Активация сигнального пути интерферонов типа I у больных рассеянным склерозом под воздействием российского аналога -интерферона-1b (по данным транскрипционного профилирования)

Лечение больных рассеянным склерозом (РС) остается одной из наиболее актуальных проблем практической неврологии. Введение в мировую терапевтическую практику 20 лет назад первого иммуномодулирующего препарата - β-интерферона (β-ИФН) - явилось поворотным событием в этой области [1]. β-ИФН был синтезирован как рекомбинантный белок вначале в бактериальных клетках (β-ИФН-1b), а затем в культуре клеток млекопитающих (β-ИФН-1а), содержащих ДНК с введенными методами генной инженерии последовательностями кодирующего гена. Первым препаратом β-ИФН-1b, одобренным Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA, США) для лечения РС в 1993 г., стал бетасерон (бетаферон). Этот препарат вырабатывается рекомбинантным штаммом E. сoli и представляет собой негликозилированный β-ИФН, который отличается по аминокислотной последовательности от природного β-ИФН человека отсутствием N-концевого метионина и заменой остатка серина в 17-м положении на цистеин [2]. К препаратам β-ИФН-1а, применяемым при лечении РС, относятся авонекс и ребиф. Эти препараты вырабатываются в культуре клеток китайского хомячка, идентичны природному β-ИФН человека по последовательности аминокислот и, как и последний, гликозилированы [3]. Все препараты β-ИФН широко используются при длительном патогенетическом лечении больных ремиттирующим и вторично-прогрессирующим (с обострениями) РС; их рекомендовано назначать сразу после установления диагноза и даже при первом клиническом эпизоде у пациентов с признаками РС по данным магнитно-резонансной томографии (МРТ) головного мозга [4]. Назначение этих препаратов больным РС на территории РФ производится на основании соответствующего разрешения на применение новой медицинской технологии^[1].

Многочисленные международные мультицентровые клинические исследования [5-7] показали, что, несмотря на различия в структуре и способах введения β-ИФН-1b и β-ИФН-1a, лечение препаратами обоих типов приводит к уменьшению частоты и тяжести обострений, а также обеспечивает снижение скорости прогрессирования РС и возникновения новых очагов (по данным МРТ). Длительное наблюдение за больными, которые получают эти препараты, подтвердило, что появилась возможность контролировать механизмы развития патологического процесса, снижая активность воспалительных и аутоиммунных реакций, приводящих к демиелинизации и аксональной дегенерации.

Цитокин β-ИФН относится к ИФН типа I, биологическое действие которых определяется активацией сигнального JAK-STAT пути [8] (рис. 1).

На сегодняшний день наиболее эффективным способом выяснения механизмов действия лекарства и ответной реакции организма больных является изучение его влияния на экспрессию всех генов организма путем анализа полного набора мРНК-транскриптов, или транскриптома. Такой подход стал возможным с развитием нового высокотехнологичного метода полногеномного транскрипционного профилирования, который позволяет выявить гены, дифференциально экспрессирующиеся под действием лекарства, проследив за активацией или ингибированием транскрипции всех молекул мРНК в организме. Данные транскриптомных исследований позволяют идентифицировать ключевых участников патологического процесса, изучить молекулы и сигнальные пути, участвующие в формировании ответа на лекарственное средство [12].

До 2010 г. больные РС в России получали оригинальные препараты β-ИФН, однако сейчас на российском фармакологическом рынке появились отечественные аналоги β-ИФН-1b, одним из которых является препарат инфибета (ЗАО «Генериум»). Введение в медицинскую практику препарата инфибета предполагает проверку его действия на уровне анализа транскриптома с тем, чтобы подтвердить активацию препаратом основных сигнальных путей, вовлеченных в механизм действия β-ИФН.

Цель настоящей работы - поиск с помощью полногеномного транскрипционного профилирования дифференциально экспрессирующихся генов в мононуклеарных клетках периферической крови больных РС, ранее не получавших иммуномодулирующих препаратов, после первого введения им препарата инфибета.

В исследование были включены 3 пациентки с диагнозом «достоверный ремиттирующий РС» согласно критериям McDonald [13], у которых за 1 год до начала терапии препаратом инфибета (подкожно в дозе 250 мкг) наблюдалось по 2 обострения. На момент начала терапии средний возраст пациенток составлял 38±12 лет (от 26 до 49 лет), средний возраст дебюта РС - 31±14 лет (от 21 года до 47 лет), длительность заболевания варьировала от 1 года до 17 лет.

Все пациентки на момент начала терапии имели незначительный неврологический дефицит, средний балл по шкале EDSS составлял 2,67±0,29. Больные до проведения анализа никогда не получали иммуномодулирующей терапии.

Все пациентки дали информированное согласие на использование их ДНК для исследования.

Для выделения РНК и проведения транскрипционного профилирования образцы периферической крови больных РС (8 мл) собирали в пробирки с ЭДТА (Vacuette EDTA Tubes, «Greiner Bio-One») непосредственно перед введением препарата инфибета и через 10 ч после введения. Мононуклеарные клетки выделяли с помощью центрифугирования на градиенте фиколл-гипака, ресуспендировали в 1 мл тризола (TRIzol, «Invitrogen») и замораживали при температуре –70 °С. РНК выделяли с помощью набора RNeasy Midi Kit (Qiagen, «Santa Clara», CA, USA) по методике производителя.

Экспериментальное полногеномное определение экспрессии генов в мононуклеарных клетках крови больных РС на микроматрице ILLUMINA HT-12 и первичная обработка полученных данных с помощью программного обеспечения, поставляемого компанией «Illumina» для этой экспериментальной платформы, проведено в ЗАО «Геноаналитика». Микроматрица анализирует 48 000 РНК-транскрип­тов (проб) и покрывает более 25 400 уникальных генов из базы данных National Center for Biotechnology Information Reference Sequence NCBI RefSeq (Build 36.2, Release 22), а также дополнительные транскрипты из базы данных UniGene (Build 199).

Статистический анализ количественных показателей был выполнен с использованием программного обеспечения R/Bioconductor [14] и пакетов lumi [15] и limma [16]. Пробы были отфильтрованы по качеству гибридизации; требовалось, чтобы вероятность ложного обнаружения сигнала (detection p-value) по данной пробе для всех сравниваемых образцов была меньше 0,05. После такой фильтрации из исходных 48 000 осталась панель из 8000 проб, которые были квантильно нормализованы [17] так, чтобы распределения интенсивностей проб во всех образцах совпадали. Для каждой пробы рассчитывали t-статистику для гипотезы, что среднее разницы уровня экспресии до и после введения препарата равно 0, и определяли соответствующую величину p. Затем эта величина корректировалась на множественность сравнений по методу Бенджамини-Хохберга [18]; cтатистически значимо дифференциально экспрессируемыми считались пробы со значениями FDR (False Discovery Rate) меньше 0,01.

При анализе общей экспрессии наборов генов оценивали статистическую достоверность нулевой гипотезы о том, что экспрессионный ответ генов этого набора на введение препарата инфибета не отличается от ответа для всех исследованных генов, или, иными словами, что данный набор генов статистически значимо не связан с механизмами, активируемыми введением препарата. Для этого с помощью непараметрического критерия Вилкоксона [19] сравнивали наборы t-статистик (см. выше) данного набора и множества остальных генов. Чем ниже полученное значение p, тем больше отличается влияние препарата на данный набор генов от влияния на остальные гены.

Полногеномное транскрипционное профилирование. При сравнении уровня экспрессии 8000 нормализованных проб было выявлено 645 транскриптов для 490 генов (для некоторых генов - по нескольку проб), экспрессия которых статистически значимо изменилась после первого введения препарата инфибета (величина р в диапазоне 4·10^–7-7·10^–4, величина FDR - в диапазоне 2·10^–3-1·10^–2). На рис. 2 (см. на цв. вклейке) представлена карта интенсивности сигналов (heatmap) для всех дифференциально экспрессированных транскриптов.

Среди дифференциально экспрессирующихся генов наряду с другими присутствуют гены систем воспаления, врожденного и адаптивного иммунитета, апоптоза, передачи сигнала, транскрипции, трансляции, деградации и др. Среди генов, экспрессия которых значимо увеличилась после введения β-ИФН, мы обнаружили «классические» гены ответа на β-ИФН [5, 20] - MX1 (myxovirus [influenza virus] resistance 1), OAS1 и OAS3 (2',5'-oligoadenylate synthetase 1 and 3), продукты которых участвуют в иммунном ответе на вирусную инфекцию. Выявлено также повышение экспрессии генов ISG20, ISG15, TNFSF10, IFIT1, STAT1, STAT2, EIF2AK2, ранее наблюдавшееся после введения различных препаратов β-ИФН в большинстве работ [21-26].

Анализ наборов генов. Используя панель из 8000 нормализованных проб, мы проанализировали экспрессию до и после введения препарата набора (группы) генов, вовлеченных в сигнальный путь интерферонов типа I, из базы данных сигнальных путей клетки (Database of Cell Signaling) [27]. Как известно, активация сигнального пути ИФН типа I запускает в ядре транскрипцию ИФН-индуцируе­мых генов. Мы провели также анализ присутствия в нашей панели транскриптов 100 ИФН-индуцируе­мых генов из списка, предложенного в работе [28], и выявили набор транскриптов 56 ИФН-индуци­руе­мых генов, которые были представлены 68 пробами. При сравнении уровней общей экспрессии генов каждого из этих двух наборов до и после введения препарата, несмотря на малое число исследованных больных, наблюдалось значимое отклонение от нулевой гипотезы: значения р для генов сигнального пути ИФН типа I и ИФН-индуцируемых генов оказались равны 10^–4 и 2·10^–11 соответственно. Полученные данные могут свидетельствовать о вовлеченности генов этих наборов в реакцию пациента на препарат.

На рис. 3 (см. на цв. вклейке) представлена карта интенсивности сигналов для транскриптов генов сигнального пути ИФН типа I, присутствующих в нашей панели, до и через 10 ч после первого введения препарата инфибета.

На рис. 4 (см. на цв. вклейке) представлена карта интенсивности сигналов для транскриптов 56 генов из числа β-ИФН-индуцируемых [28] до и после первого введения препарата инфибета больным РС.

Известно, что взаимодействие β-ИФН с рецептором вызывает сложный многоступенчатый ответ [31], при котором вначале происходит прямая активация β-ИФН-специфичных генов. Уже через несколько часов начинает развиваться вторичный ответ, при котором происходит активация других сигнальных каскадов (различных для клеток разного типа), а также ингибирование экспрессии части первично активированных генов. Среди генов, у которых значимо снизился уровень экспрессии, мы выявили гены систем репликации, транскрипции и трансляции (в частности, многие гены, кодирующие рибосомные белки). Полученные в этой работе данные находятся в соответствии с каноническим ответом, наблюдаемым при действии β-ИФН как на уровне передачи сигнала и активации эффекторных молекул, так и при вторичном ответе, проявляющемся в дифференциальном повышении или снижении экспрессии генов [21]. В частности, падение уровня экспрессии наблюдалось нами для генов, участвующих в сигнальных путях интерлейкинов 17 и 12, с чем может быть связан благоприятный эффект препарата.

Инфибета в 2011 г. была зарегистрирована в качестве препарата, изменяющего течение РС (ПИТРС), и разрешена для применения на территории РФ. Этому предшествовало проведение сравнительного клинического исследования, показавшего, что инфибета не имеет существенных отличий ни по одному из параметров эффективности от оригинального средства [32]. Известно, что выводы дорегистрационных рандомизированных клинических исследований не всегда совпадают с результатами повседневной неврологической практики из-за различий в критериях отбора пациентов и условиях наблюдения. Исходя из этого, на базе Московского городского центра РС был проведен ретроспективный анализ результатов применения препарата инфибета у 126 больных РС, получающих терапию не менее 12 мес. Полученные данные также, как и данные дорегистрационного клинического исследования, свидетельствуют о высокой эффективности этого препарата, что подтверждается достоверным снижением частоты обострений и отсутствием прогрессирования неврологического дефицита по шкале EDSS [33]. Анализ результатов транскрипционного профилирования при действии препарата инфибета согласуется с этими клиническими наблюдениями.

Работа поддержана грантами РФФИ №11-04-01644-а, №13-04-40281-Н и №13-04-40279-Н.