Белова Е.В.

Клиническое отделение патологии ЛОР-органов НИИ медицинских проблем Севера Сибирского отделения РАМН, Красноярск

Капустина Т.А.

Клиническое отделение патологии ЛОР-органов Научно-исследовательского института медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярск

Маркина А.Н.

Клиническое отделение патологии ЛОР-органов Научно-исследовательского института медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярск

Парилова О.В.

Клиническое отделение патологии ЛОР-органов Научно-исследовательского института медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярск

Алгоритм лабораторной диагностики хламидийной инфекции у больных хроническим синуситом

Журнал: Вестник оториноларингологии. 2015;80(4): 61-64

Просмотров : 4

Загрузок :

Как цитировать

Белова Е. В., Капустина Т. А., Маркина А. Н., Парилова О. В. Алгоритм лабораторной диагностики хламидийной инфекции у больных хроническим синуситом. Вестник оториноларингологии. 2015;80(4):61-64. https://doi.org/10.17116/otorino201580461-64

Авторы:

Белова Е.В.

Клиническое отделение патологии ЛОР-органов НИИ медицинских проблем Севера Сибирского отделения РАМН, Красноярск

Все авторы (4)

Хламидийная инфекция является серьезной проблемой здравоохранения вследствие широкого распространения и негативного влияния на здоровье населения. В последние годы зарубежные и российские ученые рассматривают хламидии в качестве важного возбудителя, инициирующего воспалительные заболевания верхних отделов респираторного тракта и среднего уха. Однако сведения о частоте обнаружения этой инфекции при патологии носа, околоносовых пазух и глотки колеблются в значительных пределах: от 7 до 74,4% [1—10]. Такие колебания в частоте выявления хламидийной инфекции можно объяснить применением разных по чувствительности и специфичности лабораторных тестов идентификации хламидий, а также различными методическими подходами в организации исследования.

Учитывая отсутствие четких патогномоничных клинических симптомов респираторного хламидиоза, решающее значение для верификации имеет лабораторная диагностика [2—5], отличающаяся от традиционной для клинической бактериологии верификации возбудителей инфекционных заболеваний. Это связано с биологическими свойствами хламидий, основным из которых является внутриклеточное существование, подразумевающее невозможность выделения возбудителя на питательных средах.

В настоящее время для идентификации хламидийной инфекции любой локализации применяются разнообразные лабораторные методы, отличающиеся друг от друга выявляемыми маркерам возбудителя, специфичностью и чувствительностью, трудоемкостью, временными параметрами тестирования, сферой применения, стоимостью и т. д. Причем чувствительность и специфичность методов исследования будет разной в зависимости от локализации хламидийной инфекции.

На сегодня самым достоверным и высокоспецифичным, но в то же время самым трудоемким, дорогостоящим и недостаточно распространенным и экстренным методом непосредственного обнаружения хламидий является бактериологический метод культивирования возбудителя in vitro на чувствительных клетках. Отрицательный результат бактериологического анализа является пока единственным доказательством отсутствия живых хламидий и объективным подтверждением эффективности проведенной эрадикационной терапии.

Методы ДНК-диагностики позволяют с высокой точностью идентифицировать последовательность нуклеотидов в геноме исследуемого инфекционного микроорганизма (специфичность и чувствительность метода ДНК-диагностики от 90 до 94,8%). В настоящее время разработан ряд методов амплификации нуклеиновых кислот, но только один из них нашел применение для выявления хламидийной ДНК (РНК) — полимеразная цепная реакция (ПЦР). К преимуществам молекулярно-биологических методов относятся ранняя диагностика хламидийной инфекции у серонегативных больных, выявление бессимптомных форм хламидиоза, отсроченный контроль после лечения, возможность определения широкого спектра возбудителей в одном клиническом образце. В настоящее время ведутся разработки по использованию методов амплификации нуклеиновых кислот для изучения генов вирулентности и генов антибиотикорезистентности хламидий.

Наиболее часто употребляемым методом выявления хламидийного инфицирования является иммунофлюоресцентный анализ, который уступает по своей специфичности (65—98%) биологическому методу, а по чувствительности (65—87%) — генно-молекулярному методу. В основе этого метода лежит взаимодействие хламидийных антигенов с хламидийными антителами, содержащихся в стандартных диагностических иммунных сыворотках. Результаты этого взаимодействия регистрируются объективно с помощью люминесцентного микроскопа, поэтому иногда этот метод причисляют к бактериоскопическим методам. Для диагностики хламидиоза верхних дыхательных путей и идентификации вида возбудителя можно применять как прямой ПИФ, так и непрямой иммунофлюоресцентный метод. Кроме этого, данные тесты способны выявлять не только корпускулярные, но и растворимые антигены хламидий.

К сожалению, отрицательные результаты иммунофлюоресцентного анализа и ДНК-диагностики являются отсроченными маркерами выздоровления. Это обусловлено тем, что результаты этих тестов остаются позитивными в течение 1,5—2 мес после окончания этиотропной терапии до тех пор, пока не элиминируются пассивные следы инфекции (остатки структур хламидий, погибшие микроорганизмы).

Для серологической диагностики антител в настоящее время наиболее часто используется иммуноферментный анализ (ИФА). Применяемые сегодня иммуноферментные тест-системы для выявления хламидийных антител этим методом более чувствительные, чем тест-системы для выявления хламидийных антигенов этим же методом. Это связано с тем, что в качестве антигена в диагностических системах используются не только родоспецифические фрагменты липополисахарида, но и видоспецифические белковые детерминанты основного белка наружной мембраны хламидий, обеспечивающие четкую видовую диагностику. Чувствительность ИФА для определения хламидийных антител колеблется в зависимости от применяемых тест-систем от 75 до 95%, специфичность — от 70 до 95%. Достоинством метода является возможность определения иммуноглобулинов классов G, A и М, а к недостаткам и ограничениям можно отнести требования специального оснащения и высокой квалификации врачей-лаборантов.

Поскольку хламидии обладают слабой антигенной активностью, наработка и накопление антител в инфицированном макроорганизме происходит в небольших количествах, поэтому ИФА наиболее информативен при первичной острой инфекции и в период реактивации хронической инфекции. Кроме того, диагностическая значимость этого метода значительно повышается в случаях генерализации хламидийной инфекции.

К недостаткам ИФА, как и других иммунохимических методов обнаружения антител, относится то, что даже у здорового населения может отмечаться фоновый титр антител к хламидиям в результате широких контактов с хламидиями, не сопровождающихся возникновением заболевания, или у переболевших и самостоятельно выздоровевших лиц.

Цитологический метод недостаточно информативен для диагностики хламидийной инфекции из-за низкой чувствительности (от 5 до 30%).

Учитывая недостаточно высокие операционные характеристики каждого из лабораторных тестов, ряд исследователей предлагают одновременное использование двух и более лабораторных методов выявления хламидийного возбудителя, однако данные рекомендации касаются пациентов с патологией урогенитального тракта [11, 12].

Цель исследования — разработка наиболее эффективного комплекса лабораторных методов диагностики хламидийного инфицирования слизистой оболочки носа и околоносовых пазух у больных с хроническим синуситом.

Пациенты и методы

Всего обследованы 168 пациентов в возрасте от 18 до 65 лет, поступившие в ЛОР-отделение с обострением хронического воспаления околоносовых пазух. Диагноз синусита подтверждался рентгенологическим исследованием. Шифровку диагнозов осуществляли по статистической классификации болезней, травм и причин смерти (МКБ-10). Диагностику ЛОР-заболеваний проводили по общепринятой в оториноларингологии методике.

У всех больных проводилась верификация двух видов хламидий: Сhlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae. Для выявления хламидийных структур (антигенов и ДНК) применялись прямой иммунофлюоресцентный метод (ПИФ) с использованием тест-систем Хламислайд («Лабдиагностика», Россия) и полимеразно-цепная реакция с использованием тест-систем ВектоХлами-ДНК-ампли (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Видоспецифические противохламидийные иммуноглобулины классов A, M, G были определены иммуноферментным методом (ИФА) с использованием тест-системы ХламиБест-стрип (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Материалом для прямой идентификации хламидийного антигена являлись мазки-соскобы со слизистой оболочки носа.

Учитывая, что хламидии имеют большую тропность к цилиндрическому эпителию, оптимальными местами для взятия мазков являются участки слизистой оболочки, покрытые цилиндрическим мерцательным многоядерным эпителием, локализующимся в области дна полости носа и боковых стенок носа до нижнего края средней носовой раковины. Забор мазков со слизистой оболочки носа для последующего проведения ПИФ осуществлялся с помощью стерильного одноразового зонда с ватным тампоном или стерильной одноразовой специальной щеточкой в нескольких точках. При этом зонд или щеточку прижимали к поверхности слизистой оболочки и смещали легким поскабливающим движением. В случаях избытка слизи или наличия гнойного отделяемого поверхность слизистой оболочки очищалась от них другим ватным тампоном. Обязательными условиями, определяющими качество забора материала для исследования, являются наличие в мазке неразрушенных эпителиальных клеток и отсутствие примеси крови. Взятый материал распределялся тонким слоем по поверхности лунок обезжиренного предметного стекла, подсушивался на воздухе. В случае невозможности доставки в лабораторию образца в тот же день последний фиксировался в этиловом спирте 96° С с последующим хранением при температуре 4—8 °С не более 7 дней.

Для диагностики хламидийных ДНК методом ПЦР зонд с тампоном или щеточку погружали в одноразовую пробирку типа Эппендорф со специальной транспортной средой, где они несколько раз ротировались, затем удаляли из пробирки, которую плотно закрывали и доставляли в лабораторию не позднее 2 ч после взятия биологического образца.

Материалом для проведения серологического метода (ИФА) являлась венозная кровь в объеме 2,5—3,0 мл, взятая у обследуемых лиц натощак из локтевой вены в сухую центрифужную пробирку.

Анализируемые качественные признаки представлены в виде относительной частоты и 95% доверительного интервала (ДИ).

Результаты и обсуждение

Хламидийные структуры в мазках, взятых со слизистой оболочки носа у больных с хроническим синуситом методом ПЦР, были обнаружены у 56 обследуемых лиц (33,3%, ДИ 26,4—40,6%). Интересным представляется тот факт, что у 9 больных (5,4%, ДИ 2,5—9,3%) с верифицированным методом ПИФ хламидийным возбудителем ДНК-обследование не подтвердило наличие хламидийной инфекции.

Методом ПИФ хламидии были верифицированы у меньшего числа больных — у 47 (27,9%, ДИ 21,5—35%). Причем у 7 больных (4,2%, ДИ 1,7—7,7%) с положительными результатами исследования методом ПИФ ДНК-диагностика не подтвердила наличие хламидийной инфекции в слизистой оболочке носа.

Применение ИФА позволило выявить наличие противохламидийных антител классов A и G в диагностических титрах у 42 пациентов (25,0%, ДИ 18,8—31,8%). При этом у 5 (3,0%, ДИ 1,0—6,1%) больных с положительным результатом ИФА отрицательными оказались оба прямых теста, а у 3 лиц (1,8%, ДИ 0,3—4,3%) отрицательный результат получен при ПИФ или ПЦР.

Снижение чувствительности прямых методов может быть обусловлено неправильным забором и хранением клинического материала, отсутствием хламидийного возбудителя в месте забора мазка, полным или частичным разрушением специфических белков и генома, различным качеством используемых тест-систем. Загрязнение исследуемых образцов хламидиями при несоблюдении мер для предупреждения контаминации из внешней среды может быть одной из причин снижения специфичности. Ложноположительные результаты могут быть получены при отсутствии живых хламидий, но при наличии их остатков в виде отдельных структур (антигенов, ДНК, РНК). Кроме того, результаты прямого иммунофлюоресцентного исследования могут зависеть от квалификации врача-лаборанта и его субъективной оценки.

Таким образом, вероятность получения как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов лабораторных методов диагностики хламидийной инфекции определяет необходимость в их комплексном применении. При одновременном использовании 3 методов (двух прямых и одного непрямого тестов) наличие хламидийной инфекции было подтверждено у большего числа лиц — у 61 пациента (36,9%, ДИ 29,2—43,7%) против верификации методами ПЦР, ПИФ и ИФА (соответственно 33,3, 27,9 и 25,0%). Кроме того, применение комплекса методов лабораторной диагностики позволяет избежать получения как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов, имеющих место при использовании только одного лабораторного теста.

Сопоставление результатов всех трех лабораторных методов исследования определяет тактику ведения пациентов с подозрением на хламидийное инфицирование слизистой оболочки верхних дыхательных путей (см. таблицу). Так, положительные результаты трех или двух методов указывают на наличие хламидийной инфекции, требующее назначения этиологического лечения. Обнаружение хламидий в мазках со слизистой оболочки верхних дыхательных путей одним из двух прямых тестов при отрицательном результате ИФА не может трактоваться однозначно, и в этом случае необходимо повторное исследование. Положительные результаты серологического анализа не позволяют выявить очаг хламидийной инфекции, но наличие отрицательного результата при использовании прямого метода выявления хламидийного возбудителя из предполагаемого очага поражения нацеливает врача на повторную индикацию возбудителя или на поиск другой локализации хламидий. Необходимо учитывать и тот факт, что отрицательные результаты серологических тестов не исключают наличие персистирующей хламидийной инфекции.

Алгоритм обследования пациентов с подозрением на хламидийное инфицирование слизистой оболочки околоносовых пазух Примечание. Представленный комплекс диагностических тестов необходимо проводить в отношении как Chlamydophila pneumoniae, так и Chlamydiа trachomatis.

Во избежание получения ложноположительных результатов проверку качества лечения следует проводить по истечении 1,5 мес после окончания эрадикационной терапии, так как только к этому сроку наступает полная элиминация пассивных следов инфекции и смена эпителиального покрова [13—15]. Использование представленного комплекса лабораторной диагностики хламидийной инфекции будет способствовать своевременному назначению этиотропного лечения определенными группами антибиотиков (макролидами, фторхинолонами, тетрациклинами), элиминирующими возбудителя, укорочению периода обострения заболевания, снижению вероятности осложнений и формирования тяжелых форм болезни, предотвращению диссеминации хламидий в организме с последующим развитием экстра-респираторных очагов поражения.

Выводы

1. Неравнозначные диагностические результаты использования разных методов лабораторной диагностики хламидийного поражения определяют необходимость комплексного использования диагностических тестов для верификации хламидий у больных с воспалительными заболеваниями носа и околоносовых пазух. Наиболее оптимальным комплексом является одновременное применение двух прямых и одного непрямого методов.

2. Результаты лабораторных методов идентификации хламидийного возбудителя обязательно должны сопоставляться с анамнестическими сведениями, клиническими проявлениями заболевания и данными объективного осмотра ЛОР-органов.

3. Применение лабораторного комплекса позволяет повысить эффективность диагностики воспалительных заболеваний носа и околоносовых пазух, ассоциированных с хламидийной инфекцией, а также определить диагностическую тактику ведения пациентов с этой инфекцией.

4. Предложенный алгоритм лабораторной диагностики можно использовать не только для доказательства или опровержения хламидийного инфицирования, но и в качестве контроля результативности проводимых противохламидийных лечебных мероприятий.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail