Анализ ассоциации полиморфизма генов, кодирующих рецепторы цитокинов, с клиническими характеристиками рассеянного склероза

Одной из важных характеристик рассеянного склероза (РС), тяжелого хронического заболевания ЦНС, характеризующегося аутоиммунным воспалением, нейродегенерацией и прогрессирующей неврологической дисфункцией [1], является его клиническая гетерогенность. Даже в пределах наиболее часто встречающейся ремиттирующей формы РС у пациентов варьируют клинические признаки, включая симптомы дебюта, тяжесть течения, длительность ремиссий и др. Такая гетерогенность не дает возможности однозначно прогнозировать темп развития заболевания и скорость инвалидизации [2], что вызывает трудности в разработке соответствующих терапевтических подходов.

Высказывались предположения [3, 4], что в основе клинической гетерогенности РС может лежать гетерогенность генетическая. Конкордантность в семьях по ряду клинических фенотипов, вариабельность клинического течения РС в разных этнических группах указывают на то, что генетический полиморфизм может влиять на клиническую картину РС [4]. В свою очередь некоторые клинические характеристики РС, такие как симптомы, отражающие начало болезни, длительность ремиссий, частота и тяжесть обострений, возраст пациента в период дебюта заболевания, могут использоваться для предсказания тяжести дальнейшего течения заболевания [5].

Генетические исследования, проведенные с помощью полногеномного поиска ассоциаций (genome-wide association study — GWAS) с клиническим течением РС [6, 7], не дали совпадающих результатов, что делает актуальным поиск генетических вариантов, ассоциированных с клиническими фенотипами РС, с использованием генов-кандидатов. При этом особый интерес представляет анализ возможного участия генов, связанных с предрасположенностью к РС и модификацией его клинического течения [8, 9]. К числу таких генов относятся IL7RA, IL2RA и TNFRSF1A, кодирующие рецепторы цитокинов. Эти рецепторы являются важнейшими участниками сигнальных путей интерлейкина (ИЛ)-7, ИЛ-2 и фактора некроза опухолей (ФНО) и во многом определяют развитие и функционирование клеток иммунной системы. Ассоциация полиморфных вариантов этих генов с предрасположенностью к РС была выявлена в одном из обзоров GWAS [10] и подтверждена в нескольких популяциях [8, 9, 11]. В ряде исследований [8, 9, 12] была обнаружена ассоциация полиморфных вариантов генов, кодирующих рецепторы цитокинов, не только с риском РС, но и с рядом его клинических характеристик. Однако полученные результаты не могут быть однозначно перенесены на другие этносы и предполагают проведение специальных исследований.

Цель настоящей работы — проведение анализа ассоциации полиморфизма генов IL7RA (rs6897932), IL2RA (rs2104286) и TNFRSF1A (rs1800693) с тяжестью течения РС, а также с двумя ранними клиническими характеристиками ремиттирующего РС — вариантом манифестации РС и длительностью первой ремиссии. Принимая во внимание полигенную природу РС, мы также провели мультилокусный анализ для поиска сочетаний аллелей/генотипов исследуемых генов, ассоциированных с клиническими характеристиками РС.

Для ретроспективного исследования использовали образцы геномной ДНК 508 неродственных больных РС, этнических русских (табл. 1). Диагноз Р.С. поставлен согласно критериям МакДональда [13], у всех больных РС начинался в ремиттирующей форме.

Все больные давали информированное согласие на использование их ДНК для исследования и сообщали необходимую эпидемиологическую информацию.

Для выделения из крови ДНК применяли модифицированный метод с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ [14].

Геномное типирование проводили методами, основанными на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для анализа однонуклеотидного полиморфизма (SNP) c.731С>Т в экзоне 6 гена IL7RA (rs6897932) использовали метод аллелеспецифической ПЦР, для SNP 10228A>G в 1 интроне гена IL2RA (rs2104286) — метод ПЦР в реальном времени с помощью технологии TaqMan, для SNP 16253T>C в 6-м интроне гена TNFRSF1A (rs1800693) — метод ПЦР с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов [15].

При статистическом анализе результатовотклонение частот генотипов от равновесия Харди—Вайнберга оценивали с помощью критерия χ². Сравнение распределений клинических параметров в подгруппах больных РС проводили с помощью U-критерия Манна—Уитни, рассчитанного с применением программы «GraphPad InStat». Анализ ассоциации исследуемого SNP с клиническими характеристиками РС проводили, оценивая значимость различий частот носительства генотипов в сравниваемых группах по двустороннему критерию Фишера (р_f). Для анализа возможной ассоциации сочетаний аллелей и генотипов с клиническими признаками РС использовали программное обеспечение (ПО) APSampler [16]. Силу ассоциаций выражали величиной отношения шансов (ОШ). Значимыми считались ассоциации, у которых 95% доверительный интервал (ДИ) для ОШ не пересекал 1, а значение p_f было меньше 0,05.

Проведено геномное типирование полиморфных участков генов IL7RA (rs6897932), IL2RA (rs2104286) и TNFRSF1A (rs1800693), кодирующих рецепторы цитокинов, в образцах ДНК 508 больных с ремиттирующим или вторично-прогрессирующим РС, этнических русских. Отклонений распределения наблюдаемых частот генотипов всех исследуемых полиморфных участков от равновесия Харди—Вайнберга не наблюдали.

Тяжесть течения РС оценивали по шкале MSSS [17]; значения варьировали от 0,13 до 9,09, с медианой 3,1 (см. табл. 1).Для исследования ассоциации вариантов генов с тяжестью РС больных РС стратифицировали на две группы. В первую группу вошли пациенты с показателем по шкале MSSS >3 баллов (260 человек), что характеризует среднее и тяжелое течение РС (диапазон MSSS составляет 3,05—9,09, медиана 4,57). Вторую группу составили больные с показателем по шкале MSSS >3 баллов включительно (248 человек), что характеризует относительно легкое течение РС (диапазон MSSS составляет 0,13—2,95, медиана 1,77) [12].

Анализ частот носительства аллелей и генотипов исследуемых полиморфных участков показал, что частота носительства аллеля C гена TNFRSF1A (сумма генотипов С/С и C/T) выше в группе больных с MSSS>3 (p=0,018, ОШ [95% ДИ]=1,7 [1,1—2,5]), а генотипа T/T выше у больных с MSSS≤3 (табл. 2). Таким образом, носительство аллеля С позитивно ассоциировано с более тяжелым течением Р.С. Для других полиморфных участков значимых ассоциаций с тяжестью течения РС не выявлено.

Достоверно оценить тяжесть течения РС по шкале MSSS можно только через достаточно продолжительное время. Поэтому ценность представляют ранние клинические признаки, которые в той или иной степени могут прогнозировать течение РС для данного пациента. В ряде исследований показано, что варианты манифестации (ВМ) РС ассоциированы с дальнейшим течением заболевания [2, 18]. К прогностически благоприятным ВМ отнесены оптический неврит и нарушения чувствительности; к неблагоприятным — нарушения функций ствола мозга, координации, нарушения двигательных, тазовых или психических функций, а также полисимптомная манифестация Р.С. Опираясь на эти данные, мы разделили больных РС на две группы. В одну группу вошли 236 больных с манифестацией РС в виде оптического неврита или нарушений чувствительности, другую группу составили 272 больных с другими В.М. Характеристики клинического течения РС у этих групп больных РС представлены в табл. 3.

Действительно, и показатель инвалидизации (по шкале EDSS), и показатель тяжести РС (по шкале MSSS) у больных, принадлежащих к этим группам, высокозначимо различались между собой (p=0,0042 и 0,0013 соответственно) и были ниже у больных с манифестацией РС в виде оптического неврита или нарушений чувствительности (далее — группа с благоприятными ВМ), чем с другими, неблагоприятными В.М. Таким образом, мы подтвердили применимость предложенного разделения ВМ на благоприятные и неблагоприятные к исследуемой выборке больных РС.

Анализ частоты носительства вариантов гена TNFRSF1A в группах больных, стратифицированных по ВМ РС (табл. 4), выявил позитивную ассоциацию носительства генотипа C/C с неблагоприятными ВМ (p=0,015, ОШ [95% ДИ]=1,7 [1,1—2,5]) и, соответственно, ассоциацию носительства аллеля Т (сумма генотипов T/T и C/T) с благоприятными В.М. При анализе частоты носительства вариантов других генов значимых различий между анализируемыми группами больных РС не выявлено.

В некоторых исследованиях было показано, что длительность первой ремиссии (ПР), т. е. промежутка времени между первым и вторым обострениями, более 1 года может коррелировать с благоприятным клиническим течением РС, в то время как непродолжительная ПР (не более 1 года), ассоциирована с неблагоприятным течением РС [2, 19]. Для анализа ассоциации исследуемых полиморфных участков с длительностью ПР больные РС были разделены на две группы: 262 больных с длительностью ПР ≤1 года и 246 больных с ПР >1 года. Сравнение клинических характеристик этих групп больных РС см. в табл. 3. Хотя эти группы не отличаются по значениям EDSS, между ними наблюдаются высокозначимые различия по показателю прогрессирования MSSS (p<0,0001). Более высокое значение MSSS у больных РС с непродолжительной ПР по сравнению с больными, у которых ПР продолжалась дольше года, свидетельствует о том, что и в нашей выборке непродолжительная ПР ассоциирована с неблагоприятным течением Р.С. Однако сравнение частот носительства аллелей и генотипов исследуемых SNP в группах с разной продолжительностью ПР не выявило ни для одного из исследованных полиморфных участков значимых различий между группами больных РС с ПР ≤1 года и ПР >1 года.

С помощью мультилокусного анализа предпринят поиск ассоциаций сочетаний вариантов исследованных генов со всеми анализируемыми клиническими характеристиками РС. В этот анализ включили также полиморфный участок гена CTLA4 (rs231775), для которого мы наблюдали ранее ассоциацию носительства аллеля CTLA4*G с короткой ПР (не более 1 года) [20]. Этот ген кодирует корецептор Т-лимфоцитов CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte antigen 4), влияющий на уровень активации Т-лимфоцитов.

Выявлены биаллельные сочетания, ассоциированные с длительностью ПР (табл. 5). Носительство сочетания (CTLA4*G + TNFRSF1A*C) оказалось ассоциировано с ПР ≤1 года (р=0,0026; ОШ=1,7 [1,2—2,4]) более значимо, чем носительство одного CTLA4*G (для CTLA4*G р=0,044, ОШ=1,5 [1—2,2] [20]). Выявлено также еще одно сочетание (CTLA4*G/G + IL7RA*T), ассоциированное с ПР ≤1 года (р=0,0058; ОШ=2,8 [1,3—6,1]). Мультилокусный анализ не выявил сочетаний аллелей/генотипов, ассоциированных с другими клиническими характеристиками РС более значимо, чем входящие в их состав одиночные аллели/генотипы.

Данные, полученные при анализе ассоциации исследуемых полиморфных участков с различными клиническими характеристиками РС, обобщены на рисунке. Наряду с описанной ранее ролью CTLA4 как гена-модификатора клинического течения РС [20], в формирование клинической картины РС безусловный вклад вносит полиморфный локус гена TNFRSF1A. Аллель TNFRSF1A*С ассоциирован с развитием более тяжелой формы РС (по шкале MSSS), генотип TNFRSF1A*С/С — с неблагоприятными ВМ РС, а аллельное сочетание (CTLA4*G + TNFRSF1A*C) — с непродолжительной П.Р. Аллель IL7RA*Т, обнаруженный нами в составе еще одного сочетания с CTLA4*G, также связан с непродолжительной П.Р. Ассоциация TNFRSF1A (rs1800693) с тяжестью РС была ранее описана у афроамериканцев [8]. У аргентинских больных РС была выявлена [21] также ассоциация другого полиморфного участка в генеTNFRSF1Aс локализацией первых очагов поражения, которая коррелирует с наблюдаемыми при дебюте РС симптомами. Выявленная ассоциация полиморфизмов TNFRSF1A и IL7RA с длительностью ПР находится в соответствии c результатами исследования, проведенного на смешанной популяции европеоидов [22]. Показано [10], что носительство аллелей риска генов TNFRSF1A и IL7RA ведет к увеличению количества растворимых изоформ рецепторов, которые, связываясь с соответствующими цитокинами, способны конкурентно ингибировать активацию сигнальных путей рецепторов цитокинов ФНО и ИЛ-7.

Возможность прогнозировать индивидуальное клиническое течение РС в самом начале заболевания является важным фактором для стратегии ведения пациента. Полиморфные варианты генов TNFRSF1A,CTLA4 иIL7RA, ассоциированные с тяжестью течения РС и/или его ранними клиническими характеристиками, могут стать полезными клинико-лабораторными маркерами.

В целом результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что гены, для которых показана ассоциация с предрасположенностью к РС, в частности гены, кодирующие рецепторы цитокинов, вовлечены в формирование определенного фенотипа, характеризующего особенности течения заболевания у конкретных больных РС.

Работа поддержана грантом РФФИ 15−04−04866.

Конфликт интересов отсутствует.