска инфаркта миокарда примерно в 3 раза [14]. Аналогичным образом, теломеры эндотелиальных клеток, имеющих отношение к возникновению и прогрессии атеросклероза коронарных артерий, были значительно короче, чем в контроле, что может свидетельствовать об их патогенетической роли в развитии коронарных заболеваний [15].

Выраженное укорочение теломер в клетках периферической крови выявлено и при других заболеваниях (в том числе, сахарном диабете, болезни Альцгеймера, никотиновой зависимости и ожирении), а также у матерей с высоким уровнем психологического стресса, связанного с уходом за больными детьми [16-19].

В представленном исследовании определена длина теломер клеток крови и буккального эпителия у пациентов с болезнью Паркинсона (БП) и клинически здоровых лиц того же возраста.

В исследовании были использованы образцы крови и буккального эпителия 30 пациентов с БП (12 мужчин и 18 женщин, средний возраст - 64,4±0,6 года), проходивших обследование в Институте геронтологии Национальной академии медицинских наук Украины.

В группу контроля входили 34 здоровых того же возраста, средний возраст которых был 65,0±0,7 года.

Поскольку предварительные расчеты показали, что половые различия не влияют на длину теломер, с целью усиления статистической мощности анализа окончательные расчеты были осуществлены в общей группе мужчин и женщин.

Выделение ДНК проводили с помощью набора «ДНК-Сорб» (Россия). Амплификацию изученных локусов осуществляли с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе Corbett Rotor Gene 6000 (производства компании «Corbett LifeScience»).

Определение длины теломер в лизате клеток проводили методом ПЦР с детекцией флюоресценции в реальном времени [20, 21]. Для амплификации теломерных последовательностей использовали праймеры telg ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTG GGTTTGGGTTAGTGT и telc TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA, для амплификации однокопийного референсного гена альбумина использовали праймеры albс CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGAAATGCTGCACAGAATCCTTG и albd GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGAAAAGCATGGTCGCCTGT.

Относительную длину теломер оценивали по показателю T/S, который рассчитывали как отношение числа копий теломерных повторов к числу копий гена альбумина. Статистическую значимость различий величины показателя T/S в контрольной группе и у пациентов с БП определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Корреляционно-регрессионный анализ был осуществлен при помощи пакета программ Statistica v.5.5 («StatSoft Inc.», США).

Теломеры в клетках буккального эпителия оказались существенно короче у пациентов с БП, чем в контроле (рис. 1).

Обнаружена достоверная корреляция (r=0,55; p<0,01) между длинами теломер в клетках крови и буккального эпителия у пациентов с БП, но не в контрольной группе (рис. 2).

В предыдущих исследованиях анализ ассоциации длины теломер с БП приводил к противоречивым данным: при исследовании лейкоцитов периферической крови у 28 пациентов мужского пола и 27 лиц контрольной группы короткие теломеры (менее 5 т.п.н.) были выявлены только у пациентов с БП, в то время как средняя длина теломер в двух группах достоверно не различалась [22].

В другом исследовании H. Wang и соавт. [23] не обнаружили никакой разницы в длине теломер у 96 пациентов с БП и 172 лиц из контрольной группы. T. Maeda и соавт. [24] определили в своем исследовании среднюю длину теломер, а также статус метилирования субтеломерных регионов хромосом у 35 пациентов с БП и 42 лиц из контрольной группы. Было установлено, что лейкоциты у пациентов с БП имеют повышенный уровень метилирования субтеломерных областей, а также более короткие теломеры по сравнению с контролем. Эти данные подтвержают уже доказанный факт связи метилирования субтеломерных регионов хромосом с процессом укорочения теломер.

Возможную связь ускоренного укорочения теломер и БП можно объяснить несколькими факторами. Во-первых, теломеры укорачиваются при старении, и короткая длина теломер в лейкоцитах наблюдается именно у пациентов с нейродегенеративными расстройствами, в частности с БП [25]. Во-вторых, ряд работ показывает связь воспаления (которое, как известно, сопровождает процессы нейродегенерации при БП) с длиной теломер [18, 26-29]. В-третьих, показано, что оксидативный стресс приводит к укорочению длины теломер in vitro [10]. Известно, что теломеры обладают высокой чувствительностью к повреждениям, вызванным окислительным стрессом, что, возможно, связано с высоким содержанием гуанина [30, 31]. Окислительные повреждения ДНК накап­ливаются на протяжении всей жизни клетки, что, по-видимому, приводит к ее старению. Об этом, в частности, свидетельствуют данные исследования, проведенного T. von Zglinicki и соавт. [32], в соответствии с которыми в ДНК стареющих клеток выявлено на 30% больше окисленного гуанина и в 4 раза больше свободного 8-оксо-дезоксигуанозина, чем в молодых клетках. Кроме того, активные формы кислорода, особенно гидроксильные радикалы (ОН), могут продуцировать однонитевые разрывы (либо непосредственно, либо посредством нарушения в системе репарации окислительных модификаций). В отличие от большинства последовательностей геномной ДНК, ДНК теломер менее подвержена репарации однонитевых разрывов [33] и в результате этого является более чувствительной к воздействиям факторов окислительного стресса.

Кроме того, окислительные повреждения теломерной ДНК менее эффективно репарируются по сравнению с другими последовательностями генома. Подобный дефицит репарации теломер может быть связан с предотвращением доступа ферментов репарации белком TRF2 или тем, что TRF2 подавляет фосфорилирование киназы АТМ (ataxia telangiectasia mutated gene), что приводит к нарушению ответа на повреждения ДНК [34, 35].

В неврологии окислительный стресс имеет большое значение в реализации патогенетического каскада при острых и хронических заболеваниях ЦНС - от инсульта и эпилепсии до нейродегенеративной патологии [36-38]. Его роль велика также при БП [39-41]. Среди причин, способных привести к гибели нейронов при БП, отмечают резкое понижение активности митохондриальной супероксиддисмутазы (СОД) вследствие окислительных повреждений фактора транслокации Мn-СОД [42], а также окислительные повреждения митохондрий [43]. В процессе метаболизма дофамина образуются многочисленные побочные свободнорадикальные продукты, в число которых входят супероксид-анион, перекись водорода и гидроксильные радикалы [44, 45]. Эти химически высокоактивные соединения, взаимодействуя с липидным слоем нейрональной мембраны, вызывают активацию перекисного окисления липидов, что в свою очередь приводит к нарушению целостности мембранного бислоя и в результате - к гибели нейронов.

Результаты проведенного нами исследования позволяют предположить, что меньшая длина теломер в клетках буккального эпителия может быть следствием оксидативного стресса, и показатель длины теломер может использоваться в качестве маркера БП на ранних этапах заболевания. При этом длина теломер в клетках крови непригодна для использования в качестве маркера БП.