АЧТВ — активированное частичное тромбопластиновое время

ВВЛ — вшиная возвратная лихорадка

ДВС — диссеминированное внутрисосудистое свертывание

ДИ — доверительный интервал

ИКБ — иксодовый клещевой боррелиоз

ИФА — иммуноферментный анализ

КВЛ — клещевые возвратные лихорадки

КВЭ — клещевой вирусный энцефалит

КИ — конъюнктивальный индекс

КИ-1−2-3 — сумма 3 КИ

ЛБ — лаймская болезнь

МЦК — микроциркуляция крови

ПВ — протромбиновое время

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ — ПЦР в реальном времени

ТВ — тромбиновое время

В 1995 г. в Японии обнаружили в клещах Ixodes persulcatus и в органах полевой мыши Apodemus argenteus новый вид боррелий Borrelia miyamotoi [1]. В дальнейшем показано широкое распространение этого вида в регионах умеренного климата Евразии и Северной Америки, где он переносится теми же клещами рода Ixodes, что боррелии группы Borrelia burgdorferi sensu lato — возбудители лаймской болезни (ЛБ) [2—4]. В 2003 г. в Ижевске ДНК B. miyamotoi впервые обнаружена сотрудниками ЦНИИ эпидемиологии в крови больных, госпитализированных с подозрением на иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) в безэритемной форме [5]. В настоящее время выявление случаев ИКБ, вызванного B. miyamotoi, изучение их клинико-эпидемиологических особенностей активно проводится в России [6—8], начато в США, Европе и Японии [2, 3, 9—12].

B. miyamotoi генетически ближе к боррелиям — возбудителям клещевых возвратных лихорадок (КВЛ), т. е. к B. persica, B. hispanica, B. hermsii и др., а также к B. recurrentis — возбудителю вшиной^​*​ возвратной лихорадки (ВВЛ) [2—4, 13]. Для этих заболеваний характерна высочайшая концентрация возбудителя в крови, превышающая в ряде случаев 10⁸/мл [14—17]. При этом вокруг спирохет могут формироваться микроагрегаты из эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, что вызывает локальные динамические расстройства микроциркуляции крови (МЦК) и последующие органные нарушения [18, 19]. Для боррелиозных КВЛ и ВВЛ типичны тромбоцитопения и изменения в системе свертывания крови, в тяжелых случаях приобретающие характер острого синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) [14—17, 20, 21].

Рассуждая по аналогии, можно предположить, что клинико-патогенетические особенности ранее неизвестного заболевания, вызываемого B. miyamotoi, также хотя бы отчасти связаны с состоянием системы гемостаза.

Цель работы: выяснить состояние системы свертывания и МЦК при ИКБ, вызванном B. miyamotoi.

В основу работы положены данные проспективного исследования с участием 28 больных ИКБ, вызванным B. miyamotoi, которые находились на стационарном лечении в Республиканской инфекционной клинической больнице Ижевска в мае-июле 2010 г.

Критериями включения в исследуемую группу «ИКБ, вызванный B. miyamotoi», являлись присасывание иксодового клеща в срок до 1 мес перед появлением клинических симптомов; повышение температуры тела более 38 °C; длительность болезни при поступлении не более 1 нед; выявление в лейкоцитарной взвеси крови больного в 1—2-й день госпитализации ДНК B. miyamotoi методом полимеразной цепной реакции ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) и отсутствие ДНК B. burgdorferi sensu lato; исключение клещевого вирусного энцефалита (КВЭ), анаплазмоза, эрлихиоза (использованы методики ПЦР и иммуноферментного анализа — ИФА).

В качестве группы сравнения обследовали 24 больных эритемной локализованной формой ИКБ, вызываемой, по современным представлениям, B. burgdorferi sensu lato [2—4]. У 17 из них при лечении в стационаре выявлены антитела класса IgM к B. burgdorferi sensu lato и/или сероконверсия по специфическим антителам класса IgG, еще у 2 обнаружена ДНК B. burgdorferi sensu lato в крови.

Сравниваемые группы сопоставимы по полу (82% мужчин и 63% мужчин в исследуемой группе и группе сравнения соответственно) и возрасту (медиана 46 лет, диапазон от 21 года до 74 лет и медиана 56 лет, диапазон от 27 до 76 лет в исследуемой группе и группе сравнения соответственно). По совокупности клинических и лабораторных проявлений все рассматриваемые случаи ИКБ классифицированы как заболевание средней степени тяжести.

Для молекулярно-генетической идентификации возбудителя использовали методики ПЦР-РВ с гибридизационно-флюоресцентной детекцией, разработанные сотрудниками ЦНИИ эпидемиологии: коммерческую тест-систему АмплиСенс TBEV, B. burgdorferi sl, A. phagocytophillum, E. chaffeensis/E. muris-FL и лабораторную методику детекции РНК/ДНК B. miyamotoi [6]. Для выделения нуклеиновых кислот из лейкоцитарной взвеси крови применяли набор Рибо-преп; реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора Reverta-L (АмплиСенс). Амплификацию и детекцию осуществляли на приборе ДТ-96 («ДНК-технологии», Москва). Мишенью для амплификации при обнаружении B. burgdorferi sensu lato, B. miyamotoi, E. muris и E. chaffeensis являлась 16S РНК, A. phagocytophillum — ген msp2, ВКЭ — ген С.

Для выявления антител класса М и G к возбудителям ИКБ использовали иммуноферментные тест-системы производства ООО «Омникс» (Санкт-Петербург).

Наряду со стандартным общеклиническим и биохимическим обследованием проводили оценку плазменного звена гемостаза (измерение активированного частичного тромбопластинового времени — АЧТВ, протромбинового времени — ПВ, тромбинового времени — ТВ, уровня фибриногена и антитромбина III) и изучение состояния фибринолитической системы (зависимая от XIIa-фактора фибринолитическая активность плазмы, уровень плазминогена) с использованием реагентов ООО «Технология-Стандарт»); определение D-димеров с помощью набора реагентов РеД-Димер-тест производства «НПО Ренам»; биомикроскопия конъюнктивы глаза с помощью щелевой лампы ЩО-01 [21—23].

Количественную оценку нарушений МЦК осуществляли при помощи конъюнктивальных индексов (КИ), перечисленных в табл. 1, с последующим суммированием оценки в баллах [23, 24]. КИ-1 — внесосудистые изменения (периваскулярный отек, пигментация, геморрагии), КИ-2 — сосудистые изменения (состояние венул, артериол, капилляров, артериовенозное соотношение, наличие сосудистых клубочков), КИ-3 — внутрисосудистые изменения (замедление МЦК, сладж, остановка кровотока по венулам, артериолам, капиллярам). Значения КИ-1 могли варьировать от 0 (полное отсутствие патологических изменений) до 6 (множественные распространенные внесосудистые изменения). Значения КИ-3, учитывающего по 3 типа изменений для 3 типов сосудов, теоретически могут достигать 18, а значения КИ-2, учитывающего 12 показателей, — 24 баллов. Однако, поскольку учитываемые варианты патологических изменений сосудов взаимоисключают друг друга, реально КИ-2 принимает значения не выше 10, а КИ-3 — не выше 6. Как обобщенный показатель рассчитывалась сумма 3 КИ (КИ-1−2-3).

Эпидемиологические и клинико-лабораторные данные сохраняли в базе данных ACCESS. Для статистического анализа использовали лицензионную программу IBM SPSS Statistics 19 [25]; уровень значимости различия между группами определяли с помощью непараметрического критерия Манна—Уитни (для количественных переменных) и точного критерия Фишера (для качественных переменных) [26].

Клиническая картина заболевания у 28 больных в целом подобна заболеванию у большей группы пациентов с ИКБ, вызванным B. miyamotoi (78 пациентов), описанной ранее в деталях [6—8, 27]. У всех больных наблюдалась лихорадка (температура тела 39±0,4 °С), слабость, головная боль, озноб, потливость, отсутствовала мигрирующая эритема. Кроме собственно лихорадочного синдрома у большинства из 28 пациентов наблюдались преходящие проявления той или иной органной патологии: гепатит у 18%, нефрит у 14%, миокардит у 14%, менингеальн ые симптомы у 14%, патологии дыхательной системы у 7%, желудочно-кишечного тракта у 7%; только у 25% больных наблюдалась лихорадочная форма без осложнений.

Исследование системы свертывания крови. Тромбоцитопения менее 150·10⁹/л, наблюдалась у 43% больных ИКБ (табл. 2), вызванным B. miyamotoi, уровень тромбоцитов в этой группе колебался от 79 до 134·10⁹/л, причем у 10% больных количество тромбоцитов составляло менее 100·10⁹/л. Несмотря на существенное снижение количества тромбоцитов, ломкость капилляров в клинико-функциональной пробе Кончаловского практически не менялась, весьма редко наблюдались и другие клинические признаки геморрагического синдрома — носовые кровотечения, петехиальная сыпь.

Изменения в коагуляционном звене гемостаза характеризовались укорочением АЧТВ у 54% больных. Значительное уменьшение уровня антитромбина III выявлено у 50% больных.

ПВ выходило за границы нормы в сторону уменьшения у 10 больных, в сторону увеличения — у 5. Тенденции изменения ТВ также оказались разнонаправлены: у 7 больных уменьшение, у 5 увеличение.

Фибринолитическая активность плазмы снижена у 24%; D-димеры выявлены в крови у 43% больных. При этом содержание фибриногена в плазме было выше нормы, а уровень плазминогена — несколько ниже, но эти показатели статистически значимо не отличаются от практически нормальных величин этих показателей в группе сравнения.

В целом все 8 показателей, характеризующих состояние системы свертывания (см. табл. 2), у 71% больных в остром периоде локализованной эритемной формой ИКБ, вызванного B. burgdorferi sensu lato, находятся в пределах нормы. В остальных случаях выходят за границы нормы не более 1—2 показателей. Напротив, у каждого из пациентов с безэритемной формой ИКБ, вызванного B. miyamotoi, есть хотя бы 1 анормальный показатель, а у 64% больных 3 показателя и более выходят за границы нормы (в сторону гиперкоагуляции, а иногда и в сторону гипокоагуляции).

Исследование МЦК. Небольшое число участвовавших в исследовании больных не позволяет детально рассматривать каждое из нарушений сосудистой системы конъюнктивы, выявленных путем биомикроскопии глаза на щелевой лампе. Количественно нарушения МЦК целесообразно оценивать на основе обобщающих К.И. При заболевании, вызванном B. miyamotoi, преобладали внутрисосудистые изменения (среднее КИ-3=1,9 при 95% доверительном интервале — ДИ от 1,4 до 2,3), характеризующиеся сладж-феноменом, у 4 человек наблюдались участки с полной остановкой венулярного кровотока и формированием эритроцитарных агрегатов. Из сосудистых изменений (КИ-2=1,8 при 95% ДИ от 1,4 до 2,3), отметим увеличение числа действующих капилляров (у 12 человек), появление участков с сетчатой структурой капилляров, извитость сосудов (чаще венул), уменьшение артериовенозного соотношения за счет увеличения диаметра вен. Внесосудистые изменения встречались реже (КИ-1=1,1 при 95% ДИ от 0,8 до 1,5) и включали периваскулярный отек, участки пигментации по ходу сосудов, единичные геморрагии.

В группе сравнения — ИКБ в эритемной локализованной форме — микроциркуляторные изменения встречались существенно реже (КИ-1=0,3, КИ-3=0,2); преобладали сосудистые изменения (КИ-2=0,8 при 95% ДИ от 0,4 до 1,2), в частности снижение артериовенозного соотношения за счет спазма артерий.

В итоге основным результатом данного раздела исследования является превышением в 5 раз суммарного КИ-1−2-3 при ИКБ, вызванном B. miyamotoi, в сравнении с аналогичным показателем при ЛБ (см. табл. 2).

Две обобщающие величины — КИ-1−2-3 и число аномальных показателей системы гемостаза из 8 основных изученных показателей (сумма-8) отражают взаимодействующие, но различные элементы единой системы кровообращения. Тем не менее при ИКБ их патологические изменения (см. рисунок) достаточно хорошо коррелируют (коэффициент Спирмена 0,64 при 95% ДИ от 0,46 до 0,77; p<0,01). В группе наибольшего риска оказываются 14 (50%) больных с ИКБ, вызванным B. miyamotoi, у которых и показатели КИ-1−2-3, и показатели суммы-8 выходят за границы условной нормы (точки в верхнем правом квадранте на рисунке). Действительно, по клиническим наблюдениям у 79% пациентов из этой группы наблюдается та или иная органная патология: нефрит у 4, миокардит у 3, гепатит у 2, менингизм у 1, пневмония у 1. Напротив, среди 26 пациентов вне зоны риска (точки в нижнем левом квадранте на рисунке) отмечены только по одному случаю гепатита и пневмонии. Ассоциация факторов риска и осложнений статистически достоверна (р=0,00002).

Выявленные у больных ИКБ, вызванным B. miyamotoi, достоверные нарушения характеризуют разные стороны и фазы процесса свертывания: тромбоцитарное звено; эффективность «внутреннего» (контактно активируемого) пути и внешнего путей свертывания — АЧТВ и ПВ соответственно; ингибирование свертывания естественным антикоагулянтом — антитромбином III (из семейства серпинов, ингибитор сериновых протеиназ); фазу тромбинообразования, т. е. общее звено путей свертывания — ПВ; заключительную фазу свертывания (образование фибрина) — ТВ; уровень фибринолитической активности — зависимый от XIIa-фактора фибринолиз; образование перекрестно-сшитого фибрина и последующий его лизис — появление D-димеров.

При инфекционной патологии наиболее тяжелым осложнением системы свертывания является синдром ДВС. По современным представлениям в развитии коагулопатии можно выделить 3 фазы: гиперкоагуляционный синдром или «неявное ДВС», гиперкоагуляционная фаза острого синдрома ДВС и гипокоагуляционная фаза острого синдрома ДВС [21, 28]. Кратко описывая эти состояния, следует отметить, что при гиперкоагуляционном синдроме отсутствует масштабное тромбообразование, но резко повышена его опасность и снижена фибринолитическая активность. Гиперкоагуляционная фаза характеризуется образованием множественных сгустков фибрина и тотальными стазами. В результате исчерпываются ключевые факторы свертывания и тромбоциты и наблюдается переход к гипокоагуляционной фазе с выраженными признаками диффузной кровоточивости и полиорганной патологией, вызываемой как образовавшимися тромбами, так и многочисленными геморрагиями. Акад. А.И. Воробьев жестко формулирует: «полиорганная патология есть специфика ДВС и вне синдрома ДВС она не существует» [21].

Как в этом контексте следует трактовать наши наблюдения? (см. табл. 2, рисунок). Снижение уровня антитромбина III увеличивает риск развития тромбозов, так как снижает порог свертывания, и может служить ранним лабораторным признаком острого синдрома ДВС. Снижение фибринолитической активности на фоне появления D-димеров также типично для ДВС и/или тромбозов. Укорачивание П.В. и ТВ соответствует гиперкоагуляции (начальная фаза синдрома ДВС), удлинение — гипокоагуляции (истощение факторов свертывания) [21, 22, 28, 29]. Существенно, что тест на ПВ проводится в условиях предельно высокой искусственной активации свертывания, т. е. отражает максимальный уровень, возможный в конкретном образце плазмы, и нацелен на фиксацию гипокоагуляции в условиях истощения факторов. Наблюдаемое укорачивание ПВ, видимо, отражает воспалительный процесс при инфекции, когда происходит увеличение концентраций ряда факторов свертывания, которые являются белками острой фазы. Укорачиванию АЧТВ ранее не придавали клинического значения, но в последнее десятилетие стало ясно, что активация контактного пути также увеличивает риск образования микро- и макротромбов, а ингибирование факторов XII и XI снижает этот риск, не затрагивая функцию системы свертывания в целом [21, 30, 31]. Таким образом, наблюдаемые изменения показателей у большинства больных соответствуют гиперкоагуляционному синдрому или слабовыраженной гиперкоагуляционной фазе острого синдрома ДВС, хотя приблизительно у 20% больных ИКБ, вызванным B. miyamotoi, отмечаются признаки гипокоагуляции. Однако даже при тромбоцитопении и/или удлинении ПВ и ТВ на фоне сниженной концентрации фибриногена у больных отсутствуют внесосудистые микроциркуляторные изменения, геморрагическая сыпь, выраженные кровотечения и кровоизлияния, что отличает этот боррелиоз от ранее известных КВЛ и, особенно, ВВЛ.

Учитывая соответствие изменений конъюнктивы состоянию микроциркуляторного русла во всем организме [23, 24], можно предположить, что именно они являются патогенетической основой не слишком тяжелых и преходящих органных нарушений при ИКБ, вызванном B. miyamotoi [7, 8, 27, 32, 33]. Возможно, при этом все же образуются микротромбы, нарушается проходимость и увеличивается проницаемость капилляров, венул и артериол. Следует отметить, что имеет место своеобразная «избирательная полиорганная недостаточность»: у отдельных больных наблюдаются признаки дисфункции лишь 1—2 органов, но в группе больных в целом можно найти поражения разнообразных органов. Сами же внутрисосудистые и сосудистые нарушения могут быть вызваны комплексом причин: непосредственно воспалительным процессом при инфекции (прямым действием пирогенов, цитокинов и других медиаторов воспаления), спровоцированным воспалением изменениями в системе свертывания [34, 35] и, наконец, взаимодействием боррелий с тромбоцитами, эритроцитами, лейкоцитами и белками плазмы крови [18, 19, 36—40].

Инфекция B. hermsii вызывает тромбоцитопению у мышей, совпадающую с каждым из приступов спирохетемии; при этом количество тромбоцитов снижается более чем в 10 раз, а время кровотечения соответственно удлиняется [19]. Комплексы тромбоцитов с боррелиями выводятся из кровотока, что может иметь как патологическое значение, способствующее диссеминации и выживанию бактерий, так и, напротив, антибактериальное, поскольку тромбоциты способны секретировать антимикробные агенты, а также привлекать нейтрофилов [36]. Взаимодействие клеток моноцитарно-макрофагального ряда с B. hermsii вызывает выделение ими пирогенов и тромбопластина [37]. Ряд возбудителей КВЛ, в частности B. crocidurae и B. duttonii, вызывают розеткообразование эритроцитов. Эти агрегаты, включающие в физиологических условиях также лейкоциты, закупоривают артериолы, а затем венулы, вызывая повреждение почек, легких и других органов [18, 38]. На модели МЦК в яичках крыс показано, что рядом с микроэмболами, включающими боррелии, возникают интерстициальные геморрагии, наблюдается гибель тканевых клеток. В случае прекращения спирохетемии, микроэмболы постепенно рассасываются и кровоток нормализуется [39]. Боррелии, в частности B. turicatae, способны также связываться с эндотелиальными клетками, включая эндотелий капилляров головного мозга, и проникать в окружающие ткани [40], провоцируя в них патологические изменения.

Известно, что боррелии, в том числе B. miyamotoi, не синтезируют эндо- или экзотоксины, поэтому в основе патогенеза ИКБ, вызванного B. miyamotoi, должны лежать иные механизмы [2—4, 15—17]. Возможно, что явления, описанные для возбудителей КВЛ, которых переносят клещи рода Ornithodoros, развиваются также при инфекции B. miyamotoi и обусловливают наблюдаемые нарушения в системах свертывания и МЦК. Поскольку бактериальная нагрузка в крови при инфекции B. miyamotoi, видимо, ниже, чем при КВЛ и ВВЛ [10], в большинстве случаев проявления органных патологий менее выражены и обратимы.

Благодарности

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15−15−00072). Авторы признательны медицинскому персоналу Республиканской инфекционной клинической больницы Удмуртской Республики за помощь в проведении исследования.