Восстановление функциональной активности гипореактивных тромбоцитов при антиагрегантной терапии у пациентов с хронической ишемией головного мозга

Прогрессирование хронической ишемии головного мозга (ХИМ) остается нерешенной проблемой неврологии. Во многом это связано с отсутствием знаний о механизмах, ограничивающих микроциркуляцию мозга. Известно, что одной из причин нарушения микроциркуляции может быть повышенная агрегация тромбоцитов (АТц) в ответ на стимулирующие сигналы (агонисты) [1]. Казалось бы, возможность АТц на фоне проведения антиагрегантной терапии сведена до минимума, несмотря на перманентное действие этиологических факторов ХИМ, способных стимулировать тромбоциты. К таковым можно отнести коллаген сосудистой стенки в зоне атеросклеротической бляшки, ангиотензин II, адреналин и серотонин, цитокины и фактор активации тромбоцитов (ФАТ). Тем не менее развитие острых нарушений мозгового кровообращения (транзиторные ишемические атаки и ишемические инсульты) у больных с ХИМ подводит к предположению о возможности восстановления функциональной активности тромбоцитов несмотря на проводимую медикаментозную терапию [2]. Вероятно, на фоне антиагрегантной терапии у пациента развивается адаптация тромбоцитов, направленная на восстановление гемостаза, механизмы которой могут закладываться в процессе мегакариоцитопоэза (при этом изменяется фенотип тромбоцитов) или реализовываться/воспроизводиться посредством микрочастиц, содержащих РНК, которые осуществляют перестройку метаболических процессов в тромбоцитах. В основе этих явлений лежит индивидуальная реактивность организма, обусловленная генетически детерминированным синтезом протеинов, в том числе белков-ферментов внутриклеточных сигнальных систем, которые препятствуют/ограничивают фармакологическое действие препаратов. Адаптационные механизмы тромбоцитов проявляются секрецией из гранул биологически активных субстанций (АДФ, адреналин, Са²⁺, серотонин, ФАТ и др.) и направлены на усиление экзогенного сигнала, постоянно активирующего тромбоциты. В этой гипотезе остается много «белых пятен», например не известно, действительно ли сенситивность разных рецепторов на тромбоците может отличаться при селективной блокаде Р2Y12-рецепторов, α2-адренорецепторов, ангиотензиновых рецепторов I типа (АТ1-рецепторов) или блокаде синтеза ТхА2. Можно ли классифицировать кластеры (объединения) функционально активных рецепторов тромбоцитов, и изменяются ли кластеры в процессе длительной фармакологической коррекции? Возможно ли повышение функциональной активности тромбоцитов при одновременной стимуляции нескольких рецепторов кластера?

Цель данного исследования — установить, возможно ли восстановление функциональной активности гипореактивных тромбоцитов после завершения базовой медикаментозной терапии у пациентов с ХИМ.

В исследование были включены 30 пациентов, 18 мужчин и 12 женщин, в возрасте от 40 до 84 лет (средний — 64,3±8,0 года), с верифицированным клинически и нейровизуализационно диагнозом ХИМ (дисциркуляторная энцефалопатия — ДЭ) 1—2-й стадии.

Исследование функционального состояния тромбоцитов у больных проводилось через 24 ч после начала стандартной медикаментозной терапии и повторно через 9—21 день после завершения лечения на момент выписки из стационара. Стандартная терапия включала антигипертензивные и вазоактивные препараты, средства, улучшающие метаболизм головного мозга и обеспечивающие коррекцию когнитивных функций, а также антиагреганты — аспирин 75—100 мг в сутки. Тромбоциты выделяли из периферической крови путем центрифугирования. Для стимуляции тромбоцитов invitroиспользовали АДФ (5 мкМ), адреналин (5 мкМ) и ФАТ (150 мкМ) в эффективной концентрации, вызывающей у здоровых лиц 50±5% АТц (ЕС50). Исследование АТц проводили на агрегометре фирмы «Chrono-Log» (США); содержание тромбоцитов в пробе составляло 200 000±20 000/мкл. Коэффициент прироста АТц (kАТц) рассчитывался как отношение агрегации, индуцированной совместным действием нескольких агонистов, к агрегации, воспроизводимой одним из исследуемых агонистов.

Статистический анализ данных осуществляли с использованием пакета программ MedStat.

Через 24 ч после начала стандартной медикаментозной терапии у 30 обследованных пациентов были выявлены 13 фенотипов тромбоцитов, отражающих индивидуальную реактивность организма с учетом функционального состояния трех основных рецепторов (пуриновые рецепторы Р2Y1 и P2Y12, α2-адренорецепторы и ФАТ-рецепторы), составляющих кластер [АДФ — адреналин — ФАТ]. Наиболее часто (по 23,3%) встречались 2 фенотипа, отличающихся реакцией тромбоцитов на АДФ, но совпадающих по низкой сенситивности α2-адренорецепторов и ФАТ-рецепторов (см. таблицу).

На момент выписки пациентов из стационара (через 9 — 21 дней лечения) у тех же 30 пациентов регистрировались 11 фенотипов тромбоцитов, так как элиминировались 2 фенотипа с кластерами [АДФ (↑) адреналин (=) ФАТ (↓)] и [АДФ (↑) адреналин (=) ФАТ (↑)]. В результате лечения изменился количественный состав фенотипов. Доминирующим фенотипом тромбоцитов являлся фенотип с кластером [АДФ (↓) адреналин (↓) ФАТ (↓)], который регистрировался у 15 (50%) пациентов. Увеличение представленности данного фенотипа произошло в основном за счет элиминации фенотипа с кластером [АДФ (↑) адреналин (↓) ФАТ (↓)], вызванной ингибированием реакции тромбоцитов на АДФ. Выявленная гипореактивность тромбоцитов в отношении всех трех изученных агонистов свидетельствует, что проведенное лечение обеспечивало достижение антиагрегантного эффекта. У оставшихся 15 (50%) больных выявлены 10 фенотипов тромбоцитов, которые не изменились, а значит стандартная медикаментозная терапия не повлияла на функционирование как минимум одного из рецепторов кластера, поэтому сохранялся риск инициации тромбогенеза. Комплексный анализ состояния рецепторов (кластерный анализ) может оказаться оправданным при изучении протромбогенного статуса тромбоцитов, если подтвердится, что активированные рецепторы, представленные в кластере, могут взаимодействовать на уровне внутриклеточных сигнальных систем, обеспечивая стимуляцию тромбоцитов.

В дальнейшее исследование был включен наиболее представленный фенотип с кластером [АДФ (↓) адреналин (↓) ФАТ (↓)]. Установлено, что тромбоциты данного кластера отвечали суммацией эффектов АДФ и адреналина в 6 (40%) случаях, адреналина и ФАТ — в 6 (40%), АДФ и ФАТ — в 3 (20%).

При инкубации тромбоцитов с адреналином (ЕС50) АТц составила 5,3±1,9% (95% доверительный интервал — ДИ=0,4—10,2%), тогда как у здоровых при действии аналогичной концентрации агониста величина АТц находилась на уровне 50±5%. Если в суспензию тромбоцитов, выделенных у пациентов с ХИМ, добавляли последовательно адреналин и АДФ, то АТц повышалась до 33,4±4,1% (95% ДИ=23,3—43,5%; р<0,001). Изолированный эффект АДФ воспроизводил АТц на уровне 25,1±3,8% (95% ДИ=15,8—34,5%). Следовательно, при совместной стимуляции тромбоцитов адреналином и АДФ возможны суммация действия агонистов и повышение агрегационной способности тромбоцитов. При этом проагрегантный потенциал тромбоцитов может существенно повышаться, о чем свидетельствуют коэффициент прироста АТц, индуцированной адреналином и АДФ — kАТц=6,313, а также данные максимума значений вариационного ряда (АТц на уровне 47%) и ДИ (правый 95% ДИ — 43,5%).

Воспроизводимый invitro эффект суммации стимулирующего действия адреналина и АДФ, вероятно, связан с повышением эффективности функционирования внутриклеточных сигнальных систем тромбоцитов. Установлено, что активация Gi-белка, связанного с P2Y12-рецептором и α2-адренорецептором, имеет важное значение для реализации сигнала с Gq-связанного рецептора [3]. При одновременном воздействии на тромбоциты адреналина и АДФ происходит усиление активации Gi-белка сигнальных систем и как следствие, повышается стимуляция Gq-белка, вероятно, возрастает эффективность взаимодействия Gq- и Gi-белков, ассоциированных с сигнальными системами, реализующими агрегацию. Также известно, что Gi-сигнальный путь контролирует ряд биологических процессов тромбоцитов, таких как мобилизация кальция из депо, секреция веществ из α- и плотных гранул, прокоагулянтная активность тромбоцитов, продукция тромбоксана А2, рост тромба и его стабильность, а также различные протеин-фосфорилированные процессы [4, 5]. Gi-сигнальный путь может привести к активации рецепторов фибриногена и АТц посредством взаимодействия с сигнальными путями, ассоциированными с G12/13 или Gz-белками.

Интерес к исследованию взаимодействия ФАТ и адреналина объясняется парадигмой об усилении развития воспалительной реакции при действии адреналина [6]. Применительно к изучению механизмов нарушения микроциркуляции и развития осложнений ХИМ можно предположить, что повышение функционального статуса тромбоцитов связано с наличием хронического воспаления (атеросклероз, лейкоцитарная инфильтрация периваскулярной соединительной ткани и участков мозга). Установлено, что при развитии воспаления секретируемый лейкоцитами ФАТ активирует тромбоциты (паракринный механизм активации), и при этом формируются лейкоцит-тромбоцитарные агрегаты. Может ли адреналин (при активации симпато-адреналовой системы и повышении концентрации катехоламинов в крови) усиливать стимулирующий сигнал ФАТ на тромбоциты?

Проведенные исследования показали, что, во-первых, реакция тромбоцитов на ФАТ была крайне низкой и стабильной у обследованных пациентов с ХИМ. АТц-индуцированная ФАТ (ЕС50) составила 3,5±1,2% (95% ДИ=1—7%). Причем достигнутый эффект не был связан с «выключением» ФАТ-рецепторов, поскольку соответствующие блокаторы не использовались. Наиболее вероятно, имело место ингибирование в участке сигнальной системы, расположенной ниже Gq-белка. Таким образом, на момент выписки возможность индукции тромбоцитов посредством изолированного действия ФАТ отсутствует. Во-вторых, для тромбоцитов характерна гипоадренореактивность (АТц 9,0±8,2%) с выраженной вариабельностью ответа тромбоцитов на адреналин, подтверждением чего являются ДИ (левый 95% ДИ — 5% и правый ДИ — 40%) вариационного ряда исследований АТц. Гипоадренореактивность является следствием блокады α2-адренорецепторов при введении пациентам адреноблокаторов. Можно предположить, что функционирование участка сигнальной системы расположенной ниже Gi-белка, сохраняется, что могло бы быть базисом для суммации эффектов агонистов. В-третьих, при совместном действии ФАТ и адреналина на тромбоциты воспроизводится потенцирование эффекта ФАТ (АТц 23,5±6,7%; р<0,05), при этом АТц в ряде случаев (правый 95% ДИ — 45%) достигает уровня нижней границы нормореактивности. Судя по коэффициенту прироста АТц, индуцированной ФАТ при добавлении адреналина (kАТц=6,714), сила амплификации исходного провоспалительного сигнала, стимулирующего тромбоциты, значительная. Значит, на момент завершения стационарного лечения сохраняется риск тромбогенеза, если у пациента возникнут условия для взаимодействия патогенетических факторов воспаления и стресс-реакции. В-четвертых, эффективность функционирования сигнальных систем, реализующих АТц, при совместном действии ФАТ и адреналина повышается, вероятно, вследствие сопряженности двух основных участков сигнальных систем, связанных соответственно с Gi- и Gq-белками. Данный механизм может лежать в основе повышения адаптационных возможностей тромбоцитов. Если предположить, что низкий ответ тромбоцитов на ФАТ связан с ингибированием в участке сигнальной системы, расположенном ниже Gq-белка, а ответ на адреналин — с блокадой α2-адренорецепторов, то потенцирование эффектов агонистов могло бы осуществляться вследствие дополнительной активации тирозиновых киназ, в частности SFKs. Последние могут стимулировать фосфоинозитол-3-киназу (ФИ-3Kγ), которая реализует активацию тромбоцитов посредством Rap1b, относящегося к семейству малых ГТФаз, или через Akt [7].

Влияние воспаления на тромбоцитарное звено гемостаза является актуальной проблемой патофизиологии, поскольку нарушение кровообращения развивается на фоне атеросклероза [8]. Установлено, что лейкоциты (нейтрофилы, моноциты и лимфоциты) могут стимулировать тромбоциты и индуцировать формирование лейкоцит-тромбоцитарных агрегатов. Полагают, что ведущую роль в этих процессах играет ФАТ, продуцируемый лейкоцитами [9]. Известно, что данный агонист связывается с ФАТ-рецептором и активирует участок внутриклеточной сигнальной системы Gq-белок — фосфолипаза Сβ. Таким образом, ФАТ может инициировать эндогенную секрецию АДФ из гранул, значит, возможно усиление АДФ-индуцированной АТц. Проверка данной гипотезы, к сожалению, ограничена небольшим числом наблюдений, тем не менее ряд фактов заслуживает обсуждения. Во-первых, для данных пациентов характерна ареактивность тромбоцитов на ЕС50 АДФ (АТц 1,0±0,42%), что подтверждается и ДИ (левый 95% ДИ=1% и правый ДИ=2%) вариационного ряда исследований АТц. В отсутствие блокады пуриновых рецепторов такой эффект может воспроизводится при «поломке» сигнальных систем, например при блокаде синтеза ТхА2 вследствие назначения аспирина. Во-вторых, реакция тромбоцитов на ФАТ (ЕС50) низкая, а ее значения (АТц 2,0±1,76%) сопоставимы с таковой в группе пациентов, где отмечено взаимодействие адреналина и ФАТ. Максимальное значение АТц, индуцированной ФАТ, достигало 11% (правый 95% ДИ). Таким образом, сам по себе ФАТ (изолированный эффект) не может усилить агрегацию. Как уже обсуждалось, этот феномен связан с нарушением функционирования участка сигнальной системы, расположенной ниже Gq-белка. В-третьих, при совместном действии АДФ и ФАТ на тромбоциты воспроизводится потенцирование стимулирующего сигнала пуринового нуклеотида (АТц 15,0±7,3%). Выявленный факт, вероятно, связан с эндогенной секрецией АДФ и других биологически активных веществ из гранул, которые и модулируют ответ тромбоцитов на экзогенный сигнал. Медиана значений АТц остается низкой, однако правый 95% ДИ достигает 28%, а коэффициент прироста АТц, индуцированной АДФ, при добавлении ФАТ — kАТц=7,5. Если отвлечься от цифр абсолютной величины АТц invitro, которые могут показаться несущественными для тромбогенеза, а руководствоваться самим фактом потенцирования, то концепция участия ФАТ в инициации тромбогенеза при воспалении наполняется новым содержанием: ФАТ может усиливать АТц вследствие модуляции эндогенной секреции тромбоцитами биологически активных веществ, прежде всего АДФ. Этим можно объяснить целесообразность применения двойной антиагрегантной терапии при ХИМ. Что касается возможных механизмов потенцирования проагрегантного действия АДФ при блокаде синтеза ТхА2, то можно предположить функционирование альтернативных ТхА2-независимых путей АТц. В частности, ФАТ посредством дополнительной стимуляции тирозинкиназы SFK (Lyn), ассоциированной с Gi- и Gq-белками, может активировать участок сигнальной системы ФИ-3К — RAP1 — RIAM [10].

Таким образом, после завершения стандартной медикаментозной терапии у пациентов с ХИМ выявляются различные фенотипы тромбоцитов. Каждый из них характеризуется определенным кластером взаимодействующих рецепторов, способных связывать адреналин, АДФ и ФАТ, что может создавать условия для восстановления функциональной активности гипореактивных тромбоцитов.