АПФ — ангиотензинпревращающий фермент

АФ — автофлюоресценция

БРА — блокаторы рецепторов ангиотензина

ГД — гемодиализ

ЗПТ — терапия, замещающая функцию почек

ИБС — ишемическая болезнь сердца

ИКЧ — индекс коморбидности Чарлсона

КПГ — конечные продукты гликирования

СД — сахарный диабет

EN-RAGE — экстрацеллюлярный белок, связывающий RAGE

При нарушении функции почек происходит задержка в организме целого ряда веществ, обладающих доказанными или предполагаемыми патогенными свойствами — уремических токсинов [1, 2]. К таковым относятся и конечные продукты гликирования — КПГ (в англоязычной литературе: advanced glycation end products — AGE).

КПГ — гетерогенная группа веществ, образующихся в результате взаимодействия сахаров с аминокислотами. Примером является реакция Майара — многостадийный процесс, начинающийся с конденсации альдегидных групп моносахаров с аминогруппами лизина с образованием оснований Шиффа, которые затем превращаются в кетоамины (соединения Амадори). Окисление и конденсация соединений Амадори в конечном итоге приводят к образованию КПГ. Наиболее известными представителями КПГ являются пентозидин, образующийся при конденсации продуктов Амадори с аргинином, карбоксиметил- и карбоксиэтиллизин и производные метилглиоксаля. КПГ также могут формироваться в результате реакций окисления сахаров, липидов и аминокислот, приводящих к образованию альдегидов (например, малонового альдегида), способных ковалентно связываться со свободными аминогруппами различных аминокислот. Дальнейшие реакции окисления, циклизации и фрагментации приводят к образованию соединений, относящихся к КПГ. Таким образом, образование КПГ увеличивается в условиях окислительного и карбонильного стресса и гипергликемии [3, 4].

Важным источником экзогенных КПГ (так называемых гликотоксинов) является готовая пища. Высокотемпературная обработка пищевых продуктов, особенно жарение, приводит к образованию большого количества КПГ, которые способны абсорбироваться в кишечнике с последующей инкорпорацией в ткани. Экзогенные КПГ по химическому составу не отличаются от эндогенных, и их накопление в организме приводит к одинаковым последствиям [5]. Табакокурение также является источником экзогенных КПГ [5, 6].

Почки — главное место катаболизма КПГ. Они выводятся почками путем фильтрации и, возможно, секреции с последующим катаболизмом в канальцах [7]. При снижении функции почек происходит задержка КПГ в организме. При этом показано, что КПГ оказывают повреждающее действие на почки. Накопление КПГ в клетках мезангия ведет к увеличению продукции белков матрикса с одновременным снижением экспрессии металлопротеиназ, ответственных за деградацию матриксных протеинов [8]. КПГ увеличивают продукцию клетками эндотелия клубочка коллагена и фибронектина, стимулируют апоптоз подоцитов и уменьшают экспрессию нефрина [9]. В эксперименте внутривенное введение крысам КПГ, связанных с альбумином, вызывало гипертрофию клубочков, накопление в матриксе коллагена IV типа и утолщение базальной мембраны [10]. Таким образом, формируется порочный круг, что является характерным для патогенеза хронической болезни почек в целом.

Гемодиализ (ГД) снижает концентрацию циркулирующих КПГ лишь в незначительной степени [11]. Более эффективны в этом отношении конвекционные методы терапии, замещающей функцию почек (ЗПТ), и перитонеальный диализ (несмотря на повышенное интраперитонеальное образование КПГ) [12—16]. Трансплантация почки приводит к значительному снижению уровня КПГ в циркуляции [17]. При этом необходимо отметить, что негативные эффекты КПГ реализуются главным образом при повышении их содержания в тканях, а не в кровяном русле. Так, исследование гистологических препаратов дистальных артерий, полученных во время формирования артериовенозных фистул, показало четкую связь между содержанием в этих образцах КПГ и выраженностью кальцификации медии [18]. При этом, однако, не отмечено корреляции между уровнем циркулирующих КПГ и sRAGE и содержанием КПГ в стенке артерий. Не выявлено зависимости между уровнем КПГ в крови и смертности больных, находящихся на ГД [19, 20]. Единственным исключением является отмеченная прямая связь между повышенным в пределах нормы уровнем гликированного гемоглобина крови (относится к соединениям Амадори) и смертностью у больных без сахарного диабета (СД), получающих лечение хроническим ГД [21]. Более того, высокий уровень циркулирующих КПГ может быть следствием и косвенным свидетельством адекватности питания больного. Таким образом, для клинических целей в первую очередь необходимы методики, позволяющие определить содержание КПГ не в кровотоке, а в тканях. К таковым относится метод измерения интенсивности автофлюоресценции (АФ) кожи, предложенный недавно голландскими исследователями [22]. Метод основан на способности КПГ флюоресцировать под воздействием ультрафиолетового излучения и соответственно измерении интенсивности автофлюоресценции кожи. Несмотря на то что некоторые представители КПГ (карбоксиметил- и карбоксиэтиллизин, гидроимидазолоны) не обладают способностью к флюоресценции, данный метод продемонстрировал достоверную корреляцию между интенсивностью АФ кожи и содержанием КПГ в биоптатах кожи [4, 22]. Аналогичными возможностями обладает созданный в ПСПбГМУ им. И.П. Павлова спектрометр для флюоресцентно-отражательных биомедицинских исследований [23]. Данное исследование посвящено начальной оценке возможностей применения этой методики у больных, получающих лечение хроническим ГД.

В исследовании приняли участие 76 больных (39 мужчин и 37 женщин), получавших лечение в отделении хронического гемодиализа ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова и находившихся в стабильном состоянии. У всех больных получено информированное согласие на проведение исследования.

Средний возраст больных составил 53 года (от 20 до 88 лет), длительность гемодиализного лечения в среднем 83 мес (от 6 до 369 мес). Все больные получали сеансы ГД 3 раза в неделю; продолжительность сеанса составляла от 3,5 до 4,5 ч. Показатель Kt/V в среднем достигал 1,33±0,29. Причиной развития терминальной стадии почечной недостаточности явились у 24 больных гломерулонефриты, у 16 интерстициальные поражения почек, у 10 гипертонический нефроангиосклероз, у 10 системные васкулиты, у 9 поликистозная болезнь и у 7 С.Д. Индекс массы тела составил в среднем 25,2±5,8 кг/м². Диагноз ишемической болезни сердца (ИБС) установлен у 46 (60,5%) из 76 больных. Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) или блокаторы рецепторов ангиотензина (БРА) во время исследования и в течение 3 мес до него постоянно получали 45 (59%) больных, статины — 44 (58%), альфакальцидол — 47 (62%), пероральные препараты витаминов группы В (пентовит, нейромультивит) — 34 (45%), севеламер — 14 (18%).

Лабораторно-биохимические показатели крови (гемоглобин, альбумин, общий белок, общий кальций, неорганический фосфат, кальций-фосфорное произведение, креатинин, мочевина, трансаминазы, гаммаглутамилтранспептидаза, щелочная фосфатаза, общий холестерин, триглицериды, мочевая кислота, паратгормон, ферритин, С-реактивный белок) определены в течение 2 нед перед измерением интенсивности АФ кожи.

АФ кожи измеряли во время сеанса ГД. В отличие от зарубежного аналога отечественный прибор оснащен оптоволоконным датчиком, что повышает удобство и расширяет возможности его применения. Измерение сигнала флюоресценции проводится при возбуждении на длине волны 365 нм и регистрации в области 460±10 нм. Прибор подключается к персональному компьютеру через USB-порт и использует оригинальное программное обеспечение.

У каждого пациента выполняли 5 измерений интенсивности АФ кожи в области внутренней поверхности предплечья руки, «свободной» от артериовенозной фистулы, с последующим автоматическим расчетом среднего значения. Калибровку прибора проводили ежедневно перед каждым циклом измерений с помощью флюоресцентного стандарта USFS-200 («Labsphere Inc.», США). Интенсивность А.Ф. кожи измеряли в условных единицах, приняв за единицу интенсивность АФ нормы при «нулевом» возрасте (определен путем экстраполяции возрастного тренда в контрольной группе; рис. 1). Контрольная группа состояла из 40 практически здоровых (по самооценке участников) лиц в возрасте от 7 до 80 лет. У некоторых из них измерения проводили неоднократно с большими (до полугода) интервалами времени; всего проведено 69 измерений.

Математическую обработку данных выполняли с использованием лицензионного пакета программ StatSoft Statistica v. 6.0. Применяли стандартные методы дескриптивной статистики. Критический уровень статистической значимости принят равным 0,05. В зависимости от характера распределения данных сравнение количественных показателей в группах проводили с использованием парного критерия t Стьюдента либо непараметрического коэффициента корреляции Спирмена.

Опыт использования показал простоту и удобство применения прибора. Продолжительность исследования (10 измерений) занимала около 1 мин у каждого больного. Негативных последствий (раздражение, повышенная чувствительность кожи в месте измерения и т. д.) не отмечено ни у одного из участников исследования.

В среднем интенсивность АФ кожи у больных, находящихся на ГД, составила 3,09±0,78 усл. ед., что достоверно (р<0,001) выше, чем в контрольной группе (1,60±0,39 усл. ед.; см. рис. 1).

Наиболее четкую (R=0,55; p<0,001) корреляцию интенсивность АФ продемонстрировала с продолжительностью лечения ГД (рис. 2, а).

Интенсивность АФ кожи также прямо коррелировала с возрастом больного: R=0,28; p=0,014 (см. рис. 1). При этом в группе пациентов в возрасте от 20 до 40 лет среднее значение данного показателя (2,45±0,33 усл. ед.) оказалось достоверно (p<0,01) выше, чем у лиц старшего возраста (60—80 лет) из контрольной группы (1,93±0,59 усл. ед.). Это свидетельствует, что дисфункция почек является более важным, чем возраст, фактором накопления КПГ.

У больных, страдающих ИБС, интенсивность АФ оказалась существенно (R=0,39; p<0,001) выше, чем у больных без данного диагноза (см. рис. 2, б). Обнаружена прямая корреляция (R=0,30; р<0,01) интенсивности АФ с индексом коморбидности Чарлсона (ИКЧ) у больных, находящихся на ГД (см. рис. 2, в).

Выявлена прямая зависимость (R=0,25; p=0,028) интенсивности АФ кожи от показателя интенсивности диализного лечения Kt/V. При этом Kt/V напрямую зависел от продолжительности лечения ГД: R=0,32; p=0,005.

Интенсивность АФ кожи оказалась достоверно более низкой у 10 больных с диагнозом системного васкулита: 2,55±0,43 усл. ед. против 3,17±0,79 усл. ед. у остальных 66 пациентов (р=0,025). По всей видимости, это связано с тем, что пациенты с данным диагнозом имели достоверно меньшую продолжительность диализного лечения (в среднем 56,9 мес против 87,3 мес у остальных больных; р<0,001) и были более молодыми (средний возраст 47,3 года против 54,2 года у остальной группы). У 7 больных СД интенсивность АФ кожи была также сравнительно невысокой (2,82±0,57 усл. ед.), но при сравнении с остальной группой различие оказалось недостоверным. Достоверных различий между группами больных с прочими диагнозами также не обнаружено.

Не выявлено корреляций интенсивности АФ с основными обычно определяемыми у пациентов отделения ГД лабораторными показателями крови, а также корреляций интенсивности АФ с ростом, массой тела и индексом массы тела пациентов.

Прием лекарственных препаратов (ингибиторы АПФ, БРА, статины, витамины группы В, альфакальцидол, севеламер) существенно не влиял на интенсивность АФ кожи.

Полученные результаты совпадают с данными зарубежных исследователей о том, что наиболее значимыми факторами, определяющими содержание КПГ в тканях, являются возраст и дисфункция почек. Объяснение является достаточно очевидным — с возрастом происходит накопление биохимически инертных КПГ, которое увеличивается при снижении их экскреции почками и катаболизма. Этот факт наводит, однако, на важные дополнительные соображения. О близости патогенетических звеньев старения и уремического состояния стали говорить еще в конце прошлого века [24]. C 1974 г. существует понятие ускоренного атеросклероза у больных, находящихся на хроническом ГД [25]. К настоящему времени сформирована более широкая концепция так называемого ускоренного старения больных, получающих ЗПТ [26]. Ретенция КПГ в тканях является одним из общих для старения и дисфункции почек патофизиологических звеньев.

КПГ, как эндогенные, так и экзогенные, способны взаимодействовать с белками, в том числе с коллагеном, что приводит к нарушению пространственной структуры и функции белковых молекул [27, 28]. Образование перекрестных связей между молекулами эластина и коллагена способствует развитию уплотнения стенок крупных артерий [29, 30]. Показана прямая зависимость прогрессирования уплотнения сосудистой стенки с содержанием пентозидина в крови независимо от возраста, наличия СД и атеросклероза [31]. Под влиянием КПГ происходит также изменение фенотипа гладких мышечных клеток сосудов с образованием остеобластоподобных клеток, что создает условия для кальцификации медии [32, 33].

Предполагается также участие КПГ в процессах развития остеопатии. Кость содержит большое количество долгоживущих, метаболически инертных белков, таких как коллаген I типа, и таким образом, предрасположена к накоплению дефектных протеинов, модифицированных КПГ [34, 35].

КПГ активируют провоспалительные и прооксидативные сигнальные пути в клетках путем влияния на специфические рецепторы КПГ (RAGE) или Toll-подобные рецепторы (TLR) 2-го и 4-го типов [36]. RAGE экспрессированы на поверхности мембраны многих типов клеток, в том числе эндотелиоцитов, гладких мышечных клеток сосудов и кардиомиоцитов [37, 38]. Стимуляция этих рецепторов приводит к повышению продукции медиаторов воспаления, что создает условия для генерации эндогенных КПГ [39, 40]. Экстрацеллюлярный белок, связывающий RAGE (EN-RAGE или S100A12), также является провоспалительным лигандом для КПГ [39]. Предполагается, что EN-RAGE участвует в формировании ускоренного атеросклероза у больных, находящихся на ГД [39, 41]. Напротив, так называемый растворимый рецептор КПГ (sRAGE) конкурентно связывает КПГ, уменьшая тем самым их провоспалительный эффект [42, 43].

Сигнальный каскад, опосредованный RAGE, может быть инициирован не только КПГ, но и β-амилоидным белком [34, 44, 45]. Этот каскад включает активацию пути ядерного фактора каппа-В и протеинкиназ, активируемых митогенами, что приводит к индукции НАДФ-оксидаз, увеличению продукции активных форм кислорода и экспрессии молекул адгезии, т. е. к активации воспаления и повреждения тканей [34, 46]. Тем самым замыкается порочный круг: окислительный и воспалительный стрессы стимулируют образование КПГ, которые в свою очередь играют важную роль в формировании окислительного стресса и хронического субклинического воспаления. Назначение диеты с уменьшенным на 50% содержанием КПГ больным с хронической болезнью почек III стадии привело через 4 мес к достоверному снижению уровня маркеров окислительного и воспалительного стресса [47]. У больных, получающих лечение перитонеальным диализом, применение аналогичной диеты привело к значительному снижению уровня циркулирующих КПГ и высокочувствительного С-реактивного белка [5, 48].

Таким образом, задержка КПГ в тканях тесно связана с общими для старения и уремии клиническими проявлениями: атеросклерозом и кальцификацией сосудистой стенки, остеопатией, а также (учитывая взаимосвязь окислительного и воспалительного стрессов и накопления КПГ), можно предполагать, и с развитием саркопении, когнитивных и неврологических нарушений, снижением иммунного ответа и повышением риска развития инфекционных заболеваний [49].

Отчетливо прослеживается связь КПГ и дисфункции митохондрий, развитие которой в настоящее время считают одним из основных механизмов старения [50]. T. Nishikawa и соавт. [51] продемонстрировали, что снижение продукции митохондриями активных форм кислорода, достигаемое несколькими различными способами (ингибиция 2-го комплекса дыхательной цепи, применение разобщителей окислительного фосфорилирования, активация разобщающего протеина 1-го типа, активация марганцевой супероксиддисмутазы) предотвращало формирование КПГ. В эксперименте обработка кардиомиоцитов карбоксиметиллизином приводила к значительному нарушению процесса дыхания на митохондриях [52]. Таким образом, по аналогии с предложенным в 2003 г. термином «inflammaging» [53], отражающим важную роль хронического воспаления в формировании возрастных изменений, можно ввести в обращение понятие «accelerated AGEing», подчеркивающее значение КПГ в этом процессе.

Отсутствие зависимости АФ кожи от характера основного заболевания, включая СД, неоднократно продемонстрировано ранее [4, 35, 54]. Показана корреляция уровня КПГ с содержанием в крови гликированного гемоглобина, однако гипергликемия является важной, но не единственной причиной образования КПГ. У больных, получающих лечение хроническим ГД, на содержание КПГ в тканях помимо продолжительности ЗПТ и возраста, наибольшее влияние, вероятно, оказывает интенсивность окислительного стресса [3]. Отсутствие контроля маркеров окислительного стресса явилось серьезным ограничением данного исследования. Другим ограничением является отсутствие анализа диеты больных, существенным образом влияющей на уровень КПГ в организме. Возможно, что обнаруженная прямая зависимость АФ кожи от показателя Kt/V объясняется именно диетологическими факторами: значение Kt/V определяется главным образом степенью снижения содержания мочевины в крови за время сеанса ГД, т. е. существенно зависит от преддиализного уровня мочевины в крови, который в свою очередь повышается при высокой пищевой нагрузке. В отсутствие специальных диетологических ограничений хорошее питание приводит к активному потреблению КПГ с пищей. В то же время в обследованной группе показатель Kt/V оказался в прямой зависимости от продолжительности диализного лечения. Хорошо известно, что обеспечение высоких значений Kt/V является необходимым условием длительной выживаемости больных, получающих ЗПТ.

ИКЧ в значительной степени зависит от возраста больного, поэтому корреляция ИКЧ с интенсивностью АФ явилась ожидаемым результатом. ИКЧ имеет наивысшую по сравнению с другими расчетными индексами прогностическую ценность при анализе выживаемости пациентов, находящихся на лечении хроническим ГД [55]. Данные ряда исследований свидетельствуют, что интенсивность АФ кожи также является достоверным и независимым предиктором общей и сердечно-сосудистой смертности у больных, находящихся на ГД [4, 56, 57]. Убедительная корреляция интенсивности АФ кожи и ИКЧ служит дополнительным доказательством этого.

В источниках литературы имеются указания на то, что интенсивность АФ кожи коррелирует с рядом биохимических показателей крови у больных, находящихся на ГД: триглицериды [4], гемоглобин, общий холестерин, кальций-фосфорное произведение [58]. В нашем исследовании не обнаружено достоверных корреляций интенсивности АФ ни с одним из обычно определяемых у таких больных биохимических параметров, что могло явиться результатом недостаточной статистической мощности исследования. Возможно, по этой же причине не выявлено связи между медикаментозной терапией у больных и интенсивностью АФ. В то же время в литературе описано влияние лекарственных препаратов (ингибиторы АПФ, БРА, севеламер, бенфотиамин, кальцитриол) главным образом на уровень циркулирующих КПГ, но не на содержание КПГ в тканях [4, 38, 59—62]. Кроме того, чтобы лекарственный препарат оказал клинически значимое влияние на концентрацию КПГ в коже, продолжительность его приема должна быть достаточно велика. Мы же учитывали прием препаратов только в течение последних 3 мес перед исследованием.

Содержание КПГ в тканях может служить кумулятивным показателем метаболического стресса у больных, находящихся на ГД, поскольку накопление КПГ является результатом воздействия целого ряда метаболических нарушений (окислительный, карбонильный, воспалительный стресс, гипергликемия). Неинвазивный, удобный и малозатратный метод определения КПГ путем измерения АФ кожи может быть использован для оценки прогноза у больных, получающих лечение хроническим ГД, что нуждается в подтверждении в дальнейших исследованиях.

Конфликт интересов отсутствует.