Формирование любого очага ишемического повреждения сопровождается синтезом и секрецией широкого спектра регуляторных пептидов, направленной миграцией воспалительных клеток, активацией разнообразных сигнальных молекул.

За последние годы были опубликованы результаты большого количества работ, расширивших представления об участии иммунно-воспалительных процессов в патогенезе ишемического инсульта и инфаркта миокарда.

На кафедре фундаментальной и клинической неврологии и нейрохирургии Российского государственного медицинского университета также был проведен ряд исследований в этом направлении, начавшихся в конце 90-х годов прошлого столетия и продолжающихся по настоящее время.

Так, нами было показано, что при формировании инфарктных изменений в ткани мозга человека имеется дисбаланс цитокинового статуса с дефицитом защитных противовоспалительных интерлейкинов и трофических факторов [1, 2]. Была также выявлена тесная корреляция выраженности иммунобиохимических изменений с тяжестью и клиническим исходом инсульта [2]. Другое исследование, выполненное совместно с НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, показало значимую роль аутоиммунных процессов в ишемическом повреждении головного мозга [3, 4]. Полученные данные свидетельствуют, что высокий индекс соотношения первичных и вторичных аутоантител может являться критерием «остроты» аутоиммунных процессов и, следовательно, патологической проницаемости гематоэнцефалического барьера. Дополнили представления об участии аутоиммунных реакций в развитии фокальной ишемии головного мозга результаты еще одной работы по изучению уровня и динамики криоглобулинемии (отражающей аутоиммунную сенсибилизацию) у больных с обсуждаемой патологией. Была показана диагностическая и достоверная прогностическая значимость криоглобулинемии и ее участие в развитие микроциркуляторных и гемореологических нарушений в остром периоде ишемического инсульта [5, 6].

Активация клеток иммунной системы приводит к выработке разнообразных эффекторных молекул (цитокинов и других медиаторов иммунного ответа, воспаления и регенерации), к развитию и реализации реакций врожденного и адаптивного иммунного ответа [7]. Было показано, что активация клеток врожденной иммунной системы происходит через особые рецепторы - Toll-подобные рецепторы (TLR), принадлежащие к семейству трансмембранных рецепторов [8, 9]. Первым у человека был идентифицирован TLR4 [10], а в настоящее время описаны уже 13 видов TLR, некоторые из которых локализуются на поверхности клеток (например, TLR2, TLR4), а другие - расположены внутриклеточно на эндосомальных мембранах (например, TLR3, TLR7, TLR8) [8,11].

Характер и интенсивность ответа, опосредуемого TLR, определяется не только типом стимулируемого рецептора, но и зависит от вызывающего эту стимуляцию лиганда.

Известны несколько видов лигандов, которые могут быть распознаны TLR: различные компоненты микроорганизмов, искусственно синтезированные молекулы и эндогенные лиганды. Эндогенными лигандами для TLR могут являться белки теплового шока (БТШ), модифицированные липопротеиды низкой плотности (ЛПНП), фибриноген, домен А фибронектина и многие другие.

В то время как физиологические концентрации эндогенных лигандов не вызывают активации клеток иммунной системы, при повреждении тканей (например, ишемическом) их концентрация значительно возрастает, что сопровождается активацией TLR [12].

Связывание соответствующих лигандов с TLR инициируют каскад биохимических реакций, активирующих NFκB (ядерный фактор транскрипции каппа), и вслед за этим индуцируется экспрессия широкого спектра генов регуляторных пептидов и молекул [13].

Врожденный иммунитет реагирует не только на системную бактериальную инфекцию, но и на повреждение вещества головного мозга [14, 15]. Активация компонентов врожденного иммунитета имеет место в головном мозге и осуществляется посредством TLR4, которые синтезируются микроглией и астроцитами в ответ на воспалительный процесс в ЦНС [15, 16]. Ранее считалось, что синтез TLR ограничен микроглией, однако стало известно, что TLR могут быть синтезированы и нейронами в ответ на экзо- (РНК вирусов, белки бактерий) или эндогенное воздействие [17, 18].

Согласно последним исследованиям, нейровоспалительный ответ, обусловленный экспрессией TLR4 астроцитами и микроглией, имеет более важное значение в патогенезе инсульта, чем экспрессия этих же рецепторов нейтрофилами, инфильтрирующими зону ишемии [16, 19-21]. Хотя не исключено, что данная точка зрения будет пересмотрена.

По данным S. Tang и соавт. [22], нейрональные TLR играют ведущую роль в индуцировании нейрональной смерти в течение первых нескольких часов после инсульта, в то время как активация TLR микроглии поддерживает воспаление в зоне пенумбры. Кроме того, TLR4 экспрессируются сосудистыми эндотелиальными клетками. При этом иммунореактивность сосудов головного мозга очень низкая (в норме TLR2 и TLR4 выявлены в минимальном количестве или отсутствовали) [23]. Предположительными эндогенными лигандами TLR в ЦНС являются БТШ, принадлежащие семействам БТШ-60 и БТШ-70, а также гиалуронан. Так, было показано, что уровень БТШ-70 повышался вместе с уровнем TLR2 и TLR4 в ответ на дефицит энергии и стрессовое воздействие [21].

D. Enquobahrie и соавт. [24] в популяционном исследовании определяли влияние вариаций гена TLR4 на возникновение у людей нефатального инфаркта миокарда и инсульта. В исследование были включены 848 пациентов с инфарктом миокарда, 368 - с ишемическим инсультом и 2682 пациента контрольной группы, в которую вошли больные с артериальной гипертонией и женщины в постклимактерическом периоде. Было установлено, что вариации гена TLR4 ассоциировались с возникновением инфаркта миокарда: так, малая аллель гена TLR4 с заменой одного нуклеотида - rs1927911 - коррелировала с низким уровнем развития инфаркта миокарда в изучаемой популяции. В данном исследовании не было обнаружено достоверных корреляций модификаций гена TLR4 и ишемического инсульта. Однако в популяции этнических китайцев в Тайване была выявлена достоверная ассоциация между полиморфизмом гена TLR4 - 119A - и развитием ишемического инсульта [25].

Доказано вовлечение врожденного иммунитета в нейровоспаление посредством активации TLR4 экзогенным стрессом. Низкий уровень воспалительного ответа и лучшие результаты поведенческих тестов были зафиксированы у мышей с дефицитом TLR4 по сравнению с нормальными мышами после воздействия на них стресса, связанного с временной иммобилизацией. При этом уровень кортикостерона в обеих группах был одинаковый [26]. Было обнаружено, что мыши с дефицитом TLR4 имеют меньший по объему очаг ишемии и более низкий уровень воспалительного ответа после экспериментальной окклюзии средней мозговой артерии по сравнению с мышами, «нормальными» по изучаемому признаку [20]. Исследования показали повышение экспрессии TLR2 и TLR4 в корковых нейронах в ответ на ишемическое повреждение и представили нейроны с дефицитом TLR2 и TLR4 резистентными к гибели, вызванной ишемией. Однако F. Hua и соавт. [27] доказали, что TLR4 и TLR2 являются антагонистами. Целью данного исследования было выявление роли TLR4 и TLR2 в ишемически-реперфузионном повреждении головного мозга на экспериментальной модели ишемического инсульта. Для этого определяли размер инфаркта, выраженность утраты неврологических функций, показатель смертности у мышей, нокаутных по TLR2 и TLR4, по сравнению с диким типом, а также были исследованы степень активации NFκВ, ERK1/2 (extracellular signal regulated protein kinases 1 and 2) и PI3K/Akt (phosphatidylinositide 3-kinase/protein kinase B).

Было обнаружено достоверное уменьшение зоны инфаркта у мышей, нокаутных по TLR4, тогда как у TLR-нокаутных мышей размер инфаркта увеличивался по сравнению с диким типом мышей через 24 ч после окклюзии средней мозговой артерии. Гистологически у TLR2-нокаутных мышей отмечалась более обширная зона некроза по сравнению с диким типом мышей или мышей, нокаутных по TLR4.

У дикого типа мышей церебральная ишемия вела к активации локуса ДНК, ответственного за синтез NFκВ по сравнению с контролем (1,26±0,03 против 1,05±0,01, p<0,05), у мышей, нокаутных по TLR4, данная активация не происходила и уровень NF κВ после церебральной ишемии был достоверно ниже, по сравнению с диким типом (1,09±0,02 против 1,26±0,03, p<0,05). Однако, у нокаутных по TLR2 мышей имело место достоверное увеличение концентрации NF κВ по сравнению с TLR4-нокаутными мышами (1,31±0,02 против 1,09±0,02, p<0,05).

M. Ojaniemi и соавт. [28] показали, что активация PI3K/Akt играет нейропротекторную роль. Был исследован уровень фосфорилированного Akt (p-Akt) в ткани головного мозга. У нокаутных по TLR4 мышей после ишемически-реперфузионного повреждения уровень p-Akt был достовено выше, чем у дикого типа. Напротив, у мышей, нокаутных по TLR2, уровень p-Akt в ткани мозга после повреждения не изменялся и был достоверно ниже чем у TLR4-нокаутных мышей (0,2±0,03 против 0,9±0,16, p<0,05).

Такая же зависимость была определена для ERK1/2, члена протеиновых киназ активаторов митогена, выполняющих нейропротективную роль [29]. Уровень фосфорилированного ERK1/2 (p-ERK1/2) после ишемического повреждения головного мозга у нокаутных по TLR2 мышей (0,8±0,06) был достоверно ниже, чем у мышей, нокаутных по TLR4 (1,3±0,17).

Таким образом, исходя из проведенных исследований, можно сделать вывод о разнонаправленной роли TLR4 и TLR2 в патогенезе ишемического повреждения головного мозга. Стимуляция TLR4 приводит к усугублению патологического процесса, увеличению размера инфаркта, тогда как активация TLR2 играет скорее протекторную роль. Следовательно, различная модуляция TLR2/TLR4, возможно, будет являться в будущем одним из подходов для смягчения ишемически-реперфузионного повреждения головного мозга.

Последние несколько лет активно изучается роль TLR4 в развитии ишемического повреждения миокарда. По данным генетических исследований, у мышей, нокаутных по TLR2 и TLR4, при моделировании острой ишемии миокарда формируется меньший объем поражения по сравнению с мышами дикого типа [30, 31].

Клинические данные также свидетельствуют об активации TLR и их сигнальных путей при развитии ишемии миокарда [32]. Так, исследования Н. Methe и соавт. [33] показали, что пациенты с инфарктом миокарда и нестабильной стенокардией имеют значительно более высокую экспрессию TLR4 моноцитами по сравнению с контрольной группой, так же как и уровень их эндогенных лигандов - БТШ.

М. Satoh и соавт. [34] выявили, что очаг ишемического повреждения миокарда является источником повышенного уровня в кровотоке БТШ, что сопровождается повышенной продукцией провоспалительных цитокинов моноцитарно-макрофагальной системой. В то же время результаты С. Hunter-Lavin и соавт. [35] свидетельствуют о том, что БТШ преимущественно выделяются из мононуклеарных клеток периферической крови.

Клиническая значимость изменений функционального состояния клеток периферической крови при развитии инфаркта миокарда в настоящее время активно изучается и уже продемонстрирована в некоторых исследованиях [36, 37].

Проведенное на кафедре иммунологии РГМУ исследование показало, что у больных с острым инфарктом миокарда повышена активность мононуклеарных клеток крови и увеличена выработка ФНО-альфа при действии лигандов TLR2/TLR6 и TLR4 [38].

Первоначально TLR были идентифицированы на тех клетках организма, которые несут на себе защитные и барьерные функции: нейтрофилы, макрофаги, дендритные клетки, эндотелиальные и эпителиальные клетки. На сегодняшний день эти рецепторы обнаружены на большинстве клеток организма, включая кардиомиоциты и даже нейроциты. При воздействии на них соответствующих лигандов, при ишемическом повреждении - эндогенных, активация TLR приводит к повышению выработки провоспалительных цитокинов и других сигнальных пептидов и молекул.

Было показано, что моноциты/макрофаги и В-клетки мышей с нокаутом гена TLR4 не синтезировали при стимуляции значимого уровня провоспалительных цитокинов [39].

Также установлено, что ключевым фактором, определяющим синтез и секрецию провоспалительных цитокинов периферическими моноцитами, является наличие у них комплекса CD14 и TLR4 [40].

Эндогенные лиганды («сигналы опасности»), образующиеся в результате деструкции клеток (например, БТШ), способны активировать TLR. Большинство эндогенных лигандов взаимодействуют с TLR2, TLR4 и CD14. Однако РНК, высвобождающаяся из некротизированных клеток или при фагоцитозе некротизированных клеток и их компонентов, могут активно взаимодействовать с дендритными или другими клетками иммунной системы. Данное взаимодействие способствует трансдукции сигнала через TLR3 и ведет к развитию специфического иммунного ответа in vivo [41].

В первые часы и дни начала формирования любого очага ишемического повреждения активация TLR способствует реализации адекватного иммунно-воспалительного ответа на повреждение и инициации процессов тканевой репарации. Длительная или чрезмерная активации описываемых рецепторов приводит к избыточному накоплению цитокинов и других медиаторов иммунного ответа, что может сопровождаться дополнительным повреждением тканей.

Так, в исследовании Y. Xia и соавт. [42] было доказано вовлечение TLR4 в формирование воспалительного ответа, вызванного введением липополисахаридов в желудочки головного мозга. При этом повышение уровня TLR4 ассоциировалось с нейрональной гибелью, инфильтрацией ткани мозга лейкоцитами и было обнаружено более всего в мягкой мозговой оболочке, сосудистых сплетениях и эпендиме желудочков.

Негативное влияние избыточной активации TLR продемонстрировано и при инфаркте миокарда. Например, в экспериментальных работах на мышах было показано, что при моделировании у них инфаркта миокарда, если заболевание осложняется развитием сердечной недостаточности, в миокарде обнаруживаются локальные участки повышенной экспрессии TLR4, тогда как в норме экспрессия TLR4 в миокарде мыши является диффузной [43].

Аналогичные данные были получены и у больных людей. Среди пациентов с инфарктом миокарда повышенный риск развития сердечной недостаточности наблюдается при повышенной активации TLR [34, 38].

Важная роль TLR, эволюционно законсервированного компонента врожденной иммунной системы, не вызывает сомнений в патогенезе ишемического повреждения сердца и головного мозга. Известно, что каротидный и коронарный атеросклероз являются одной из главных причин развития ишемии головного мозга и сердца соответственно. В свою очередь, в основе формирования атеросклеротического повреждения лежат воспалительные процессы, в инициации которых участвуют инфекционные агенты [44-46]. Значение TLR в патогенезе атеросклероза активно изучается в последние годы [11].

По данным генетических исследований, при скрещивании TLR4-нокаутных мышей c нокаутными по гену аполипопротеина Е (Apoe) мышами, склонными к атеросклерозу, было получено двойное гомозиготное потомство, характеризовавшееся сниженной степенью развития атеросклероза [47].

В другом исследовании двойные гомозиготные мыши, полученные после скрещивания двух нокаутных линий мышей (по TLR2 и гену Ldlr-рецептору к ЛПНП), имели меньшую склонность к атеросклерозу по сравнению с контрольной группой [48].

Повышенное содержание в плазме ЛПНП отчетливо связано с развитием коронарного и каротидного атеросклероза. Для того, чтобы ЛПНП стали атерогенными, они должны подвергнуться модификации. Причиной модификации чаще всего служат процессы перекисного окисления ЛПНП [49].

Как указывалось выше, модифицированные ЛПНП являются эндогенными лигандами для TLR. In vitro высокие концентрации окисленных ЛПНП вызывают повышение экспрессии TLR4 и CD14 на моноцитах и макрофагах [50, 51].

По данным J. Holloway и соавт. [52], в норме TLR4 представлен в стенке артерий в небольшом количестве. В атеросклеротической бляшке экспрессия TLR2 и TLR4 значительно повышается, особенно в области плеча, там, где бляшка более всего подвержена разрыву.

Генетические исследования выявили достоверную ассоциацию между Asp299Gly аллеля TLR4 и снижением риска развития атеросклероза и острого коронарного синдрома [53].

В исследовании K. Michelsen и соавт. [54] было обнаружено, что у мышей с дефицитом TLR4 выраженность атеросклеротического процесса достоверно снижена по сравнению с контрольной группой.

Также было показано, что активация TLR2 экзогенными лигандами вносит вклад в образование рестеноза после имплантации стентов, стимулируя формирование неоинтимы и развитие атеросклероза после сосудистого повреждения [47, 48].

Учитывая место TLR в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний и инсульта, TLR4 может являться терапевтической мишенью для лечения данной патологии. D.Vanags и соавт. [55] получили положительные результаты двойного слепого исследования эффективности шаперона 10 (hsp10), являющегося ингибитором TLR4, в лечении пациентов с ревматоидным артритом. Данный эффект связывают со снижением активности воспалительного процесса путем блокирования TLR. Так как из изложенного выше очевидно, что TLR4 играет значимую роль в патогенезе атеросклероза, возможно, hsp10 будет обладать антиатеросклеротической активностью [56].

Традиционные средства в лечении атеросклероза - статины - также изучались по их влиянию на активность TLR. Было показано, что статины могут снижать синтез TLR4 моноцитами in vivo и in vitro [57]. При этом данный эффект являлся дозозависимым и не был связан с уровнем холестерина в периферической крови.

TLR играют важную роль в патогенезе ишемического повреждения. Активируясь в ответ на повышение концентраций соответствующих эндогенных лигандов, TLR инициируют синтез провоспалительных цитокинов и других факторов, непосредственное участие которых в ишемическом повреждении доказано. Можно считать, что дальнейшие исследования в данном направлении являются весьма перспективными и, возможно, дадут новую ветвь в терапии такого социально значимого заболевания, как атеросклероз и его осложнений - инсульта и инфаркта миокарда.