Влияние ингибиторов нейрональной и индуцибельной NO-синтаз на развитие геморрагического инсульта в эксперименте

В патогенезе целого ряда неврологических заболеваний, в том числе инсультов и эпилепсии, важную роль играют оксид азота и глутаматные рецепторы [1-3]. Cчитается установленным, что глутамат и оксид азота (NO) с его продуктами превращений (например, нитритными ионами - NO2^–) принимают участие не только в физиологических реакциях, сопровож­дающихся активацией растворимой гемсодержащей гуанилатциклазы [4-13], но и в гибели нейронов при поражениях головного мозга - инсульте, ишемии/гипоксии, черепно-мозговых травмах, а также в нейродегенеративных процессах [1, 14-25].

Глутаматная нейротоксичность происходит прежде всего из-за того, что возникает кальциевая перегрузка нейронов, активируются NO-синтазы, которые начинают продуцировать большое количество NO, участвующего в циклических превращениях [26-37], при этом отмечается набухание, отек нейронов и целый ряд других патологических изменений [38-42]. Показано, что морфофункциональные изменения клеток тканей млекопитающих при гипоксии обусловлены образованием в них повышенных концентраций NO и продуктов их превращения [9-11]. NO также участвует в повреждении глутаматных рецепторов и в образовании аутоантител при эпилепсии и гипоксии [22, 24, 25], изменении ультраструктуры нейронной сети мозжечка молекулярного и зернистого слоев [10, 11], а также активирует процессы образования нейроглиальных контактов [39].

Существуют исследования, в которых сопоставляли повреждающее воздействие глутамата и NO-генерирующего соединения на нейроны мозжечка в культуре клеток [22-24, 43], при инкубации ткани мозжечка с этими соединениями in vitro [9-11, 38-42], в опытах на крысах линии Крушинского-Молодкиной (КМ) при геморрагическом инсульте [14-18, 20, 44-48], на крысах линии Wistar при ишемическом инсульте [19]. Они показали, что NO и продукты его превращения могут оказывать не только повреждающее действие, но и запускают развитие компенсаторно-приспособительных реакций [6, 48]. Получены также данные о роли NO и продуктов его метаболизма (например, диоксида азота - NO2) в организме млекопитающих [49-52], которые были использованы при анализе клинических данных у больных с черепно-мозговой травмой [21, 25], а также помогли приблизиться к пониманию механизма действия некоторых лекарственных средств, одними из которых являются новые пептидные препараты [44, 52-56].

Ранее нами было установлено [17, 18, 45], что кратковременная адаптация к гипоксии значительно снижает смертность, тяжесть нарушений движений и развитие внутричерепных кровоизлияний, вызванных аудиогенным стрессом. К настоящему времени накоплен достаточный материал, позволяющий предположить, что значительная роль в формировании механизмов адаптации к умеренной гипоксии принадлежит оксиду азота [57]. Проведенные нами исследования с использованием метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и неселективного ингибитора NO-синтаз (NOS) L-NNA показали, что NO участвует в протекторном эффекте кратковременной адаптации к гипоксии при развитии у крыс линии КМ аудиогенных стрессорных повреждений [17, 18, 45, 46]. Причем положительная составляющая этого эффекта реализуется за счет умеренного увеличения NO в крови, сердце и сосудистом эндотелии [4, 8, 17]. Неселективный ингибитор NO-синтаз - L-NNA во всех изученных дозах усиливал стрессорные повреждения, возникавшие в результате акустического воздействия, и уменьшал защитный эффект кратковременной адаптации к гипоксии [20].

При анализе данных литературы и результатов собственных исследований возникло предположение, что селективные ингибиторы нейрональной и индуцибельной NO-синтаз в отличие от L-NNA могут снижать аудиогенные стрессорные повреждения и вносить положительный вклад в протективное действие кратковременной адаптации к гипобарической гипоксии. Цель настоящей работы - проверка этого предположения. Нами исследовались влияние ингибиторов нейрональной и индуцибельной NO-синтаз на развитие геморрагического инсульта у крыс линии КМ без адаптации к гипоксии и при кратковременной адаптации к гипобарической гипоксии.

Эксперименты без адаптации к гипоксии были выполнены на 90 крысах линии КМ (самцы в возрасте 4-4,5 мес, массой 250-300 г). Было проведено две серии экспериментов. В 1-й серии опытным животным (n=42) за 60 мин до эксперимента вводили ингибитор индуцибельной NO-синтазы (аминогуанидин, «Sigma») или ингибитор нейрональной NO-синтазы (7-нитроиндазол, «Sigma») в дозе 2,5 мг/100 г внутрибрюшинно. Во 2-й серии опытным животным (n=14) за 60 мин до эксперимента одновременно вводили ингибитор нейрональной NO-синтазы в дозе 2,5 мг/100 г и ингибитор индуцибельной NO-синтазы в дозе 2,5 мг/100 г внутрибрюшинно. Контрольным животным в обеих сериях опытов (n=20 и n=14 соответственно) за 60 мин до эксперимента вводили внутрибрюшинно эквивалентное количество физиологического раствора.

Эксперименты с кратковременной адаптацией к гипобарической гипоксии были выполнены на 48 крысах линии КМ (самцы в возрасте 4-4,5 мес). Животным 1-й группы (n=16) за 70 мин до опыта вводили одновременно ингибитор индуцибельной NO-синтазы (аминогуанидин, «Sigma») и ингибитор нейрональной NO-синтазы (7-нитроиндазол, «Sigma») в дозе 2,5 мг/100 г, внутрибрюшинно. Сразу же после введения ингибиторов NOS животных помещали в барокамеру и создавали разрежение воздуха, соответствующее высоте 5000 м над уровнем моря. Время адаптации к гипоксии составляло 1 ч; время подъема на «высоту» и время «спуска» в нормальные условия составляло 5 мин. Сразу же после «спуска» в нормальные условия крысы подвергались акустической экспозиции. Животным 2-й, контрольной, группы (n=16) за 70 мин до эксперимента вводили внутрибрюшинно эквивалентное количество физиологического раствора и подвергали гипоксическому воздействию в барокамере в течение 1 ч. Затем крыс «спускали» в нормальные условия и подвергали акустической экспозиции. 3-ю группу (n=16) составили интактные, не подвергавшиеся гипоксическому воздействию животные, которым за 70 мин до эксперимента вводили внутрибрюшинно эквивалентное количество физиологического раствора.

Акустическое воздействие проводили по ранее разработанной схеме [15-18]. После 1,5-минутного действия сильного электрического звонка (110-115 дБ) подавали серию сильных и слабых (80 дБ) акустических сигналов длительностью 10 с с 10-секундными интервалами между ними. Через 15 мин такого воздействия делали 3-минутный перерыв и снова включали сильный звук в течение 1 мин. Во время акустического воздействия у опытных и контрольных крыс определяли параметры, характеризующие возбудимость центральной нервной системы (ЦНС): величину латентного периода, интенсивность судорожного приступа. Также оценивали смертность животных во время звукового стресса и выраженность нарушений движений. Выделяли нарушения трех степеней: легкие - незначительные нарушения мышечного тонуса, не ограничивающие передвижение животного; средние - парез конечностей, чаще задних, затрудняющий передвижение; тяжелые нарушения - животное практически теряет способность к передвижению.

Сразу после окончания экспериментов животных декапитировали, мозг фиксировали в 10% растворе формалина. Площадь субдуральных и видимых субарахноидальных кровоизлияний определяли с помощью бинокуляр-микрометра. Наличие или отсутствие внутрижелудочковых кровоизлияний определяли на поперечных срезах мозга толщиной 1-2 мм.

Статистическую обработку результатов проводили с применением критериев Вилкоксона и Фишера.

В экспериментах без адаптации к гипоксии аминогуанидин оказывал протекторное действие на развитие стрессорных повреждений у крыс линии КМ (рис. 1).

Значительный протекторный эффект на крыс линии КМ в условиях акустической экспозиции оказывал 7-нитроиндазол в дозе 2,5 мг/100 г (см. рис. 1). В опытной группе наблюдалось уменьшение смертности по сравнению с контролем (0 и 35% соответственно, р<0,001), существенно снижена доля животных с тяжелыми нарушениями движений по сравнению с контролем (14,3 и 100% соответственно, р<0,001) и увеличена доля животных с легкими нарушениями (23,8 и 0% соответственно, р<0,01). Отмечалось значительное увеличение латентного периода судорожного приступа у опытных животных по сравнению с контрольными (6,7±0,5 и 4,0±0,3 с соответственно, р<0,01).

Средняя площадь субдуральных и видимых суб­арахноидальных кровоизлияний (рис. 2, а) у опытных животных была значительно меньше, чем в контроле (17,9±5,4 и 82,5±10,1 мм² соответственно, р<0,01).

При одновременном введении ингибиторов нейрональной и индуцибельной NO-синтаз выявлено значительное протекторное действие на развитие стрессорных повреждений крыс линии КМ (рис. 3).

Средняя площадь субдуральных и видимых суб­арахноидальных кровоизлияний (см. рис. 2, б) у опытных животных была значительно меньше, чем в контроле (9,0±5,8 и 63,0±9,9 мм² соответственно, р<0,01). Частота внутрижелудочковых кровоизлияний также была значительно ниже в опытной группе, чем в контрольной (11,4 и 78,6% соответственно, р<0,01).

В экспериментах с кратковременной адаптацией к гипобарической гипоксии было обнаружено значительное уменьшение развития стрессорных повреждений у крыс линии КМ (рис. 4).

Средняя площадь субдуральных и видимых суб­арахноидальных кровоизлияний у опытных животных 1-й группы (рис. 5) была значительно меньше, чем у животных 2-й группы (8,1±4,4 и 35±10,5 мм² соответственно, р<0,05).

У животных 1-й группы также наблюдалось снижение возбудимости, проявляющееся в увеличении латентного периода судорожного приступа по сравнению с животными 2-й группы (рис. 6).

Числовые данные, полученные во всех сериях опытов, представлены в табл. 1-3.

Полученные данные показывают, что исследованные селективные ингибиторы NO-синтаз оказывают протекторный эффект на развитие стрессорных повреждений у крыс линии КМ как в экспериментах без адаптации к гипоксии, так и при кратковременной адаптации к гипобарической гипоксии. Причем в опытах без адаптации к гипоксии больший защитный эффект достигался при применении ингибитора нейрональной NO-синтазы или при одновременном введении ингибиторов нейрональной и индуцибельной NO-синтаз. Исходя из результатов этих исследований можно предположить, что в условиях акустической экспозиции у крыс данной линии продуцируется избыточное количество NO, синтезируемое нейрональной и индуцибельной формами NO-синтаз, которое приводит к развитию стрессорных повреждений. Использование селективных ингибиторов снижает синтез избыточного NO и уменьшает развитие аудиогенных стрессорных повреждений, вызывающих геморрагический инсульт. Это предположение согласуется с рядом исследований, в которых было установлено, что некоторые патологические состояния мозга (ишемия, гипоксия, инсульты) сопровождаются повышением образования NO, синтезируемого нейрональной и индуцибельной формами NO-синтаз [3, 7]. Протекторное влияние селективных ингибиторов на развитие стрессорных нарушений у крыс линии КМ без адаптации к гипоксии и при кратковременной адаптации к гипобарической гипоксии может реализоваться через снижение уровня возбудимости ЦНС, проявляющееся в значительном увеличении латентного периода судорожного приступа, которое наблюдалось во всех сериях экспериментов.

Ранее на той же модели было показано, что неселективный ингибитор NO-синтаз L-NNA вызывает противоположный эффект: способствует развитию стрессорных повреждений и снижает протекторный эффект адаптации. Поэтому, исходя из результатов настоящих исследований, можно предположить, что ухудшающий эффект L-NNA объясняется блокадой эндотелиальной формы NO-синтазы, оказывающей протекторный эффект. Действительно, увеличение синтеза NO, связанное с усилением активности эндотелиальной формы NO-синтазы, может уменьшать деструктивные повреждения мозга при ряде патологических состояний за счет вазодилатации, увеличения скорости кровотока в мозге и других эффектов [7, 37]. Эффекты эндогенного NO в области сосудистого эндотелия наиболее критичны для защиты мозга при развитии стрессорных нарушений. Об этом свидетельствует тот факт, что отрицательный эффект от ингибирования эндотелиальной NO-синтазы перекрывает положительный эффект ингибирования нейрональной и индуцибельной NO-синтаз при использовании неселективного ингибитора.

Таким образом, проведенное исследование подтверждает представление о разной роли различных изоформ NO-синтаз в развитии инсультов. Различная роль NO-синтаз обнаружена и в механизме протекторного действия адаптации к гипоксии. В работе установлено, что в отличие от неселективного ингибитора L-NNA, ингибиторы нейрональной и индуцибельной NO-синтаз при одновременном введении усиливают протекторное действие кратковременной адаптации к гипоксии на развитие аудио­генных стрессорных нарушений, приводящих к геморрагическому инсульту.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 12-04-00360-а.