Галактионова1 Д.Ю.

1. Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва; 2. Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, Российской академии наук, Москва; 3. Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа

Гра12 О.А.

Низамутдинов1 И.И.

Шершов1 В.Е.

Кузнецова1 В.Е.

Чудинов1 А.В.

Гареева3 А.Э.

Закиров3 Д.Ф.

Хуснутдинова3 Э.К.

Лысов1 Ю.П.

Наседкина1 Т.В.

Анализ ассоциации полиморфизма генов НТR2A, BDNF и SLC6A4 с развитием параноидной формы шизофрении и суицидального поведения

Журнал: Медицинские технологии. Оценка и выбор. ;(): 39-44

Просмотров : 15

Загрузок : 1

Как цитировать

Галактионова1 Д. Ю., Гра12 О. А., Низамутдинов1 И. И., Шершов1 В. Е., Кузнецова1 В. Е., Чудинов1 А. В., Гареева3 А. Э., Закиров3 Д. Ф., Хуснутдинова3 Э. К., Лысов1 Ю. П., Наседкина1 Т. В. Анализ ассоциации полиморфизма генов НТR2A, BDNF и SLC6A4 с развитием параноидной формы шизофрении и суицидального поведения. Медицинские технологии. Оценка и выбор. ;():39-44.

Авторы:

Галактионова1 Д.Ю.

1. Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва; 2. Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, Российской академии наук, Москва; 3. Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа

Все авторы (11)

В общей популяции риск развития шизофрении на протяжении жизни не превышает 1% [1]. В клинической психиатрии выделяют ряд форм этого заболевания. Наиболее часто (20,9%) встречающейся формой является параноидная шизофрения, которая характеризуется прогредиентным течением и выраженностью продуктивной симптоматики (бредовые идеи и галлюцинации) [3, 5].

В генетическом аспекте шизофрению относят к многофакторным наследственным заболеваниям, генетический анализ которых осложняется высоким уровнем полигенности, различным взаимодействием между генами и сложной регуляцией их экспрессии. Существуют различные точки зрения относительно характера их наследования, при этом большинство современных представлений о роли генетических факторов в развитии эндогенных психических заболеваний основаны на полигенной модели, которая предполагает совместный вклад большого количества полиморфных локусов с низкой пенетрантностью. Предполагается, что низкопенетрантные гены предрасположенности к эндогенным психическим заболеваниям могут обусловливать проявление того или иного наследуемого признака на нейробиологическом уровне, предрасполагающего к развитию психического заболевания в целом или его отдельных симптомов [1, 2].

Обнаружено и изучено множество генных вариаций, которые ассоциированы с эндогенными психозами, в частности с шизофренией. Следует отметить, что одни и те же полиморфные локусы могут быть сцеплены с различными функциональными элементами ЦНС, при этом наличие определенных полиморфных вариантов может приводить к нарушениям в функционировании этих систем, отражающимся на психике. Также следует отметить, что наличие определенных полиморфных вариантов не приводит к жестко детерминированным последствиям, а определяет лишь вероятность развития заболевания [2].

Цель работы — анализ полиморфизма потенциальных генов — кандидатов развития эндогенных психических заболеваний, которые могут быть вовлечены в этиологию и патогенез шизофрении. Это гены, кодирующие серотониновый рецептор типа 2А (HTR2A), нейротрофический фактор мозга (BDNF) и серотониновый транспортер (SLC6A4). Одновременное генотипирование по шести полиморфным локусам указанных генов проводили с использованием технологии биочипов [13].

Материал и методы

В исследование были включены образцы ДНК, выделенные из крови 198 больных шизофренией (этнические русские и татары), в числе которых было 58,5% женщин, 41,5% мужчин; 50,8% были татары, 49,2% — русские. Средний возраст больных составил 26 лет (колебания от 15 до 54 лет).

Диагноз психического заболевания устанавливали по МКБ-10. Состояние больных соответствовало рубрике F20.0 — параноидная шизофрения.

В ходе проведения исследования была выделена группа больных шизофренией, состоящая из 159 пациентов, которая была разделена на две подгруппы в зависимости от наличия (30 больных) или отсутствия (129) попыток суицида.

Контрольная группа состояла из 192 здоровых (этнические русские и этнические татары), 52,8% женщин, 47,1% мужчин; 51,3% татар, 48,7% русских. Средний возраст здоровых доноров составил 36 лет (колебания от 18 до 85 лет).

Образцы крови у больных шизофренией и здоровых брались в Республиканской клинической больнице №1 Минздрава Республики Башкортостан. Весь клинический материал был собран с соблюдением процедуры информированного согласия.

ДНК из венозной крови больных шизофренией и здоровых выделяли стандартным методом фенольной экстракции [4].

Биочипы были изготовлены методом фотоиндуцируемой совместной полимеризации олигонуклеотидов и компонентов полиакриламидного геля [13][1].

Наработку полимеразной цепной реакции продуктов (ПЦР) проводили посредством «гнездовой» мультиплексной ПЦР в два этапа. Для анализа генетической предрасположенности к шизофрении были выбраны полиморфные варианты генов-кандидатов HTR2A (rs6311 G>A, rs6313 C>T, rs6314 C>T, rs7997012 G>A), BDNF (rs6265 G>A) и SLC6A4 (rs28914832). ПЦР проводили при стандартных условиях, как описано ранее [7].

Полученные на втором этапе мультиплексной ПЦР флюоресцентно меченные образцы использовали для гибридизации на биочипе. Гибридизационная смесь общим объемом 35 мкл включала в себя 5xSSPE («Promega», США), 25% формамид («Sigma», США) и флюоресцентно меченный амплификат. Смесь 5 мин денатурировали при 95 °С, быстро (1 мин) охлаждали на льду, наносили на биочип и оставляли на 12—14 ч при 37 °С. После завершения инкубации гибридизационную камеру удаляли вместе с непрореагировавшей гибридизационной смесью, биочип отмывали в 1xSSPE («Promega», США) в течение 10 мин при комнатной температуре, высушивали и проводили регистрацию флюоресцентных сигналов. Флюоресцентный сигнал с ячеек биочипа регистрировали с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного камерой ПЗС и программным обеспечением Imageware («Биочип-ИМБ», Россия) [7].

Секвенирование образцов ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems.

Статистический анализ был проведен с использованием прикладной программы GraphPad InStat 3.05 («GraphPad Software Inc.», США). Для проверки соответствия распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди—Вайнберга использовали стандартный метод &khgr;2. Для выявления ассоциации полиморфных вариантов генов с развитием заболевания применяли двусторонний точный тест Фишера, а также &khgr;2-тест с поправкой Йетса при анализе ассоциаций на малых выборках. В расчетах, приведенных в данной работе, использовали статистический параметр ОШ (отношение шансов), значение которого представляет собой отношение шансов события в одной группе к шансам события в другой группе и позволяет оценивать риск развития заболевания при определенном генотипе. Различия считали статистически значимыми при достигнутом уровне значимости р<0,05. В представленных в работе расчетах параметр ОШ указан с 95% доверительным интервалом (ДИ 95%).

Анализ сочетанных взаимодействий был проведен с применением программы MDR (Multifactor-Dimensionality Reduction, http://www.multifactordimensionalityreduction.org/), позволяющей выявить оптимальную модель сочетанного влияния полиморфизма генов на развитие заболевания [9].

Результаты и обсуждение

Для анализа полиморфизма генов HTR2A, BDNF и SLC6A4 разработан биочип, схема которого представлена на рисунке (фрагмент а).

Биочип для анализа полиморфизма в генах — кандидатах развития шизофрении SLC6A4, HTR2A и BDNF.
Примечание. а - схема расположения олигонуклеотидных зондов. Ячейки серого цвета в двух верхних строках соответствуют олигонуклеотидам, комплементарным последовательностям «дикого типа» (мажорный вариант гена), ячейки белого цвета в двух нижних строках - последовательностям «мутантного типа» (минорный вариант гена); б - пример гибридизационной картины, полученной на биочипе для образца ДНК с генотипом SLC6A4 rs28914832 (A/A); HTR2A rs6311 (G/A), rs6313 (C/T), rs6314 (C/C), rs7997012 (G/A); BDNF rs6265 (G/A); в - диаграмма значений относительных сигналов интенсивности флюоресценции ячеек биочипа, нормированных на значение максимального сигнала в паре «дикий тип - мутация» по каждому полиморфному маркеру.
Все зонды на биочипе продублированы для контроля воспроизводимости результатов гибридизации. Пример гибридизационной картины, полученной на биочипе для анализа полиморфизма в генах — кандидатах развития шизофрении HTR2A, BDNF и SLC6A4, а также диаграммы значений относительных сигналов интенсивности флюоресценции для каждого изученного полиморфного варианта представлены на рисунке (фрагменты б и в). Достоверность определения генотипов посредством гибридизации на биочипе была подтверждена секвенированием.

С помощью разработанного биочипа определены частоты генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов HTR2A, BDNF и SLC6A4 у больных шизофренией и здоровых доноров, представителей русского и татарского этносов (табл. 1—4).

Таблица1

]]>
Таблица2

]]>
Таблица3

]]>
Таблица4

]]>
Поскольку частоты генотипов и аллелей по генам HTR2A, BDNF и SLC6A4 в группах больных и здоровых индивидов практически не отличались внутри групп при разделении их на подгруппы по этнической принадлежности, это позволило объединить этнических татар и этнических русских и проводить сравнительный анализ в объединенных по этносу группах больных шизофренией и здоровых доноров. Для всех локусов, кроме rs7997012 гена HTR2A (выборка здоровых доноров, &khgr;2=6,74, p<0,01), распределение в группах больных шизофренией и здоровых индивидов соответствовало равновесию Харди—Вайнберга.

В результате анализа ассоциации исследуемых полиморфизмов было показано, что частота Т аллеля по полиморфизму rs6314 C>T гена HTR2A в выборке больных параноидной шизофренией в 2,1 раза ниже, чем в группе здоровых доноров (ОШ=0,44, 95% ДИ=0,24—0,84, p=0,014).

Соответственно генотипы С/T и Т/T по полиморфизму rs6314 C>T гена HTR2A в выборке больных параноидной шизофренией встречаются статистически значимо реже, чем в группе здоровых индивидов (ОШ=0,45, 95% ДИ=0,23—0,87, p=0,017). Результаты свидетельствуют о протективном действии T аллеля и Т/-генотипов по полиморфизму rs6314 C>T гена HTR2A в развитии параноидной шизофрении. Статистически значимых различий по частотам генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов HTR2A (rs6311, rs6313 и rs7997012), BDNF (rs6265) и SLC6A4 (rs28914832) между группами больных шизофренией и психически здоровых доноров не было выявлено.

Также был проведен анализ сочетанных взаимодействий с использованием MDR алгоритма по локусам: HTR2A (rs6311 G>A, rs6313 C>T, rs6314 C>T, rs7997012 G>A) и BDNF (rs6265 G>A). К сочетанию, статистически значимо ассоциированному с повышенным риском развития заболевания, была отнесена комбинация генотипов гена HTR2A rs6311 G/-, rs6313 C/-, rs6314 C/C, rs7997012 G/- (ОШ=1,64, 95% ДИ=1,10—2,46, p=0,019).

Полученные данные соответствуют представлениям о том, что ген HTR2A играет важную роль в этиологии шизофрении. Имеются данные об ассоциации шизофрении с полиморфными локусами промоторной области rs6311 G>A [14] и кодирующих регионов rs6313 C>T [10] и rs6314 C>T [11] гена HTR2A. Локус rs6311 G>A находится в неравновесном генетическом сцеплении с локусом rs6313 C>T, предполагается, что именно rs6311 G>A имеет функциональное значение, поскольку способен модулировать активность гена HTR2A [10]. Кроме того, показана ассоциация полиморфизма rs7997012, расположенного в интроне гена HTR2A, с ответом на лечение циталопрамом [12].

Помимо этого, был проведен анализ ассоциации в группах больных шизофренией с попытками суицида и без таковых. Частоты A аллеля по полиморфизму rs6311 G>A (ОШ=0,43, 95% ДИ=0,22—0,83, p=0,017) и T аллеля по полиморфизму rs6313 C>T (ОШ=0,42, 95% ДИ=0,22—0,81, p=0,013) гена HTR2A были ниже у пациентов с попытками суицида, чем у пациентов без таковых. Статистический анализ также выявил различия в частотах генотипов А/- по полиморфизму rs6311 G>A (ОШ=0,33, 95% ДИ=0,15—0,76, p=0,013) и T/- по полиморфизму rs6313 C>T (ОШ=0,31, 95% ДИ=0,14—0,71, p=0,007) гена HTR2A между группами больных шизофренией с попытками суицида и без таковых. Таким образом, наличие A аллеля и генотипов А/- по полиморфизму rs6311 G>A, а также T аллеля и генотипов T/- по полиморфизму rs6313 C>T может оказывать протективное действие в формировании суицидального поведения у больных параноидной формой шизофрении. В свою очередь гомозиготные генотипы G/G по полиморфизму rs6311 G>A (ОШ=3,01, 95% ДИ=1,32—6,88, p=0,013) и С/С по полиморфизму rs6313 C>T (ОШ=3,22, 95% ДИ=1,41—7,37, p=0,008) гена HTR2A ассоциированы с формированием суицидального поведения у больных параноидной шизофренией.

Совместный анализ генотипов по двум локусам rs6311 G>A и rs6313 C>T гена HTR2A в объединенной выборке, включающей здоровых доноров и больных параноидной шизофренией, показал, что в выборках присутствуют три мажорных сочетания генотипов: GG/CC (41,2%), GA/CT (46,6%) и AA/TT (10,6%). В 2,6% случаев были обнаружены редкие сочетания генотипов GG/СT (1,3%) и AA/CT (0,3%), остальные генотипы представлены не были. Полученные данные позволяют с высокой степенью достоверности (p<0,001) считать, что минорные аллели данных полиморфизмов сцеплены в цис-конфигурации, а транс-конфигурация встречается редко. Эти данные находятся в соответствии с фактом неравновесия по сцеплению между маркерами rs6311 G>A и rs6313 C>T и согласуются с представлениями о взаимосвязи полиморфных локусов внутри гена рецептора серотонина 2А с суицидальным поведением [6, 8, 10, 15].

Сконструированный и использованный в настоящей работе биочип для анализа полиморфизма в генах — кандидатах развития шизофрении HTR2A, BDNF и SLC6A4 позволил с высокой точностью определить их аллельные варианты. Обнаружена статистически значимая ассоциация полиморфных вариантов гена HTR2A с развитием параноидной формы шизофрении и формированием суицидального поведения у больных шизофренией. Полученные результаты согласуются с многочисленными исследованиями, согласно которым изменения в гене HTR2A лежат в основе суицидального поведения и функциональных нарушений, приводящих к эндогенным психозам, в том числе параноидной шизофрении. Предполагается, что дальнейший поиск генетических маркеров, ассоциированных с развитием и течением шизофрении, позволит разработать эффективные методы диагностики и лечения заболевания.

Работа выполнена при поддержке программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (ГК №02.740.11.0869 и №02.527.11.0006).



[1] 1Нуклеотидные последовательности праймеров и иммобилизированных олигонуклеотидов могут быть получены у авторов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail