Накоплен значительный объем информации о молекулярных и иммунобиохимических основах острого ишемического повреждения различных тканей. Несмотря на различия в строении, функциях, кровоснабжении сердца и головного мозга, при сопоставлении патогенетических механизмов их острой фокальной ишемии обнаруживается сходство многих этапов ишемического повреждения. В ответ на острую ишемию как в пораженном органе, так и системно развиваются воспалительные реакции и иммунный ответ; есть основания предполагать сходство основных составляющих каскада клеточных реакций.
При повреждении миокарда и головного мозга в крови повышается концентрация белков теплового шока-70 (БТШ70), являющихся эндогенными лигандами для Toll-подобных рецепторов-4 (TLR4) — ключевых рецепторов врожденного иммунитета. Активация TLR4 сопровождается экспрессией генов цитокинов и других сигнальных пептидов, среди которых одним из основных является фактор некроза опухоли α (ФНО-α). Его эффекторные рецепторы (ФНО-рецептор 1-го типа, Fas-рецептор и др.) осуществляют сигнальную деятельность и участвуют в регуляции апоптоза. Очаг ишемического повреждения ткани становится источником матриксных металлопротеиназ (ММП), различных белков и молекул, которые инициируют аутоиммунный ответ, сопровождающийся продукцией иммуноглобулинов с аномальной температурной растворимостью, образующих иммунные комплексы с крио-свойствами (крио-ИК) [1—8].
Установлено, что процессы, развивающиеся в ответ на острую ишемию головного мозга или миокарда, являются не последовательностью событий, а сложной сетью взаимопереплетающихся каскадов. В настоящее время получены данные о значимости лишь отдельных звеньев патогенеза — при развитии ишемии как миокарда, так и головного мозга.
Цель исследования — изучение особенностей ишемического повреждения тканей на основе оценки связей маркеров иммунного ответа, воспаления и апоптоза у больных с инфарктом миокарда (ИМ) и атеротромботическим инсультом (АИ).
Материал и методы
В период с 2002 по 2010 г. обследованы 204 больных с острым коронарным синдромом (ОКС) и 191 — с инсультом, из которых в исследование были включены 94 больных с Q-образующим ИМ (1-я группа) и 93 с АИ (2-я группа). Группу сравнения (ГС) составили 62 пациента без эпизодов ишемии в анамнезе, без статистически значимых отличий по половозрастным признакам и фоновым заболеваниям с основными группами.
Все больные поступили в клинику в первые 24 ч от момента заболевания. Бо́льшая часть включенных в исследование больных страдали артериальной гипертензией (табл. 1). У части больных имелся сахарный диабет 2-го типа. Больные с перенесенными ранее инфарктом миокарда или инсультом в анамнезе в исследование не включались. Больные с другими заболеваниями и соматическими осложнениями из исследования исключались. У пациентов основных групп (1-й и 2-й) применялись клинические, лабораторные и инструментальные методы исследования в соответствии с медико-экономическими стандартами оказания медицинской помощи.
Для оценки степени левожелудочковой недостаточности применялась классификация Т. Killip (1967). Эхокардиографическое исследование проводилось на 1—2-е и 7-е сутки от начала заболевания.
У больных 2-й группы для объективизации тяжести состояния и оценки динамики клинических показателей использовали шкалу инсульта NIHSS и оригинальную шкалу Е.И. Гусева и В.И. Скворцовой. Клинические исходы заболевания оценивали по модифицированной шкале Рэнкина (МШР) на 14-е сутки. КТ головного мозга проводили при госпитализации и на 6—7-е сутки после АИ, оценивали локализацию, характер и объем очага поражения головного мозга. С целью верификации патогенетического подтипа АИ всем пациентам выполняли дуплексное сканирование магистральных артерий головы, транскраниальную допплерографию и эхокардиографию (для исключения источника кардиоэмболии).
С помощью проточной цитофлуориметрии с использованием ДНК-специфического флуорохрома пропидийиодида («Sigma Aldrich», США) проводился анализ интенсивности апоптоза и относительного уровня внутриклеточной концентрации БТШ70 по средней интенсивности флуоресценции клеток в образцах, обработанных моноклональными антителами BRM22 («Sigma Aldrich», США) и вторыми ФИТЦ-мечеными антителами («Sigma Aldrich», США). Экспрессию TLR4 на поверхности клеток определяли с использованием специфических моноклональных антител («e-Biosciences», США). Все цитометрические измерения проводили на проточном цитофлуориметре FACScan («Becton Dickinson», США).
Методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем и реагентов BCM Diagnostics (США); R&D (Англия); Biosours (США); Вектор-бест (Россия) и Bender MedSystems (США) определяли содержание матриксной металлопротеиназы-9 (ММП-9), интерлейкина 10 (ИЛ10), ФНО-α, растворимого Fas-лиганда (sFasL) и крио-ИК. Выделение крио-ИК из сыворотки крови проводили по модифицированному методу А. Kalovidoris. Концентрация крио-ИК оценивалась на спектрофотометре Carry-50 (США). Исследования проводились в 1-е и 7-е сутки от начала заболевания.
Статистическая обработка результатов проведена с использованием программного обеспечения SPSS8.0 и Microsoft Excel 2013. Статистически значимыми считались различия при p<0,05. Специфичность связей между маркерами, их выраженность и направленность определялись с использованием факторного анализа, проведенного методом главных компонент корреляционной матрицы с учетом веса компонента более единицы и векторного влияния переменной в факторном комплексе при абсолютном значении более 0,4.
Результаты и обсуждение
В дебюте ИМ и АИ были обнаружены повышенные по сравнению с контрольными значениями уровни циркулирующих маркеров иммунного ответа, воспаления, апоптоза и разрушения внеклеточного матрикса: ММП-9, крио-ИК, sFasL, ФНО-α, ИЛ10, спонтанного апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови, уровня экспрессии ими TLR4 и БТШ70 (табл. 2), что подтверждает наличие сходных механизмов реализации ишемического повреждения миокарда и головного мозга. Все указанные различия с ГС достигали статистической значимости, за исключением уровня экспрессии внутриклеточных БТШ70 у больных с ИМ и АИ на 7-е сутки заболевания, циркулирующего sFasL у больных с ИМ на 1-е сутки заболевания и циркулирующего ФНО-α у больных с АИ на 1-е сутки заболевания.
Статистическая значимость отличий от ГС на 1-е сутки и отсутствие отличий в динамике к 7-м суткам значений концентрации внутриклеточных БТШ70, по-видимому, обусловлены выбросом цитоплазматических БТШ70 в межклеточное пространство и кровоток. Это подтверждается данными о том, что повышенный уровень БТШ70 в периферической крови определялся, в частности, у больных с ИМ [9, 10].
Сходные взаимосвязи при ишемии в разных сосудистых бассейнах были установлены в отношении активности апоптоза МНК и уровня БТШ70 в них (табл. 3). У больных обеих групп выявлена обратная связь между активностью апоптоза клеток и уровнем содержания в них БТШ70, что подтверждает присущие БТШ70 протективные (антиапоптотические) свойства [11].
Влияние уровня экспрессии TLR4 на МНК на большинство изученных звеньев патогенеза оказалось противоположным по значимости в группе больных с ИМ и А.И. Таким образом, активация TLR4 на периферических клетках крови имела различное влияние и на другие рассмотренные составляющие патогенеза ишемии миокарда и головного мозга.
Исходя из данных литературы и собственных результатов, можно рассмотреть несколько возможных причин наблюдавшихся различий. Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) защищает головной мозг от иммунного конфликта, а АИ сопровождается нарушением целостности ГЭБ и развитием иммунного ответа. При И.М. (как и при другой локализации ишемии) также развивается иммунный ответ, однако к ткани миокарда имеется бо́льшая иммунная толерантность организма из-за отсутствия структуры, подобной ГЭБ.
TLR можно охарактеризовать как рецепторы системы врожденного иммунитета или как рецепторы, осуществляющие связь врожденного и приобретенного иммунитета [12—14], поэтому активация TLR4 может быть разнонаправленной при повреждении «забарьерного» и «незабарьерного» органа. Вторая причина наблюдавшихся особенностей активации TLR на периферических МНК может быть связана с регулирующим влиянием активации аденозиновых рецепторов. Известно, что с первых часов развития ИМ в ишемизированной ткани резко повышается концентрация аденозина и адениновых нуклеотидов — продуктов распада и метаболизма АТФ [15]. При А.И. уровень аденозина повышается меньше, чем при повреждении миокарда, так как в патогенезе ишемии головного мозга ведущее значение имеют другие продукты энергетического дефицита. Кроме того, при повреждении миокарда, особенно в первые часы — первые сутки ишемии метаболиты АТФ оказывают гораздо более значимый системный эффект, чем при повреждении головного мозга, что связано со скоростью повреждения ГЭБ.
Аденозин воздействует на аденозиновые рецепторы, в том числе аденозиновые А
Еще одной причиной установленной специфичности активации TLR4 может быть то, что характер и выраженность ответа на их стимуляцию зависит от типа вызывающего эту активацию лиганда. Эндогенными лигандами TLR4 являются БТШ60, БТШ70, фибриноген, экстра домен, А фибронектина, белок, А сурфактанта, гепарана сульфат, растворимый гиалуронат и др. Очевидно, что при повреждении тканей различных типов (например, головной мозг и миокард) по-разному возрастает концентрация эндогенных лигандов TLR4, с чем также может быть связана разнонаправленность ответа на активацию TLR4. Например, сердечный миозин может становиться эндогенным лигандом для активации TLR4 [18].
Результаты многофакторного анализа показали, что взаимовлияние циркулирующего ФНО-α с другими патогенетическими звеньями ишемии в 1-е сутки ИМ и АИ также разнонаправленно. Значение и направление векторного влияния у циркулирующего ФНО-α оказались сопоставимы с выраженностью и направленностью факторной значимости уровня активации TLR4 в конце 1-х суток ИМ и А.И. Полученные данные хорошо согласуются с данными литературы о том, что ФНО-α является одним из основных эффекторных медиаторов активации TLR4.
Несмотря на установленную в эксперименте сопоставимость абсолютных значений циркулирующего ФНО-α в 1-е сутки ИМ и АИ, результаты многофакторного анализа выявили разную степень его влияния на другие звенья патогенетического каскада. Сравнительно бо́льшая факторная значимость ФНО-α, как и активация TLR4, отмечены в 1-е сутки И.М. Эти результаты, очевидно, отражают бо́льшую роль системного воспаления в конце 1-х суток ИМ по сравнению с АИ, что может быть связано с темпами повреждения ГЭБ и отсроченным воспалительным ответом при ишемии головного мозга.
Проведенный многофакторный анализ позволил установить однонаправленную связь значений циркулирующих ММП-9 и ФНО-α в 1-е сутки ИМ и А.И. Причиной такого влияния может быть способность ФНО-α стимулировать активность ММП [19—21]. Так, продемонстрировано выраженное регулирующее влияние ФНО-α на секрецию ММП-9, но не ММП-2 [22]. Кроме того, было показано, что на активность ММП-9 оказывает регулирующее влияние активация TLR4, разнонаправленное влияние экспрессии которых при ИМ и АИ уже обсуждалось.
В результате проведенного многофакторного анализа было установлено, что уровень экспрессии TLR4 на МНК прямо связан с уровнем апоптоза этих клеток у больных с АИ и обратно связан с активностью апоптоза при И.М. Считается, что результатом стимуляции TLR4 могут быть как про-, так и антиапоптотические эффекты. Например, повышение экспрессии TLR2 и TLR4 на нейронах сопровождается увеличением их апоптоза [23]. Показан антиапоптотический эффект активации TLR4 на кардиомиоциты [24]. Апоптоз является сложным, многоуровневым процессом, в регуляции которого принимают участие многие факторы, в том числе и некоторые вещества, содержащиеся в крови. Можно предположить, что активность апоптоза клеток периферической крови у больных с ИМ и АИ отражает активность процессов апоптоза в очаге повреждения.
В 1-е сутки АИ в крови больных была обнаружена более высокая концентрация циркулирующего sFasL. Его факторная значимость также оказалась большей в 1-е сутки А.И. Совокупность полученных данных и результатов экспериментальных исследований подтверждают бо́льшую значимость апоптоз-модулирующих факторов в патогенезе острой фокальной ишемии головного мозга по сравнению с ишемией миокарда [25—28].
Полученная сравнительно более высокая факторная значимость ММП-9 при формировании очага ИМ по сравнению с АИ, вероятно, связана с механической (сократительной) функцией ткани миокарда, которая оказывает дополнительное повреждающее влияние на разрушение и перестройку межклеточного матрикса.
Проведенное нами исследование уровня криоглобулинемии в 1-е сутки ИМ и АИ выявило наличие схожего уровня крио-ИК в периферической крови. Однако, как показали результаты многофакторного анализа, значимость феномена криоглобулинемии оказалась высокой у больных с АИ и равнялась нулю при ИМ. По-видимому, предшествующее инсульту поступление нейроспецифических белков в кровоток за счет повреждения ГЭБ при прогрессировании сосудистого поражения головного мозга приводит к выраженной фоновой сенсибилизации к нейроспецифическим белкам. При развитии АИ и прорыве ГЭБ наблюдается активная реакция специфических аутоантител с тканью головного мозга, что оказывает выраженное влияние на течение заболевания. В отличие от головного мозга, миокард не является «пришельцем» в эволюционно устоявшуюся биологическую систему иммунной защиты организма, и поэтому доинфарктное его повреждение (если оно имеет место) не сопровождается столь выраженной тканеспецифической аутосенсибилизацией.
Установлено также, что к возникновению ОКС чаще приводит разрыв богатой липидами (нестабильной) атеросклеротической бляшки, расположенной в коронарной артерии эксцентрично. В отличие от коронарного бассейна, в каротидном бассейне установлено статистически значимое влияние стеноза более 50% на риск развития АИ [29]. Таким образом, преимущественно концентрический тип атеросклеротических бляшек в артериях головного мозга влияет на местную гемодинамику и провоцирует доинсультное повреждение ГЭБ с выходом в кровоток нейроспецифических белков и развитием фоновой сенсибилизации к ним.
К 7-м суткам ИМ и АИ выраженность и направленность взаимосвязей между изученными патогенетическими звеньями по данным многофакторного анализа претерпевают некоторые изменения (табл. 4).
В динамике отмечалось нарастание факторного влияния ММП-9 при ИМ и резкое ее снижение (до нуля) при А.И. Такие результаты отражают, по-видимому, значимую роль перестройки внеклеточного матрикса в процессе постинфарктного ремоделирования при ИМ и сравнительную незначительность подобных процессов (или их отсутствие) при АИ.
Факторное влияние циркулирующего ФНО-α в динамике существенно возрастает у больных с АИ и нивелируется при И.М. Важную роль ФНО-α в формировании очага ишемического повреждения в головном мозге подтверждают результаты экспериментальных и клинических исследований, согласно которым ФНО-α может оказывать как нейропротективное, так и нейротоксическое влияние [30—33].
Параллельно с нарастанием факторного влияния ФНО-α у больных с АИ к 7-м суткам наблюдается рост факторной значимости TLR4 на МНК и циркулирующего sFasL. Влияние указанных показателей для компоненты ИМ на 7-е сутки исчезало. Эти данные, по-видимому, отражают сравнительно более значимую роль воспалительных и апоптоз-модифицирующих реакций и иммунного ответа в доформировании ишемического очага в головном мозге по сравнению с ИМ.
Так как криоглобулинемия рассматривается как неспецифический маркер стимуляции иммунной системы аутоантигенами, можно отметить выраженную патогенетическую значимость аутоиммунного ответа и в 1-е сутки АИ, и в последующем, тогда как роль ее при ИМ менее значима.
Таким образом, в проведенной работе продемонстрировано наличие сходных механизмов реализации ишемического повреждения тканей по обнаруженному в дебюте ИМ и АИ повышению уровня циркулирующих маркеров иммунного ответа, воспаления, апоптоза и разрушения внеклеточного матрикса (ММП-9, крио-ИК, sFasL, ФНО-α, ИЛ10, спонтанный апоптоз клеток периферической крови, уровень экспрессии ими TLR4 и БТШ70), и установлены особенности ишемического повреждения тканей у больных с ИМ и АИ по темпам активации и специфичности связей между маркерами, их выраженности и направленности с использованием факторного анализа, проведенного методом главных компонент корреляционной матрицы, что является абсолютно новым подходом к оценке роли и значимости определяемых параметров в остром периоде ишемии миокарда и головного мозга.