Ауто-ТСК — трансплантация аутологичных стволовых клеток

ВБП — выживаемость без прогрессирования заболевания

КМ — костный мозг

ММ — множественная миелома

ОВ — общая выживаемость

ХА — хромосомные аномалии

-13/13q — моносомия 13 или делеция локуса 13q14

Amp1q21 — амплификация локуса 1q21

CD — cluster of differentiation — кластер дифференцировки

Сdk — Cyclin-dependent kinase — зависимая от циклинов киназа

CKS1B — Cyclin-dependent kinases regulatory subunit 1, ген

del1p32 — делеция локуса 1р32

del17p13/TP53 — делеция локуса 17р13 c потерей гена ТР53

GEP — gene expression progiling — профильэкспрессиигена

FISH — флуоресцентнаягибридизацияin situ

SKY — Spectral Karyotyping — многоцветноеспектральноекариотипирование

t (8q24)/cMYC — транслокация с вовлечением локуса гена cMYC/8q24

Множественная миелома (ММ, миеломная болезнь, болезнь Рустицкого—Калера) — злокачественное лимфопролиферативное заболевание, характеризующееся инфильтрацией костного мозга (КМ) плазматическими клетками, наличием моноклонального иммуноглобулина в сыворотке и/или в моче и остеолитическими поражениями костей. В соответствии с классификацией ВОЗ ММ относится к периферическим В-клеточным лимфоидным опухолям [1, 2].

ММ является второй по распространенности гематологической опухолью и составляет примерно 1% от всех злокачественных новообразований [3]. Несмотря на успехи в лечении ММ, заболевание остается неизлечимым, однако медиана продолжительности жизни увеличилась c 3 до 6 лет в результате применения новых лекарственных препаратов и трансплантации аутологичных стволовых клеток (ауто-ТСК) [4, 5].

ММ характеризуется выраженной геномной гетерогенностью [6], обусловленной множеством численных и структурных изменений хромосом [7, 8], которые играют важную роль в онкогенезе, приводя к генному дисбалансу [9], изменению структуры и функции генов и вследствие этого к нарушению регуляции клеточного цикла и дифференцировки клеток [8].

Многочисленные исследования показали, что некоторые цитогенетические изменения имеют большое прогностическое значение, определяют выживаемость и ответ на терапию при ММ [10].

Первые хромосомные перестройки, ассоциированные с ММ, описаны в конце 70-х — начале 80-х годов прошлого века. В 1985 г. G. DeWald и соавт. [11] в исследовании, основанном на стандартном цитогенетическом методе, показано, что наиболее часто в структурные аномалии вовлекаются 1, 11 и 14-я хромосомы.

В настоящее время накоплена обширная информация о хромосомных аберрациях при ММ, полученная с использованием стандартной методики дифференциального окрашивания хромосом, а также молекулярно-цитогенетических методов исследования, таких как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) и многоцветное спектральное кариотипирование (SKY).

На основании первичных или инициирующих хромосомных нарушений [8] выделяют две генетические группы ММ: с множественными трисомиями и с транслокациями с вовлечением локуса генов тяжелых цепей иммуноглобулина IgH/14q32 (tIgH/14q32). Множественные трисомии встречаются примерно в 40—60% случаев [12, 13] и чаще всего представлены 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 и 21-й хромосомами [6]. Частота перестроек с вовлечением локуса гена IgH/14q32 составляет 50% [13]. Примерно в 15% случаев трисомии могут сочетаться с транслокациями [12]. Самыми частыми транслокациями с вовлечением локуса гена IgH/14q32 являются t (11;14)(q13;q32) и t (4;14)(р16;q32), которые выявляются примерно в 20 и 15% случаев впервые диагностированной ММ соответственно [14, 15]. Реже встречаются t (14;16)(q32;q23), t (14;20)(q32;q12), (6;14)(р21;q32) (3, 2 и 1% соответственно) [10—12]. Транслокации t (11;14)(q13;q32), t (6;14)(р21;q32) рассматриваются в качестве стандартного риска, при которых медиана общей продолжительности жизни составляет 8—10 лет [13, 15], тогда как t (4;14)(р16;q32), t (14;16)(q32;q23), t (14;20)(q32;q12) являются факторами неблагоприятного прогноза [13, 16—18]. Медиана общей продолжительности жизни у этих больных варьирует от 14,4 до 30,1 мес [16].

Среди вторичных, появляющихся в ходе опухолевой трансформации, перестроек хромосом при ММ наиболее часто выявляются делеция локуса 13q14/моносомия 13 (-13/13q-), амплификация локуса 1q21 (amp1q21), делеция 17р13 c потерей гена ТР53 (del17p13/TP53) и транслокация с вовлечением локуса гена cMYC/8q24 (t (8q24)/cMYC) [8]. Моносомия 13, или делеция локуса 13q14, встречается примерно в 45% случаев и длительное время считалась фактором неблагоприятного прогноза, обусловливая химиорезистентность опухоли, но с применением новых препаратов биологически направленного действия ее неблагоприятное влияние на течение заболевания нивелировалось [19]. Частота потери локуса гена ТР53 составляет примерно 10% случаев впервые выявленной ММ и увеличивается при рецидивах и появлении экстрамедуллярных очагов. Это генетическое нарушение определяет низкую общую выживаемость (ОВ) и частоту достижения полных ремиссий [17]. Перестройки локуса гена cMYC встречаются примерно в 15% случаев [4, 13], их прогностическое значение находится на стадии изучения.

Amp1q21 является одним из наиболее распространенных хромосомных нарушений при ММ. Amp1q21 связана с прогрессирующим течением заболевания: на момент установления диагноза выявляется у 46—50% больных, в прогрессировании частота выявления достигает 72% [20]. Несмотря на то что amp1q21 является одной из самых частых аберраций при ММ, сообщения о ее прогностическом значении остаются противоречивыми.

В Клинике Мейо (Рочестер, США) на основании результатов стандартного цитогенетического исследования, FISH и профиля экспрессии множества генов проведена стратификация риска у пациентов на группы стандартного, промежуточного и высокого риска и дифференцированная терапия в этих группах. Пациентов с amp1q21 относят к группе промежуточного риска, медиана общей продолжительности жизни составляет 4—5 лет [18].

По данным других исследователей, amp1q21, как и t (4;14), t (14;16), t (14;20) и del17p13/TP53, является фактором высокого риска у больных ММ [21].

В ряде исследований показана зависимость общей продолжительности жизни от количества дополнительных копий 1q21 [22, 23]. У больных с 2 дополнительными копиями 1q21 и более медиана продолжительности жизни без прогрессирования статистически значимо ниже, чем у больных лишь с 1 дополнительной копией (17,6 и 28 мес соответственно), а 3-летняя ОВ составляет 52 и 78% соответственно [23].

Определение amp1q21 в настоящее время не включается в общепринятые диагностические тесты, однако прогностическое влияние amp1q21 на течение ММ активно изучается в мире.

Целью нашего исследования являлась оценка распространенности amp1q21 и ее связи с клиническими проявлениями заболевания.

В работу включены 134 больных ММ, наблюдавшихся в клинических подразделениях ФГБУ ГНЦ Минздрава Р.Ф. и отделении химиотерапии гемобластозов ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина Минздрава Р.Ф. с декабря 2009 г. по март 2016 г.: 67 мужчин и 67 женщин в возрасте от 30 лет до 81 года (медиана 57 лет). Всем больным выполнено FISH-исследование КМ до начала терапии; 12 больным повторное FISH-исследование выполнено в период прогрессирования заболевания. Сроки наблюдения за пациентами варьировали от 3,2 до 77,4 мес (19,3 мес).

Диагноз устанавливали в соответствии с критериями, разработанными Международной рабочей группой по изучению множественной миеломы (The International Myeloma Working Group — IMWG) [24].

Всем больным выполняли общий клинический и биохимический анализы крови, цитологическое исследование пунктата и гистологическое исследование трепанобиоптата КМ и/или биоптата мягкотканного образования, иммунохимический анализ крови и суточной мочи, рентгенологическое исследование костей. Цитогенетическое исследование клеток КМ выполнялось в научно-клинической лаборатории кариологии ФГБУ ГНЦ МЗ РФ.

В зависимости от количества плазматических клеток в миелограмме цитогенетическое исследование КМ выполняли на мононуклеарах (при количестве плазматических клеток в пунктате >20%) или на клетках CD138+ (при количестве плазматических клеток <20%) с последующим проведением FISH. Позитивную иммуномагнитную селекцию клеток CD138+ из фракции мононуклеаров выполняли с использованием моноклонального антитела к CD138 (MicroBead kit, «Miltenyi Biotec», Германия) согласно протоколу производителя [25].

Контроль чистоты полученной фракции клеток выполняли методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител анти-CD138-PE (BD, США). Чистота полученной фракции составила 80—99%.

У 80 пациентов FISH-исследование проводили на тотальных клетках КМ, у 54 — на сепарированных клетках CD138+.

Для выявления аномалий 1-й хромосомы использовали ДНК-зонд XL 1p32/1q21 («MetaSystems», Германия), с помощью которого анализируются локусы 1q и 1р. Поиск других первичных и вторичных хромосомных аномалий (ХА) выполняли с использованием ДНК-зондов: XL IGH plus, XL t (11;14), XL t (4;14), XL t (14;16), XL t (14;20), XL t (6;14), cMYC BA («MetaSystems», Германия) и D13S25, TP53 deletion probe («Cytocell», Объединенное Королевство), LSI D5S23/D5S721, CEP9, CEP15 Multi-Color Probe («Abbott», США) и ON MM 15q22 / 9q34 («Kreatech», Нидерланды). Исследование проводили согласно протоколам производителей. Для каждого зонда анализировали по 200 интерфазных ядер с четкими сигналами. Результаты FISH-анализа описывали в соответствии с международной номенклатурой (International System for Cytogenetic Nomenclature, ISCN, 2013) [26].

Всем больным, включенным в исследование, индукционную терапию проводили курсами содержащими, бортезомиб (VCD: бортезомиб + циклофосфан + дексаметазон, PAD: бортезомиб + адриабластин + дексаметазон). Ауто-ТСК выполнена 48 пациентам.

Согласно системе определения стадии ММ по Durie-Salmon I стадия диагностирована у 8 (6%) больных, II — у 41 (30,6%), III — у 85 (63,4%). У 41 (30,6%) больного диагностирована подстадия В. Иммунохимический вариант определен как G у 70 (52,3%) больных, А у 25 (18,7%), биклональная секреция у 3 (2,2%) больных, М у 1 (0,7%). Секреция свободных легких цепей определена у 34 (25,4%) больных. Несекретирующая миелома диагностирована у 1 (0,7%) пациента. На момент исследования согласно международной системе ISS I стадия диагностирована у 27 (20,1%) больных, II — у 38 (28,4%), III — у 68 (50,8%), у 1 (0,7%) нет данных. Частота клинических проявлений у больных ММ представлена в табл. 1.

ОВ оценивали у 131 (97,8%) пациента из 134, так как 3 (2,2%) больных с вялотекущей миеломой не получают лечение и находятся под наблюдением.

Для статистической обработки данных использовали стандартные методы описательного, частотного и событийного анализа. Расчеты проводили с помощью процедур пакета SAS 9.4. За начальную точку отсчета взята дата установления диагноза. ОВ рассчитывали от начала лечения до даты смерти или даты последнего обращения к врачу. Анализ О.В. проводили с помощью метода Каплана—Мейера, для оценки статистической значимости различий в группах использовали логранговый тест.

Частота выявления ХА. В результате проведенных исследований ХА выявлены у 133 (99,3%) больных. Первичные патогенетические ХА выявлены у 118 (88,1%) пациентов: tIgH/14q32 — у 57 (42,5%), множественные трисомии хромосом 5/9/15 — у 77 (57,5%), у 15 (11,2%) больных они сочетались между собой, у 3 (2,2%) выявлена гипоплоидия. У 12 (9%) больных первичные хромосомные нарушения не выявлены. Частота выявления отдельных транслокаций IgH/14q32 составила: t (11;14) — 16,4% (22 больных), t (4;14) — 12,7% (17 больных), t (14;16) — 3,7% (5 больных), t (14;20) — 2,2% (3 больных), t (6;14) выявлена у 1 (0,7%) больного, хромосомный партнер не установлен у 9 (6,8%) больных.

Среди вторичных хромосомных нарушений наиболее часто встречались del13q14 и amp1q21. Del13q14 выявлена у 54 (40,3%) пациентов. Amp1q21 обнаружена у 53 больных (39,6%) и у 3 (2,2%) пациентов — делеция локуса 1р32 (del1p32), у 1 (0,7%) — моносомия 1-й хромосомы. Del17p13/ТР53 обнаружен у 17 (12,7%); t (8q24)/сMYC — у 23 (17,2%). В табл. 2 представлена частота выявления ХА у больных ММ.

Частота выявления amp1q21. Аmp1q21 выявлена у 53 (39,6%) больных. В 32 (60,4%) из 53 случаев выявлено 3 копии локуса 1q21, в 21 (39,6%) — более 3 (от 4 до 7) копий 1q21 (рис. 1).

При повторном FISH-исследовании у 12 (17,4%) из 69 пациентов с диагностированным прогрессированием заболевания amp1q21 выявлена у 9 (75%), при этом у 2 больных amp1q21 зарегистрирована только в период прогрессирования в отсутствие в дебюте заболевания.

Анализ ОВ больных ММ с amp1q21 и без нее. Анализ выживаемости выявил различия в зависимости от наличия или отсутствия amp1q21 в дебюте заболевания. Соответствующие кривые ОВ представлены на рис. 2, а. Так, 5-летняя ОВ больных, у которых обнаружена amp1q21, составила 43,5%, в то время как у больных без amp1q21 — 79,4% (p=0,07).

Анализ ОВ больных ММ в зависимости от количества копий локуса 1q21. Сопоставление показателей ОВ в зависимости от количества выявленных копий 1q21 показало достоверно неблагоприятное влияние большого числа дополнительных копий. Так, 5-летняя ОВ больных с 1 дополнительной копией 1q21 (3 копии) составила 67,3%, а с 2 дополнительными копиями и более 1q21 (4—7 копий)—20,9% (р=0,0016) (см. рис. 2, б).

Цитогенетическое исследование КМ больных в период прогрессирования ММ. У 10 из 12 пациентов, которым повторное цитогенетическое исследование проводилось в период прогрессирования заболевания, не выявлено новых цитогенетических изменений при сравнении с первичным исследованием.

У 2 пациентов при прогрессировании ММ мы обнаружили появление новых, ранее не определяемых цитогенетических нарушений. В обоих случаях этим цитогенетическим нарушением оказалась amp1q21. Мы не обнаружили увеличения числа копий 1q21 в ходе прогрессии ММ.

У одного из этих пациентов в дебюте заболевания выявлен лишь гипердиплоидный тип ММ, а спустя 17 мес на фоне прогрессирования появилась amp1q21.

У второй больной при исследовании в дебюте заболевания выявлены del13q14 и t (11;14)(q13;q32), а при повторном исследовании во время рецидива, резвившегося спустя 20 мес и проявившегося в виде увеличения патологической секреции, появления новых мягкотканных компонентов, определена amp1q21 в 22% интерфазных ядер (рис. 3).

ММ — плазмоклеточная опухоль, характеризующаяся выраженной геномной нестабильностью [3]. Хромосомные аберрации считаются одним из наиболее важных прогностических факторов у больных ММ. К сожалению, в связи с низкой пролиферативной активностью плазматических клеток успешное стандартное цитогенетическое исследование — выявление ХА в аберрантном кариотипе может быть выполнено только в 30% случаев и в основном у больных с развернутыми стадиями заболевания [27]. Однако молекулярно-цитогенетический анализ с использованием метода FISH позволяет выявить ХА у 90% больных ММ [28]. В нашем исследовании методом FISH ХА выявлены у 99% больных.

В нашей работе amp1q21 оказалась часто встречаемой ХА при ММ, которая выявлена у 53 (39,6%) из 134 больных. Полученный результат сопоставим с данными мировой литературы, отмечавшей, что среди больных с впервые выявленной ММ данная ХА встречается у 32—49% [3, 22, 23].

Нами получены различия по ОВ в группах с наличием amp1q21 и в ее отсутствие. Так, 5-летняя ОВ больных с amp1q21 практически в 2 раза ниже, чем у больных без amp1q21, и составила 43,5%, в то время как без данной ХА — 79,4% (p=0,07).

В последние годы достигнут значительный прогресс в определении конкретных ХА и их роли в биологии и влиянии на течение М.М. Вероятно, неблагоприятное влияние amp1q21 связано с биологическими механизмами, которые запускаются при ее амплификации. В регионе 1q21 расположено большое количество генов, однако наиболее вероятным кандидатным геном, участвующим в патогенезе ММ, является ген cyclin kinase subunit 1B (CKS1B). Белок CKS1B относится к группе малых протеинов (9—18 kDa), которые взаимодействуют с зависимыми от циклинов киназами (Сdk), играющими важную роль в клеточном цикле [29, 30]. CKS1B взаимодействует с зависимым от циклинов комплексом p27kip1-Cdk/cyclin, который далее индуцирует формирование зависимого от убиквитина комплекса p27kip1-SCF [31].

В результате этого взаимодействия происходит инициация убиквинирования и деградации (зависимый от убиквитина протеолиз) p27Kip1, что приводит к остановке клетки в стадии G1/S, нарушая тем самым клеточный цикл. Деградация p27Kip1 является важным шагом в развитии опухолевого процесса [32], так как в норме p27Kip1 является туморосупрессором [33].

Увеличение числа копий региона 1q21 приводит к гиперэкспрессии гена CKS1B [32]. Во многих исследованиях доказано, что гиперэкспрессия гена СKS1B коррелирует со снижением уровня p27Kip1 [34]. Однако имеются сообщения о немногочисленной группе пациентов, у которых могут определяться как низкие, так и высокие уровни СKS1B и p27Kip1 [32].

По данным литературы, гиперэкспрессия гена CKS1B ассоциируется с неблагоприятным прогнозом при различных онкологических заболеваниях, в том числе ММ [29, 35]. Hong Chang и соавт. [32] показали, что медиана общей продолжительности жизни у больных с гиперэкспрессией СKS1B и без нее составила 44,5 и 89,3 мес., соответственно (р<0,0001).

Гиперэкспрессия гена СKS1B при ММ может быть определена на уровне мРНК с помощью GEP (gene expression progiling) — количественного анализа экспрессии генов [34, 36], а также на белковом уровне с помощью Western blotting (белковый иммуноблот) и иммуногистохимического исследования [29, 32].

Из данных литературы известно, что на ОВ и выживаемость без прогрессирования заболевания (ВБП) больных ММ влияет не только наличие amp1q21, но и количество копий данного локуса [22, 23, 37]. Так, Kai Neben и соавт. [23] в своей работе показали, что по сравнению с нормальным числом копий 1q21 (2), когда медиана ВБП для больных составила 39,3 мес, медиана ВБП соответственно с 3 копиями и более 3 копий 1q21 составляет 28 мес (отношение рисков 1,7; р=0,0010) и 17,6 мес (отношение рисков 2,5; р =0,0062). Сходные результаты наблюдались и в ОВ: 3-летняя ОВ составила 82% (отношение рисков 1,9; р =0,0052), 73% (отношение рисков 1,7; р =0,0032), 52% (отношение рисков 4,0; р=0,0009) у пациентов без amp1q21, соответственно c 3 копиями и более 3 копий.

В нашем исследовании при оценке ОВ оказалось, что наличие 3 копий 1q21 достоверно не влияет на ОВ, в то время как у больных более чем с 3 копиями 1q21 этот показатель статистически значимо ниже.

В опубликованной литературе представлены единичные исследования, посвященные поиску amp1q21 как в дебюте, так и в прогрессии ММ. В нашем исследовании мы показали, что amp1q21 может появляться при прогрессировании заболевания, обнаружив это у 2 больных М.М. Частота выявления amp1q21 увеличивается в период прогрессирования заболевания, но число копий в ходе трансформации опухоли не изменяется.

В заключение следует отметить необходимость проведения молекулярно-цитогенетичеcкого исследования КМ больных ММ в момент установления диагноза, а также выполнение повторного исследования FISH при прогрессировании заболевания, поскольку появление ранее не выявлявшихся ХА, в частности amp1q21, может своевременно указать на целесообразность смены тактики лечения конкретного больного.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 15−04−02568).