Введение

Старение организма, сопровождающееся нарушением функций и деградацией тканей и органов, является дополнительным негативным фактором, утяжеляющим течение многих острых и хронических заболеваний и увеличивающим вероятность неблагоприятного прогноза.

Изучение клеточных механизмов старения, или сенесценции, выявило ряд характерных признаков этого процесса, таких как необратимая остановка клеточного цикла, изменение секреторного профиля (формирование SASP — секреторного фенотипа, ассоциированного с сенесценцией), повреждения клеток на макромолекулярном уровне и нарушение регуляции клеточного метаболизма. Сенесцентные клетки обладают характерными морфологическими особенностями, включая увеличенный размер, уплощенную форму, а также накопление специфических маркеров: ассоциированной с сенесценцией β-галактозидазы (SA-β-Gal) и усиленной экспрессии ингибиторов клеточного цикла (p53, p16, p21 и других) [1].

Одна из ведущих теорий старения объясняет этот процесс ухудшением свойств и функции стволовых клеток и их ниши [2]. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются предшественниками различных клеточных типов, и в то же время организаторами ниши для стволовых клеток. В процессе старения эти клетки начинают секретировать провоспалительные молекулы, которые ускоряют старение соседних здоровых клеток, способствуют развитию воспалительных реакций и ремоделированию внеклеточного матрикса, что приводит к утрате нормальной архитектоники тканей. Таким образом, стареющие МСК могут способствовать прогрессированию фибротических процессов, ассоциированных со старением.

Одним из важных факторов, регулирующих функцию сердечно-сосудистой системы и ряд метаболических процессов, является ренин-ангиотензин-альдостероновая система (РААС) — сигнальный путь, отвечающий за регуляцию артериального давления и солевого гомеостаза. В то же время показано, что продукт РААС, ангиотензин II (ANG) может оказывать воздействие на процессы старения. В частности, ангиотензин вызывает старение сосудистого эндотелия и гладкомышечных клеток [3, 4] и является фактором возникновения и прогрессирования ряда социально-значимых сердечно-сосудистых заболеваний. Концентрация ангиотензина повышена в крови у пациентов, страдающих артериальной гипертонией и хронической сердечной недостаточностью [5, 6], а препараты, снижающие активность системы РААС (блокаторы АПФ и рецепторов ANG), увеличивают продолжительность жизни пациентов с этими заболеваниями [7].

Несмотря на то что сенесцирующее влияние ангиотензина II изучено на некоторых типах клеток [8—11], характер его воздействия на сенесценцию МСК неизвестен, однако этот вопрос представляет существенный клинический и научный интерес. В этой связи интересен гормон мелатонин, являющийся антагонистом ангиотензина [12] и оказывающий существенное влияние на функцию мезенхимальных стволовых клеток [13].

В настоящей работе проведено изучение характера пролонгированного воздействия ангиотензина на пролиферацию МСК, экспрессию маркеров сенесценции, и формирование сенесцентного секреторного фенотипа мезенхимальных стволовых клеток. Изучено влияние на эти процессы препаратов-блокатора ангиотензиновых рецепторов (телмисартан) и антиоксиданта мелатонина, нивелирующего окислительный стресс. Кроме того, оценены изменения в белковой экспрессии ангиотензиновых рецепторов 1-го и 2-го типов (AGTR1 и AGTR2), а также белка AGTRAP (Angiotensin II Type 1 Receptor-Associated Protein), действующего как ингибирующий партнер AGTR1.

Материал и методы

Мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани были получены из коллекции человеческих биоматериалов Института Регенеративной медицины (Lomonosov Moscow State University, collection ID:MSU_MSC_AD; repository catalogue at www.human.depo.msu.ru). Клетки культивировали в полной среде DMEM-GlutaMAX (Life Technologies) с добавлением 10% FBS (Life Technologies) и пенициллина/стрептомицина (Life Technologies).

Сенесценцию МСК индуцировали, культивируя клетки в 6-луночном формате в присутствии ангиотензина II в течение 15 дней, в среде DMEM F12 со сменой среды каждые 3 дня. В ходе работы была подобрана оптимальная концентрация ангиотензина для развития эффекта (рис. 1). Влияние на клетки потенциальных сеномодуляторов — мелатонина (100 мкМ) и телмисартана (40 мкМ) — оценивали, внося в среду препараты вместе с ангиотензином или отдельно от него.

Анализ пролиферативной способности МСК

Анализ пролиферации МСК проводили, используя набор реактивов Cell Counting K8 (ССК8, Dojindo, кат. №CK04-11, Япония), по протоколу производителя.

Определение активности SA-β-Gal

Для покраски на бета-галактозидазу, ассоциированную с сенесценцией, (SA-β-Gal) МСК дважды отмывали ФСБ с Ca²⁺ и Mg²⁺ (НПП «ПанЭко», Россия) в течение минуты; фиксировали в 2% растворе формальдегида (PanReac AppliChem, Испания) и 0,2% растворе глутарового альдегида (SERVA, Германия) на ФСБ с Ca²⁺ и Mg²⁺ в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем дважды отмывали ФСБ с Ca²⁺ и Mg²⁺ в течение минуты; добавляли раствор для покраски и ставили инкубироваться клетки при 37 °C без CO₂; дважды отмывали ФСБ с Ca²⁺ и Mg²⁺ и однократно метанолом в течение минуты; клетки высушивали и хранили их в темноте при комнатной температуре. Раствор для покраски SA-β-Gal содержал 40 мМ pH буфера (pH 6,0, эквимолярная смесь цитрата и NaH₂PO₄), 5 мМ гексацианоферрата (II) калия тригидрата (Merck, США), 5 мМ гексацианоферрата (III) калия (Merck, США), 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂ (Macklin, КНР) и 1 мг/мл X-gal (5-Бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид) (BLDpharm, КНР). Окрашенные клетки фотографировали в проходящем свете с помощью микроскопа Axio Observer A1 (Zeiss, Германия), оборудованного цветной камерой AxioCam (Zeiss, Германия).

Определение белковой экспрессии методом вестерн-блоттинга

Мезенхимальные стволовые клетки в 6-луночных планшетах лизировали на льду в 100 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl (pH 6,8), 1% SDS (додецилсульфат натрия), 10% глицерин. Белки разделяли с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия, затем проводили полусухой электроперенос белков на PVDF-мембрану. Мембрану промывали раствором фосфатно-солевого буфера (ФСБ) и помещали в блокирующий раствор (5% обезжиренное сухое молоко, в ФСБ с Tween 20 0,01%). Проводили инкубацию с первичными антителами (стоковые растворы разводили в блокирующем растворе) против p21 (ABclonal, КНР) и p53 (Cloud-Clone, КНР), AGTR1, AGTR2 (Protein tech, КНР), AGTRAP, PSMB8 (Antibodies online, КНР). После 10-минутных отмывок не связавшихся антител раствором ФСБ/0,01% Tween 20 мембрану оставляли в растворе вторичных антител (1:3000), конъюгированных с пероксидазой хрена. Мембрану снова отмывали и инкубировали с люминесцентной системой Pierce™ ECL Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific, США). Сигнал детектировали при помощи гель-документирующей станции Fusion-SL (Vilber Lourmat, Франция). Количественное определение интенсивности сигнала проводили с помощью программы ImageJ.

ПЦР в реальном времени

Клетки лизировали с помощью лизис-буфера из набора Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen, США). Выделение РНК проводили с использованием этого же набора согласно методике производителя. Для удаления из образца примесей ДНК использовали ДНКазу I (RNase Free DNase Set, Qiagen, США). Синтез кДНК проводили с использованием набора High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, США), согласно руководству производителя, используя рандомные гексамерные праймеры и РНК-зависимую ДНК полимеразу M-MuLV Reverse Transcriptase (Applied iosystems, США) в амплификаторе (Bio-Rad, США). ПЦР в реальном времени проводили с помощью амплификатора StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США). Реакционная смесь содержала SYBR Green PCR Master Mix (Syntol, Россия), праймеры (10 пмоль каждого dNTP) и кДНК (1-5 нг кДНК). После начального этапа денатурации (95°C, 10 мин) было выполнено 40 циклов амплификации при 95°C на 15 с и 60°C на 60 с, за которыми следовал анализ кривой плавления. Изменение экспрессии оценивали по методу (delta-Ct) относительно экспрессии гена «домашнего хозяйства» бета-актина.

Статистический анализ

Результаты представлены как средние значения не менее 3 независимых испытаний ± стандартная ошибка среднего. Для расчета достоверности различий использовали двухвыборочный t-критерий с различной дисперсией выборок, принимая достоверными различия с вероятностью p<0,05.

Результаты

По данным ряда исследований, ангиотензин является индуктором сенесценции ряда типов клеток [14]; в то же время сведения о возможности сенесцирующего влияния ангиотензина на МСК в настоящее время отсутствуют. Мы использовали МСК в качестве клеточной модели для оценки возможности индукции ангиотензином сенесцентного состояния, а также изучили влияние на эти клетки мелатонина, оказывающего антиоксидантное действие [15], и телмисартана, антагониста ангиотензиновых рецепторов 1-го типа [16].

Как видно на рис. 1, а, в условиях длительного (15 дней) культивирования МСК в присутствии ангиотензина, увеличение концентрации гормона до 8 мкМ и выше приводит к достоверному снижению числа клеток в культуре, что свидетельствует о замедлении пролиферации. Этот эффект сохраняется в присутствии мелатонина и телмисартана (см. рис. 1, б). При этом сами по себе мелатонин и телмисартан не оказывают достоверного влияния на пролиферацию МСК (см. рис. 1, б), имеется лишь некоторая тенденция к ее увеличению.

Рис. 1. Влияние 15-дневного культивирования МСК в присутствии ангиотензина II на пролиферацию клеток.

а — Зависимость количества клеток от концентрации ангиотензина II (ANG); б — воздействие 8 мкМ ANG, ANG и 100 мкМ мелатонина (М), ANG и 40 мкМ телмисартана (Т), а также М и Т на пролиферацию МСК; в — белковая экспрессия ангиотензиновых рецепторов 1-го (AGTR1) и 2-го (AGTR2) типа, белка, ассоциированного с ангиотензиновым рецепторов 1-го типа (AGTRAP), и протеасомной субъединицы PSMB8. г — идентификация анализируемых белков методом вестерн-блоттинга. Здесь и далее — *p<0,05 — различия между экспериментальными и контрольными значениями оценивали с помощью непарного критерия Стьюдента.

Ангиотензин опосредует свое влияние на клетки, взаимодействуя с клеточными рецепторами 1-го (AGTR1) и 2-го (AGTR2) типа [17]. Помимо ангиотензина активность AGTR1 регулируется белком AGTRAP (angiotensin II receptor-associated protein, или белок, ассоциированный с ангиотензиновыми рецепторами 1-го типа) [18].

Данные, представленные на рис. 1, в, г свидетельствуют об отсутствии изменений рецепторов ангиотензина 1-го и 2-го типов при культивировании МСК в присутствии гормона. Мелатонин, обладающий антиоксидантными свойствами [15], и антагонист AGTR1 телмисартан также не оказывают существенного влияния на экспрессию рецепторов ангиотензина.

Клеточный уровень белка AGTRAP существенно повышается телмисартаном в присутствии ангиотензина, а также мелатонином независимо от наличия ангиотензина в среде культивирования (см. рис. 1, в, г).

AGTRAP, являясь негативным регулятором ангиотензиновых рецепторов 1-го типа, в свою очередь, служит мишенью расщепления протеасомным комплексом: показано, что субъединица PSMB8/β5i иммунопротеасомы является фактором, участвующим в деградации белка AGTRAP [19]. Проведенный нами анализ белковой экспрессии PSMB8 показал, что уровень этого белка не меняется в присутствии ангиотензина и не зависит от наличия в среде телмисартана или мелатонина; в то же время комбинация ангиотензина с телмисартаном парадоксальным образом усиливает его экспрессию (см. рис. 1, в, г). Повышение уровня AGTRAP может быть связано с подавлением его протеасомной деградации [20].

Таким образом, продолжительное культивирование МСК в присутствии ангиотензина не приводит к существенному изменению состояния рецепторного аппарата, несмотря на некоторую вариабельность уровней экспрессии его регулирующих систем.

Длительное воздействие ангиотензина способно вызывать развитие преждевременной сенесценции на системном и клеточном уровне [21].

Анализ экспрессии маркеров сенесценции продемонстрировал в МСК, культивируемых в присутствии ангиотензина, бета-галактозидазы, ассоциированной с сенесцентностью (SA-β-Gal, рис. 2, а), а также достоверное повышение уровня ингибитора клеточного цикла, белка р21, методом вестерн-блоттинга (см. рис. 2, б, г) и ПЦР (см. рис. 2, в). Экспрессия другого модулятора клеточного цикла, белка p53, имела тенденцию к увеличению (см. рис. 2, б, в).

Рис. 2. Влияние потенциальных модуляторов сенесценции на экспрессию сенесцентных маркеров в МСК.

а — экспрессия SA-β-Gal, измеренная в культуре МСК после 15-дневной экспозиции клеток в контроле (CNTRL), в присутствии ангиотензина (ANG), а также комбинаций ANG+M и ANG+T; б, г — оценка экспрессии негативных модуляторов клеточного цикла белков p53 и p21 методом вестерн-блоттинга; в — ПЦР-анализ экспрессии р53 и p21. Условия культивирования МСК — см. подпись к рис. 1. *p<0,05 по отношению к контролю оценена с помощью непарного критерия Стьюдента.

Присутствие в среде культивирования мелатонина и телмисартана не препятствует усилению экспрессии SA- β-Gal и ингибиторов клеточного цикла. Мелатонин, будучи добавлен в отсутствие гормона, усиливает генную экспрессию p53. Аналогичное воздействие на экспрессию гена p53 оказывает телмисартан (см. рис 2, в).

Старение клеток сопровождается формированием секреторного фенотипа, ассоциированного с сенесцентностью (senescence-associated phenotype, SASP). Спектр высвобождаемых клетками ростовых факторов, цитокинов и хемокинов может иметь свои особенности в зависимости от природы индуктора, вызывающего сенесценцию [22].

На рис. 3 представлены результаты проведенного нами мультиплексного анализа факторов, секретируемых МСК в условиях культивирования в присутствии ангиотензина, мелатонина и телмисартана.

Рис. 3. Характеристика влияния ангиотензина, мелатонина и телмисартана на секретомный профиль МСК.

а — гистограммы, характеризующие влияние указанных агентов на секрецию цитокинов и хемокинов (данные мультиплексного анализа выражены в десятичных логарифмах концентраций секретируемых факторов); б — транскриптомный профиль экспрессии генов матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов TIMP2 и TIMP3 (данные ПЦР-анализа). * — p<0,05 относительно контрольных величин; # — p<0,05 относительно величин, получаемых при стимуляции клеток ангиотензином.

К числу факторов, секреция которых стимулируется ангиотензином, относятся GROa, IL-6, IL-8, MCP-3, RANTES/CCL5, VEGF, IP-10 и эотаксин. Уровень секреции MCP-1 sCD40L не зависит от присутствия ангиотензина в среде культивирования (см. рис. 3, а). Стимуляция ангиотензином секреции GROa и IL-8 сохраняется в присутствии мелатонина и телмисартана, однако этот эффект нивелируется в отношении IL-6, MCP-3, RANTES, VEGFA и эотаксина. Обращает на себя внимание то, что мелатонин сам по себе оказывает стимулирующее воздействие на секрецию GROa, IL-6, IL-8, MCP-1, MCP-3, RANTES, VEGFA, IP-10 и эотаксина. Телмисартан стимулирует секрецию GROa и MCP-3, однако в сочетании с ангиотензином снижает секрецию IL-6, MCP-3, RANTES, IP-10 и Eotaxin.

Анализ транскриптома протеолитических ферментов — матриксных металлопротеиназ — выявил усиление транскрипционной экспрессии коллагеназы 1 (MMP1), стромелизина (MMP3) и желатиназы Б (MMP9) в присутствии ангиотензина, при отсутствии значительных эффектов со стороны мелатонина и телмисартана (см. рис. 3, б). Уровень экспрессии тканевых ингибиторов металлопротеиназ TIMP1, TIMP2 в присутствии ангиотензина, мелатонина и телмисартана не менялся (см. рис. 3, б).

Проведенный нами анализ показал, что ангиотензин оказывает значительное воздействие на секреторный профиль МСК. Поскольку ангиотензин оказывает значительное воздействие от присутствия телмисартана и мелатонина, он имеет комплексный характер и опосредуется рецепторными механизмами и окислительным стрессом.

Заключение

Стойкое системное и локальное повышение концентрации ангиотензина в организме является патогенетическим фактором, приводящим к развитию заболеваний сердечно-сосудистой системы и ряда других органов и тканей. Существенным осложняющим компонентом является развитие преждевременного старения органов, усугубляющее основной патологический процесс.

Развитие сенесценции, вызванной ангиотензином, продемонстрировано на ряде клеточных моделей. Проведенное нами исследование показало, что мезенхимальные стволовые клетки также могут быть использованы в качестве модели сенесценции, индуцируемой ангиотензином, поскольку длительное воздействие этого гормона на них вызывает экспрессию сенесцентных маркеров, и усиливает секрецию ряда факторов, характеризующих сенесцентный секреторный фенотип. Этот эффект может быть нивелирован фармакологическими соединениями, влияющими на активность рецепторов ангиотензина и оказывающими антиоксидантное действие.

Применение блокаторов ангиотензиновых рецепторов и антиоксидантов, устраняющих или смягчающих развитие сенесценции, вызванной ангиотензином, создает возможность для нормального функционирования соматических клеток в условиях повышенной выработки этого гормона. Дальнейшие исследования в этом направлении помогут конкретизировать механизмы, ответственные за сеномодулирующее влияние вышеописанных препаратов, а также подобрать группу соединений, оказывающих аналогичное действие.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 23-15-00539.

Вклад авторов:

Концепция и дизайн исследования — Болотская А.А., Калинин А.П., Зубкова Е.С., Меньшиков М.Ю.

Сбор и обработка материала — Болотская А.А., Калинин А.П., Зубкова Е.С.

Статистическая обработка данных — Ратнер Е И., Меньшиков М.Ю.

Написание текста — Ратнер Е И., Меньшиков М.Ю.

Редактирование — Болотская А.А., Калинин А.П., Зубкова Е.С.