Морфофункциональное состояние клеток внутреннего уха при экспериментальной тугоухости

Авторы:
  • Н. Н. Петрова
    Кафедра оториноларингологии Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия, 195067
  • В. Н. Короткова
    Кафедра оториноларингологии Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия, 195067
  • Е. В. Ильинская
    Лаборатория внутриклеточного сигналинга и транспорта НИИ гриппа Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия, 197376
  • Ю. А. Маслова
    Кафедра оториноларингологии Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия, 195067
Журнал: Вестник оториноларингологии. 2019;84(2): 4-7
Просмотрено: 1140 Скачано: 84

В настоящее время существует множество теорий развития сенсоневральной тугоухости (СНТ), однако в их основе, вне зависимости от воздействующего фактора, лежат гемодинамические нарушения во внутреннем ухе. Многие авторы отдают ведущую роль в развитии тугоухости изменениям в сосудистой полоске [1—3]. В последнее время в литературе появляются данные о роли апоптоза (запрограммированной гибели) волосковых клеток кортиева органа [4]. Однако ультраструктурные изменения в сосудистой полоске (СП) внутреннего уха при экспериментальной тугоухости мало исследованы. В связи с этим актуальным представляется изучение роли апоптоза эпителиоцитов СП в этиопатогенезе СНТ.

Цель исследования — изучение ультраструктурных изменений в клетках СП внутреннего уха у животных при экспериментальной СНТ и определение возможных путей коррекции.

Материал и методы

Изучение морфологических изменений в клетках СП кортиева органа проводили в условиях экспериментальной СНТ ототоксического генеза на самцах морских свинок в возрасте 3—6 мес с массой тела 350—400 г. Животных содержали в стандартных условиях с имитацией светлого и темного времени суток. В ходе исследования были соблюдены международные принципы Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.). Животные были распределены на 3 группы: контрольную (1-я), экспериментальную (2-я) и интактную (3-я). Животным 1-й группы внутримышечно вводили гентамицина сульфат в дозе 120 мг/кг массы тела в сутки в течение 14 дней с целью моделирования тугоухости [5, 6]. Во 2-й группе животные получали гентамицина сульфат по вышеуказанной схеме и препарат мелатонин вечером и ночью с питьевой водой в концентрации 10 мг/л [7]. Выбор мелатонина в качестве отопротектора был продиктован данными литературы о его противоапоптической активности [8], а также о способности клеток СП секретировать этот гормон, играющий роль в поддержании нормального гомеостаза жидкостей улитки [9]. Животные интактной группы не подвергалась какому-либо воздействию.

Слуховую функцию животных оценивали с помощью рефлекса Рreyer (подергивание ушей при звуковом воздействии) [10]. После завершения эксперимента производили забор улитки внутреннего уха и выделяли СП по методике Я.А. Винникова и Л.К. Титовой [11]. Полученный материал анализировали при помощи просвечивающего электронного микроскопа JEM-100S (Япония).

Результаты и обсуждение

До начала эксперимента у животных всех групп наблюдался нормальный (живой) рефлекс Рreyer. В 1-й группе через 1 нед после начала курса инъекций ототоксического антибиотика гентамицина сульфата у всех морских свинок отмечалось угасание рефлекса Рreyer, к концу 2-й недели рефлекс был полностью утрачен, что указывало на развитие ототоксической СНТ. Во 2-й группе в конце первой недели эксперимента у всех животных отмечался живой рефлекс Рreyer, по окончании воздействия у 7 животных отмечалось угасание рефлекса, однако он сохранялся, у одного животного рефлекс Рreyer был отрицательным.

На следующем этапе СП морских свинок были подвергнуты электронно-микроскопическому исследованию. На электронограммах животных 3-й (интактной) группы наблюдалась характерная структура всех типов эпителиоцитов: хорошо выраженный гликокаликс на поверхности маргинальных клеток, плотное прилегание клеток друг к другу, отсутствие расширения межклеточных промежутков (рис. 1).

Рис. 1. Сосудистая полоска внутреннего уха морской свинки 3-й (интактной) группы. В цитоплазме видны митохондрии (М), канальцы эндоплазматической сети (ЭПС), ядра (Я), секреторные гранулы (СГ) различной стадии созревания. Межклеточные контакты (МК) сохранены, гликокаликс (ГЛ) равномерно распределен по поверхности клеток. Ув. 16 000.

Цитоплазма носила мелкозернистый характер, отмечалось равномерное распределение органоидов по цитоплазме. Многочисленные митохондрии имели темный матрикс и хорошо структурированные кристы. Канальцы гранулярной эндоплазматической сети не имели очаговых расширений, были расположены параллельно друг другу, в их просветах определялось мелкодисперсное содержимое. Клеточные ядра имели круглую или овальную форму, четкие контуры, эу- и гетерохроматин в них распределялись равномерно. В маргинальных клетках определялось умеренное количество секреторных вакуолей, что согласуется с данными литературы о возможности клеток лабиринта синтезировать высокоактивные вещества, в том числе и мелатонин [9].

При изучении СП животных 1-й группы, получавших только гентамицин, были выявлены значительные нарушения ультраструктуры клеток (рис. 2).

Рис. 2. Сосудистая полоска внутреннего уха морской свинки, получавшей гентамицин (1-я группа). В гомогенизированной цитоплазме видны крупные вакуоли (В), содержащие клеточный детрит. Деструкция крист митохондрий (М) и канальцев эндоплазматической сети (ЭПС). Ядро (Я) с нечеткими контурами содержит крупноглыбчатый хроматин (Хр). Истончение и отслоение гликокаликса (ГЛ). Ув. 24 000.
В многочисленных капиллярах отмечались признаки нарушения кровотока с проявлением сладж-синдрома (склеивание эритроцитов с последующим формированием тромбоза). Пространство между эндотелиальными клетками было расширено, в нем встречался клеточный детрит, что говорит о значительных структурных нарушениях. Отмечалась деструкция базальной мембраны капилляров, вследствие чего нарушалось эндотелиальное пространство между просветом капилляров и клетками эпителия. Цитоплазма некоторых эндотелиоцитов была гомогенизирована, в ней содержались вакуоли. Ядра имели нечеткие контуры, крупноглыбчатый хроматин образовывал плотные конденсаты, расположенные маргинально, а также обращало на себя внимание краевое расположение уплотненных ядрышек. В эпителиоцитах СП ядра имели глубокие инвагинации и расширения перинуклеарного пространства, при этом утрачивалась его связь с ЭПС. Описанные субмикроскопические изменения в СП могут быть расценены как дегенеративные процессы, протекающие по типу апоптоза.

У маргинальных и интермедиальных клеток СП отмечались уменьшение размеров и их деформация, частичная деструкция межклеточных контактов и расширение межклеточных промежутков. Органоиды в цитоплазме распределялись неравномерно: компактно расположенные канальцы эндоплазматической сети (ЭПС) чередовались с участками их полного отсутствия в цитоплазме. В цитоплазме маргинальных клеток отмечались снижение количества цистерн ЭПС и свободных рибосом, а также практически полное отсутствие секреторных вакуолей. Генерализованный характер носило нарушение структуры митохондрий, характеризующееся дезинтеграцией и деструкцией крист, набуханием и просветлением митохондриального матрикса, разрывами наружной мембраны митохондрий.

Исследование структуры гликокаликса обнаружило его истончение и нарушение структуры, а также его отслоение на отдельных участках маргинальных клеток. Кроме того, определялись грыжеподобные впячивания плазмалеммы в межклеточные пространства. Подобное явление получило название блеббинг и, по мнению многих авторов [12—14], является ранним морфологическим признаком апоптоза. Кроме того, среди сохраненных эпителиоцитов СП были обнаружены фрагменты цитоплазмы разрушенных клеток, пикнотически измененные ядра без признаков лейкоцитарной инфильтрации. Мозаичный характер данных нарушений, отсутствие воспалительной реакции также является, по данным литературы, маркером апоптоза [14].

Исследование СП животных, получавших наряду с гентамицином мелатонин (2-я группа), выявило, что дегенеративные изменения как на клеточном, так и на субклеточном уровнях были менее выраженными по сравнению с 1-й группой (рис. 3).

Рис. 3. Сосудистая полоска внутреннего уха морской свинки, получавшей гентамицин и мелатонин (2-я группа). Вспененный вид цитоплазмы за счет большого числа секреторных гранул (СГ). Ядра (Я) с диффузно расположенным эухроматином и периферически расположенным гетерохроматином. Гликокаликс (ГЛ) покрывает всю апикальную поверхность клетки. Ув. 16 000.

На электронограммах была отмечена целостность цитоскелета большинства клеток, лучшая сохранность десмосом. Расширение межклеточных промежутков носило фрагментарный характер. Повреждения гликокаликса были не столь тотальны, как у животных, не получавших мелатонин. Профили ЭПС не имели выраженных дефектов и содержали большее по сравнению с контролем количество рибосом. В ядрах имелся диффузно расположенный эухроматин и периферически расположенный гетерохроматин. В митохондриях, по сравнению с контрольной группой, отмечалась лучшая сохранность крист и наружных мембран.

Наиболее выраженные отличия эпителиоцитов СП животных сравниваемых групп наблюдались в структуре цитоплазмы апикальных частей маргинальных клеток. Эти изменения проявлялись в значительном увеличении количества секреторных гранул различной электронной плотности на разной стадии созревания. Множество вакуолей придавало цитоплазме эпителиоцитов «вспененный» вид и свидетельствовало об усилении секреторной активности клеток. Описанное явление согласовывается с гипотезой, выдвинутой И.Б. Солдатовым и В.М. Николаевым [9], о значении секретирующих клеток диффузной эндокринной системы в поддержании гомеостаза спирального органа.

При экспериментальной тугоухости, вызванной введением ототоксичного антибиотика, выявлены грубые нарушения структур клеток эпителия СП и эндотелия, что, вероятно, является морфологическим субстратом развивающейся тугоухости. Изменения носят мозаичный характер и затрагивают отдельные клетки, что свидетельствует в пользу гибели клеток СП именно путем апоптоза.

Применение препарата мелатонин в качестве антисурдитанта у животных с экспериментальной тугоухостью уменьшает морфологические проявления деструктивных процессов в клетках С.П. Выявленное повышение секреторной активности эпителиоцитов, по нашему мнению, следует расценивать как компенсаторно-приспособительную реакцию и инструмент поддержания гомеостаза преддверно-улиткового органа гуморальным путем. Данные механизмы обеспечивают сохранение слуховой функции при введении мелатонина, что открывает перспективы для его использования при коррекции нарушений слуха.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Петрова Наталья Николаевна — д.м.н., профессор кафедры оториноларингологии ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России, 195067, Россия, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., 47; https://orcid.org/0000-0002-6584-6942; e-mail: natalya.petrova@szgmu.ru

Короткова Вера Николаевна — ассистент кафедры оториноларингологии ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России, 195067, Россия, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., 47; https://orcid.org/0000-0002-8551-1365; e-mail: verashka2@rambler.ru

Ильинская Евгения Васильевна — старший научный сотрудник лаборатории внутриклеточного сигналинга и транспорта (зав. — к.б.н. А.Н. Горшков) ФГБУ НИИ гриппа Министерства здравоохранения Российской Федерации, 197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, д. 15/17; https://orcid.org/0000-0003-0700-3995; e-mail: e.ilyinskaja2016@yandex.ru

Маслова Юлия Анатольевна — ассистент кафедры оториноларингологии ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России, 195067, Россия, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., 47; https://orcid.org/0000-0002-3667-538Х; e-mail: yuliya.maslova@szgmu.ru

Список литературы:

  1. Говорун М.И., Гофман В.Р., Парфенов В.Е. Кохлеопатии. СПб.: ВМА; 2003.
  2. Бабияк В.И., Гофман В.Р., Накатис Я.А. Нейрооториноларингология. СПб.: Гиппократ; 2002.
  3. Watanabe F, Koga K, Hakuba N, Gyo K. Hypothermia prevents hearing loss and progressive hair cell loss after transient cochlear ischemia in gerbils. Neuroscience. 2001;102(3):639-645. https://doi.org/10.1016/s0306-4522(00)00510-8
  4. Золотова Т.В., Панченко С.Н. Экспериментальная сенсоневральная тугоухость ототоксического генеза у животных: апоптический путь гибели клеток спирального органа. Вестник оториноларингологии. 2010;4:29-32.
  5. Song BB, Anderson DJ, Schacht J. Protection from gentamicin ototoxicity by iron chelators in guinea pig in vivo. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1997;282:369-377.
  6. Draz EI, Abdin AA, Sarhan NI, Gabr TA. Neurotrophic and antioxidant effects of silymarin comparable to 4-methylcatechol in protection against gentamicin-induced ototoxicity in guinea pigs. Pharmacological Reports. 2015;67(2):317-325. https://doi.org/10.1016/j.pharep.2014.10.007
  7. Виноградова И.А. Влияние светового режима, мелатонина и эпиталона на биомаркеры старения, возрастную патологию и продолжительность жизни: Дис... д-ра мед. наук. СПб. 2009.
  8. Анисимов В.Н. Мелатонин. Роль в организме, применение в клинике. СПб.: Система; 2007.
  9. Солдатов И.Б., Николаев В.М. Эндокринные клетки ушного лабиринта человека. Журнал ушных, носовых и горловых болезней. 1988;2:1-6.
  10. Журавский С.Г., Бородулин В.Г., Томсон В.В. Патоморфологические особенности повреждения волосковых клеток спирального органа при экспериментальной сенсонев-ральной тугоухости. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006;3:356-360.
  11. Винников Я.А., Титова Л.К. Кортиев орган. Гистофизиология и гистохимия. М.—Л.: Наука; 1961.
  12. Häcker G. The morphology of apoptosis. Cell and Tissue Research. 2000;301(1):5-17. https://doi.org/10.1007/s004410000193
  13. Bortner CD, Cidlowski JA. Apoptotic volume decrease and the incredible shrinkingcell. Cell Death and Differentiation. 2002;9(12):1307-1310. https://doi.org/10.1038/sj.cdd.4401126
  14. Elmore S. Apoptosis: а review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 2007;35(4):495-516. https://doi.org/10.1080/01926230701320337